Hier presenteren we een protocol voor het verbeteren van het succes van interfase fluorescentie in situ hybridisatiedetectie op beenmerguitstrijkjes van patiënten met multipel myeloom.
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) detectie is een onmisbare methode in genetische risicostratificatie bij multipel myeloom (MM), wat een van de meest voorkomende hematologische maligniteiten is. Het identificerende kenmerk van MM is geaccumuleerde kwaadaardige plasmacellen in het beenmerg. FISH-rapporten voor MM richten zich voornamelijk op gezuiverde of geïdentificeerde klonale plasmacellen, in plaats van alle kerncellen, door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Beenmerg interfase kernen worden meestal verkregen uit verse beenmergcellen. Voor een bevredigende verrijking van plasmacelmonsters zijn echter grote hoeveelheden vers heparine-anti-gecoaguleerd beenmerg nodig, die niet kunnen worden verkregen in het geval van moeilijke beenmergextractie of een droge beenmergkraan. Hierin stellen we een nieuwe methode vast om het succes van FISH-detectie op bevlekte of niet-gekleurde beenmerguitstrijkjes te verbeteren. Beenmerguitstrijkjes zijn gemakkelijker te verkrijgen dan anticoaguleerde beenmergspecimens.
Multipel myeloom (MM) is een kwaadaardige plasmacelziekte (PC) met een sterke biologische heterogeniteit en grote individuele verschillen in klinische werkzaamheid, met overlevingsperioden variërend van maanden tot decennia. Cytogenetische kenmerken zijn belangrijke prognostische indicatoren van MM. Het risicostratificatiesysteem en geïndividualiseerde behandelingen op basis van genetische kenmerken zijn onderwerpen van intense interesse geworden in klinisch onderzoek naar MM1. De afwijkingen van pc’s getest in een fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) paneel van beenmerg (BM) omvatten del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification en 1p (CDKN2C) deletie.
Standaard metafasecytogenetica moet worden opgenomen in de eerste beoordeling van MM-patiënten. Hoewel conventionele G-gestreepte karyotypering het voordeel biedt van een hele chromosoomanalyse, leidt de lage opbrengst van deze methode tot veel vals negatieve resultaten2. Traditioneel worden pc’s beschouwd als grotendeels niet in staat om te splitsen omdat ze de eindproducten zijn van B-lymfocytendifferentiatie. Dit maakt het moeilijk om gesplitste afbeeldingen te verkrijgen. Verbeterde cytogenetische analyse in MM met langetermijnculturen (6 dagen) en stimulatie van culturen door cytokines kan een veelbelovende methode zijn voor het identificeren van cytogenetische afwijkingen bij nieuw gediagnosticeerde MM-patiënten3. Zelfs wanneer de kweektijd werd verlengd tot 6 dagen, werden cytogenetische afwijkingen echter nauwkeurig gemeld bij 30% -50% van de MM-patiënten4. Bovendien wordt MM gekenmerkt door complexe cytogenetische aberraties die de prognostische heterogeniteit weerspiegelen. De resolutie van traditionele chromosoombandtechnologie is echter laag, wat gemakkelijk kan leiden tot gemiste detectie van chromosomale afwijkingen in MM.
Interfase FISH, bij voorkeur na CD138-positieve magnetische kraalgebaseerde PC-sortering of markering met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ/λ, is onmisbaar bij de analyse van MM5,6. Een CD138-positief geselecteerd monster wordt sterk aanbevolen voor de geoptimaliseerde opbrengst van tumorcellen. Nauwkeurige kwantificering van cytogenetische afwijkingen vereist echter ten minste 4 ml antistollings BM voor pc-sortering. Bovendien verhogen de combinaties van CD138 immunomagnetische kraalsortering met FISH of cytoplasmatische κ / λ lichte keten immunoglobuline met FISH-testen (cIg-FISH) tal van experimentele kosten en zijn tijdrovend.
Meestal wordt de PC-ratio eerst beoordeeld aan de hand van het morfologisch onderzoek van gekleurde BM-uitstrijkjes of BM-biopsiesecties7,8. BM-monsters van de hoogste kwaliteit (eerste mergaspiraatmonsters) worden gebruikt voor morfologische tests, terwijl die welke voor FISH of andere detectie worden verzonden, vaak de secundaire aspiraatmonsters zijn met hoge verdunningsverhoudingen met perifeer bloed.
Al in de jaren 1990 toonden meerdere studies aan dat BM-uitstrijkjes direct kunnen worden gebruikt voor interstitiële FISH-onderzoeken, wat een betrouwbare en herhaalbare methode is gebleken9. Een elegante studie op basis van celmorfologie en esterasecytochemie in combinatie met FISH van perifeer bloed en BM-uitstrijkjes bevestigde de grote klinische betekenis ervan voor het ophelderen van chromosomale afwijkingen bij patiënten met granulocytaire en lymfatische leukemie10.
Hierin bieden we een nieuwe methode voor het verbeteren van het succes van interfase FISH-detectie bij MM-patiënten.
De toepassing van FISH op genetische risicostratificatie in MM is essentieel. Het kritieke deel van FISH-rapporten zijn niet alle kerncellen, maar klonale pc’s die specifiek zijn gezuiverd of geïdentificeerd door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Interphase FISH na PC-sortering of cIg-FISH bleek significant te zijn in de diagnose van MM vanwege het relatief lagere aandeel pc’s in de BM. Deze methoden hebben echter enkele tekortkominge…
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd ondersteund door het Innovatiefonds van WNLO 2018WNLOKF023.
automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |