Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell’ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.
Abstract
Il rilevamento dell’ibridazione fluorescente in situ (FISH) è un metodo indispensabile nella stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo (MM), che è una delle neoplasie ematologiche più comuni. La caratteristica identificativa del MM è l’accumulo di plasmacellule maligne nel midollo osseo. I rapporti FISH per MM si concentrano principalmente sulle plasmacellule clonali purificate o identificate, piuttosto che su tutte le cellule nucleate, ordinando con perline magnetiche anti-CD138 o marcando con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. I nuclei interfasici del midollo osseo sono solitamente ottenuti da cellule fresche del midollo osseo. Tuttavia, un arricchimento soddisfacente dei campioni di plasmacellule richiede grandi quantità di eparina fresca anticoagulato, che non può essere ottenuta in caso di estrazione difficile del midollo osseo o di un rubinetto secco del midollo osseo. Qui, stabiliamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH su strisci di midollo osseo macchiati o non macchiati. Gli strisci di midollo osseo sono più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulato.
Introduction
Il mieloma multiplo (MM) è una malattia maligna delle plasmacellule (PC) con forte eterogeneità biologica e grandi differenze individuali nell’efficacia clinica, con periodi di sopravvivenza che vanno da mesi a decenni. Le caratteristiche citogenetiche sono importanti indicatori prognostici del MM. Il sistema di stratificazione del rischio e i trattamenti individualizzati basati su caratteristiche genetiche sono diventati argomenti di intenso interesse nella ricerca clinica sulla MM1. Le aberrazioni dei PC testati in un pannello di ibridazione fluorescente in situ (FISH) di midollo osseo (BM) includono del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification e 1p (CDKN2C) deletion.
La citogenetica standard delle metafasi deve essere inclusa nella valutazione iniziale dei pazienti con MM. Sebbene il cariotipo convenzionale a banda G offra il vantaggio di un’analisi dell’intero cromosoma, la bassa resa di questo metodo porta a molti risultati falsi negativi2. Tradizionalmente, i PC sono stati visti come in gran parte incapaci di scissione perché sono i prodotti allo stadio terminale della differenziazione dei linfociti B. Ciò rende difficile ottenere immagini divise. Una migliore analisi citogenetica nel MM con colture a lungo termine (6 giorni) e la stimolazione delle colture da parte delle citochine possono essere un metodo promettente per identificare le anomalie citogenetiche nei pazienti con MM di nuova diagnosi3. Anche quando il tempo di coltura è stato prolungato a 6 giorni, tuttavia, le anomalie citogenetiche sono state accuratamente riportate nel 30%-50% dei pazienti con MM4. Inoltre, il MM è caratterizzato da aberrazioni citogenetiche complesse che riflettono la sua eterogeneità prognostica. Tuttavia, la risoluzione della tradizionale tecnologia di banding cromosomico è bassa, il che può facilmente portare alla mancata rilevazione di anomalie cromosomiche nel MM.
La FISH interfase, preferibilmente dopo smistamento o marcatura con PC a base di perline magnetiche CD138-positive con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ/λ, è indispensabile nell’analisi di MM5,6. Un campione selezionato CD138-positivo è fortemente raccomandato per la resa ottimizzata delle cellule tumorali. Tuttavia, una quantificazione accurata delle aberrazioni citogenetiche richiede almeno 4 ml di BM anticoagulato per lo smistamento del PC. Inoltre, le combinazioni di SMistamento immunomagnetico delle perline CD138 con FISH o immunoglobuline citoplasmatiche a catena leggera κ/λ con test FISH (cIg-FISH) aumentano numerosi costi sperimentali e richiedono molto tempo.
Di solito, il rapporto PC viene prima valutato dall’esame morfologico di strisci bm colorati o sezioni di biopsia BM7,8. I campioni di BM di altissima qualità (campioni di primo aspirato di midollo) vengono utilizzati per i test morfologici, mentre quelli inviati per FISH o altra rilevazione sono spesso i campioni di aspirato secondario con alti rapporti di diluizione con sangue periferico.
Già nel 1990, diversi studi hanno dimostrato che gli strisci BM possono essere utilizzati direttamente per gli esami FISH interstiziali, che ha dimostrato di essere un metodo affidabile e ripetibile9. Un elegante studio basato sulla morfologia cellulare e sulla citochimica dell’esterasi combinato con FISH di sangue periferico e strisci bm ha confermato il suo grande significato clinico per chiarire le anomalie cromosomiche in pazienti con leucemia granulocitica e linfocitica10.
Qui forniamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH interfase nei pazienti con MM.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’applicazione della FISH alla stratificazione del rischio genetico nel MM è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma i PC clonali specificamente purificati o identificati mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. Interphase FISH dopo LO SMISTAMENTO PC o cIg-FISH è risultato significativo nella diagnosi di MM a causa della percentuale relativamente inferiore di PC nel BM. Tuttavia, questi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto dal Fondo per l’innovazione di WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
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