Межфазная флуоресценция in situ Гибридизация мазков костного мозга множественной миеломы
Summary
Здесь мы представляем протокол для улучшения успеха обнаружения интерфазной флуоресцентной гибридизации in situ на мазках костного мозга у пациентов с множественной миеломой.
Abstract
Обнаружение флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) является незаменимым методом стратификации генетического риска при множественной миеломе (ММ), которая является одной из наиболее распространенных гематологических злокачественных новообразований. Идентифицирующей характеристикой ММ является накопление злокачественных плазматических клеток в костном мозге. Отчеты FISH для ММ в основном сосредоточены на очищенных или идентифицированных клональных плазматических клетках, а не на всех ядерных клетках, путем сортировки с помощью магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической иммуноглобулиновой легкой цепью κ или λ. Межфазные ядра костного мозга обычно получают из свежих клеток костного мозга. Однако удовлетворительное обогащение образцов плазматических клеток требует большого количества свежего гепарина, антикоагулянтированного костного мозга, которое не может быть получено в случае затрудненного извлечения костного мозга или сухого крана костного мозга. Здесь мы устанавливаем новый метод для улучшения успеха обнаружения FISH на окрашенных или неокрашенных мазках костного мозга. Мазки костного мозга получить легче, чем антикоагулянтные образцы костного мозга.
Introduction
Множественная миелома (ММ) является злокачественным заболеванием плазматических клеток (ПК) с сильной биологической гетерогенностью и большими индивидуальными различиями в клинической эффективности, с периодами выживания от месяцев до десятилетий. Цитогенетические характеристики являются важными прогностическими показателями ММ. Система стратификации риска и индивидуализированные методы лечения, основанные на генетических характеристиках, стали темами, представляющими большой интерес в клинических исследованиях MM1. Аберрации ПК, протестированных в флуоресцентной панели гибридизации in situ (FISH) костного мозга (BM), включают del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), усиление/усиление 1q21 (CKS1B) и удаление 1p (CDKN2C).
Стандартная метафазная цитогенетика должна быть включена в первоначальную оценку пациентов с ММ. Хотя обычное G-полосное кариотипирование предлагает преимущество анализа всей хромосомы, низкий выход этого метода приводит ко многим ложноотрицательным результатам2. Традиционно ПК рассматривались как в значительной степени неспособные к расщеплению, потому что они являются конечными продуктами дифференцировки В-лимфоцитов. Это затрудняет получение разделенных изображений. Улучшенный цитогенетический анализ при ММ с долгосрочными культурами (6 дней) и стимуляция культур цитокинами могут быть перспективным методом выявления цитогенетических аномалий у вновь диагностированных пациентов с ММ3. Однако даже когда время культивирования было продлено до 6 дней, цитогенетические аномалии были точно зарегистрированы у 30%-50% пациентов с ММ4. Кроме того, ММ характеризуется сложными цитогенетическими аберрациями, которые отражают его прогностическую гетерогенность. Однако разрешение традиционной технологии полосирования хромосом низкое, что может легко привести к пропущенному обнаружению хромосомных аномалий в ММ.
Интерфазная FISH, предпочтительно после CD138-положительной магнитной шариковой сортировки ПК или маркировки цитоплазматического иммуноглобулина с легкой цепью κ/λ, незаменима при анализе MM5,6. CD138-положительный выбранный образец настоятельно рекомендуется для оптимизированного выхода опухолевых клеток. Однако для точного количественного определения цитогенетических аберраций требуется не менее 4 мл антикоагулянтного БМ для сортировки ПК. Кроме того, комбинации иммуномагнитной сортировки ШАРИКОВ CD138 с FISH или цитоплазматического иммуноглобулина с легкой цепью κ/λ с тестированием FISH (cIg-FISH) увеличивают многочисленные экспериментальные затраты и отнимают много времени.
Обычно соотношение ПК сначала оценивают по морфологическому исследованию окрашенных мазков БМ или участков биопсии БМ7,8. Образцы БМ самого высокого качества (образцы аспирата первого костного мозга) используются для морфологического тестирования, тогда как образцы, отправленные для FISH или другого обнаружения, часто являются вторичными образцами аспирата с высоким соотношением разбавления периферической кровью.
Еще в 1990-х годах многочисленные исследования показали, что мазки БМ могут быть непосредственно использованы для интерстициальных исследований FISH, что оказалось надежным и воспроизводимым методом9. Элегантное исследование, основанное на морфологии клеток и цитохимии эстеразы в сочетании с FISH периферической крови и мазками БМ, подтвердило его большое клиническое значение для выяснения хромосомных аномалий у пациентов с гранулоцитарным и лимфоцитарным лейкозом10.
Здесь мы предлагаем новый метод для улучшения успеха межфазного обнаружения FISH у пациентов с ММ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Применение FISH к стратификации генетического риска в ММ имеет важное значение. Критической частью отчетов FISH являются не все ядерные клетки, а клональные ПК, специально очищенные или идентифицированные путем сортировки магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической им…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Данный проект был поддержан Инновационным фондом WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma – A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry’s Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
