İnfaz Floresan in situ Multipl Miyelomun Kemik İliği Yaymalarının Hibridizasyonu
Summary
Burada, multipl miyelom hastalarından alınan kemik iliği yaymalarında interfaz floresan in situ hibridizasyon tespitinin başarısını artırmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Floresan in situ hibridizasyon (FISH) tespiti, en sık görülen hematolojik malignitelerden biri olan multipl miyelomda (MM) genetik risk sınıflamasında vazgeçilmez bir yöntemdir. MM’nin tanımlayıcı özelliği, kemik iliğinde biriken malign plazma hücreleridir. MM için FISH raporları, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralayarak veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ veya λ ile işaretleyerek tüm çekirdekli hücrelerden ziyade saflaştırılmış veya tanımlanmış klonal plazma hücrelerine odaklanır. Kemik iliği interfaz çekirdekleri genellikle taze kemik iliği hücrelerinden elde edilir. Bununla birlikte, plazma hücresi örneklerinin tatmin edici bir şekilde zenginleştirilmesi, zor kemik iliği ekstraksiyonu veya kemik iliği kuru musluğu durumunda elde edilemeyen büyük miktarda taze heparin anti-pıhtılaşmış kemik iliği gerektirir. Bu yazıda, lekeli veya lekesiz kemik iliği yaymalarında FISH tespitinin başarısını artırmak için yeni bir yöntem oluşturduk. Kemik iliği yaymalarının elde edilmesi, antikoagüle kemik iliği örneklerinden daha kolaydır.
Introduction
Multipl miyelom (MM), güçlü biyolojik heterojeniteye ve klinik etkinliğinde büyük bireysel farklılıklara sahip, sağkalım süreleri aylardan on yıllara kadar değişen malign bir plazma hücresi (PC) hastalığıdır. Sitogenetik özellikler MM’nin önemli prognostik göstergeleridir. Risk sınıflandırma sistemi ve genetik özelliklere dayalı bireyselleştirilmiş tedaviler, MM1 ile ilgili klinik araştırmalarda yoğun ilgi gören konular haline gelmiştir. Kemik iliğinin (BM) floresan in situ hibridizasyon (FISH) panelinde test edilen PC’lerin anormallikleri arasında del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t (4;14) (IGH / FGFR3), t (11;14) (IGH / MYEOV), t (14; 16) (IGH / MAF), t (14: 20) (IGH / MAFB), 1q21 (CKS1B) kazanç / amplifikasyon ve 1p (CDKN2C) delesyonu bulunur.
MM hastalarının ilk değerlendirmesine standart metafaz sitogenetiği dahil edilmelidir. Geleneksel G bantlı karyotipleme, tüm kromozom analizinin faydasını sunsa da, bu yöntemin düşük verimi birçok yanlış negatif sonuca yol açar2. Geleneksel olarak, PC’ler B lenfosit farklılaşmasının son aşama ürünleri oldukları için büyük ölçüde bölünemez olarak görülmüştür. Bu, bölünmüş görüntüler elde etmeyi zorlaştırır. Uzun süreli kültürlerle (6 gün) MM’de geliştirilmiş sitogenetik analiz ve kültürlerin sitokinlerle uyarılması, yeni tanı konmuş MM hastalarında sitogenetik anormallikleri tanımlamak için umut verici bir yöntem olabilir3. Bununla birlikte, kültür süresi 6 güne uzatıldığında bile, MM hastalarının %30-%50’sinde sitogenetik anormallikler doğru bir şekilde bildirilmiştir4. Ayrıca, MM, prognostik heterojenliğini yansıtan karmaşık sitogenetik anormalliklerle karakterizedir. Bununla birlikte, geleneksel kromozom bantlama teknolojisinin çözünürlüğü düşüktür, bu da MM’de kromozomal anormalliklerin kolayca tespit edilmesine yol açabilir.
İnterfaz FISH, tercihen CD138-pozitif manyetik boncuk bazlı PC sıralama veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ / λ ile işaretlemeden sonra, MM5,6 analizinde vazgeçilmezdir. CD138 pozitif seçilmiş bir örnek, tümör hücrelerinin optimize edilmiş verimi için şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, sitogenetik anormalliklerin doğru kantitasyonu, PC sıralaması için en az 4 mL antikoagüle BM gerektirir. Ek olarak, CD138 immünomanyetik boncuk ayıklama ile FISH veya FISH testi (cIg-FISH) ile sitoplazmik κ / λ hafif zincirli immünoglobulin kombinasyonları çok sayıda deneysel maliyeti arttırır ve zaman alıcıdır.
Genellikle PK oranı ilk olarak boyalı BM yaymalarının veya BM biyopsi kesitlerinin morfolojik incelemesinden değerlendirilir7,8. Morfolojik testler için en yüksek kalitede BM örnekleri (ilk kemik iliği aspirat örnekleri) kullanılırken, FISH veya başka bir tespit için gönderilenler genellikle periferik kanla yüksek oranda seyreltme oranına sahip ikincil aspirat örnekleridir.
1990’lı yılların başlarında, birçok çalışma, BM yaymalarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğu kanıtlanmış olan interstisyel FISH muayeneleri için doğrudan kullanılabileceğini göstermiştir9. Periferik kan ve BM yaymalarının FISH ile kombine edilmiş hücre morfolojisi ve esteraz sitokimyasına dayanan zarif bir çalışma, granülositik ve lenfositik lösemili hastalarda kromozomal anormallikleri aydınlatmak için büyük klinik önemini doğrulamıştır10.
Burada, MM hastalarında interfaz FISH tespitinin başarısını artırmak için yeni bir yöntem sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
MM’de genetik risk sınıflamasına FISH’in uygulanması esastır. FISH raporlarının kritik kısmı tüm çekirdekli hücreler değil, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralanarak veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ veya λ ile işaretlenerek özel olarak saflaştırılan veya tanımlanan klonal PC’lerdir. PC sıralama veya cIg-FISH sonrası interfaze FISH, BM’deki PC’lerin nispeten daha düşük oranı nedeniyle MM tanısında anlamlı bulunmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin karmaşık süreçler,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje WNLO 2018WNLOKF023 İnovasyon Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma – A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry’s Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
