Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Verbesserung des Erfolgs des Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsnachweises bei Knochenmarkabstrichen von Patienten mit multiplem Myelom vor.
Abstract
Der Nachweis der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine unverzichtbare Methode bei der genetischen Risikostratifizierung beim multiplen Myelom (MM), einem der häufigsten hämatologischen Malignome. Das identifizierende Merkmal von MM sind angesammelte bösartige Plasmazellen im Knochenmark. FISH-Berichte für MM konzentrieren sich hauptsächlich auf gereinigte oder identifizierte klonale Plasmazellen und nicht auf alle kernhaltigen Zellen, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ oder λ markiert werden. Knochenmark-Interphasenkerne werden in der Regel aus frischen Knochenmarkzellen gewonnen. Eine zufriedenstellende Anreicherung von Plasmazellproben erfordert jedoch große Mengen an frischem Heparin-antikoaguliertem Knochenmark, das bei schwieriger Knochenmarkextraktion oder einem trockenen Knochenmarkhahn nicht erhalten werden kann. Hierin etablieren wir eine neuartige Methode, um den Erfolg des FISH-Nachweises auf gefärbten oder ungefärbten Knochenmarkabstrichen zu verbessern. Knochenmarkabstriche sind leichter zu erhalten als antikoagulierte Knochenmarkproben.
Introduction
Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne Plasmazellerkrankung (PC) mit starker biologischer Heterogenität und großen individuellen Unterschieden in der klinischen Wirksamkeit, mit Überlebenszeiten von Monaten bis Jahrzehnten. Zytogenetische Merkmale sind wichtige prognostische Indikatoren für MM. Das Risikostratifizierungssystem und individualisierte Behandlungen, die auf genetischen Merkmalen basieren, sind zu Themen von intensivem Interesse in der klinischen Forschung zu MM1 geworden. Zu den Aberrationen von PCs, die in einem Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungspanel (FISH) aus Knochenmark (BM) getestet wurden, gehören del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) Verstärkung/Verstärkung und 1p (CDKN2C) Deletion.
Die Standard-Metaphasenzytogenetik sollte in die Erstbeurteilung von MM-Patienten einbezogen werden. Obwohl die konventionelle G-Band-Karyotypisierung den Vorteil einer Ganzchromosomenanalyse bietet, führt die geringe Ausbeute dieser Methode zu vielen falsch negativen Ergebnissen2. Traditionell wurden PCs als weitgehend unfähig zur Spaltung angesehen, da sie die Endprodukte der B-Lymphozyten-Differenzierung sind. Dies macht es schwierig, geteilte Bilder zu erhalten. Eine verbesserte zytogenetische Analyse in MM mit Langzeitkulturen (6 Tage) und die Stimulation von Kulturen durch Zytokine können eine vielversprechende Methode zur Identifizierung zytogenetischer Anomalien bei neu diagnostizierten MM-Patienten sein3. Selbst wenn die Kulturzeit auf 6 Tage verlängert wurde, wurden zytogenetische Anomalien bei 30%-50% der MM-Patienten genau berichtet4. Darüber hinaus zeichnet sich MM durch komplexe zytogenetische Aberrationen aus, die seine prognostische Heterogenität widerspiegeln. Die Auflösung der traditionellen Chromosomenbanding-Technologie ist jedoch gering, was leicht zu einer verpassten Erkennung von Chromosomenanomalien in MM führen kann.
Interphase FISH, vorzugsweise nach CD138-positiver magnetischer Perlen-basierter PC-Sortierung oder Markierung mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ/λ, ist bei der Analyse von MM5,6 unverzichtbar. Für die optimierte Ausbeute an Tumorzellen wird dringend eine CD138-positive ausgewählte Probe empfohlen. Die genaue Quantifizierung zytogenetischer Aberrationen erfordert jedoch mindestens 4 ml antikoaguliertes BM für die PC-Sortierung. Darüber hinaus erhöhen die Kombinationen von entweder CD138-Immunmagnetperlensortierung mit FISH oder zytoplasmatischem κ/λ-Leichtketten-Immunglobulin mit FISH-Test (cIg-FISH) zahlreiche experimentelle Kosten und sind zeitaufwendig.
In der Regel wird das PC-Verhältnis zunächst aus der morphologischen Untersuchung von gefärbten BM-Abstrichen oder BM-Biopsieabschnitten beurteilt7,8. BM-Proben von höchster Qualität (erste Markaspiratproben) werden für morphologische Tests verwendet, während diejenigen, die zum FISH- oder anderen Nachweis geschickt werden, oft die sekundären Aspiratproben mit hohen Verdünnungsverhältnissen mit peripherem Blut sind.
Bereits in den 1990er Jahren zeigten mehrere Studien, dass BM-Abstriche direkt für interstitielle FISH-Untersuchungen verwendet werden können, was sich als zuverlässige und wiederholbare Methode erwiesen hat9. Eine elegante Studie, die auf Zellmorphologie und Esterasezytochemie in Kombination mit FISH aus peripherem Blut und BM-Abstrichen basierte, bestätigte ihre große klinische Bedeutung für die Aufklärung von Chromosomenanomalien bei Patienten mit granulozytärer und lymphatischer Leukämie10.
Hierin stellen wir eine neuartige Methode zur Verfügung, um den Erfolg des Interphasen-FISH-Detektions bei MM-Patienten zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anwendung von FISH auf die genetische Risikostratifizierung in MM ist von wesentlicher Bedeutung. Der kritische Teil der FISH-Berichte sind nicht alle kernhaltigen Zellen, sondern klonale PCs, die spezifisch gereinigt oder identifiziert wurden, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder markiert wurden. Interphase FISH nach PC-Sortierung oder cIg-FISH erwies sich aufgrund des relativ geringen Anteils an PCs im BM als signifikant bei der Diagnose von MM. Diese Methoden weisen jedoch einige Mängel auf, da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde vom Innovationsfonds des WNLO 2018WNLOKF023 unterstützt.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
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