Fluorescência interfásico in situ Hibridização de Manchas de Medula Óssea de Mieloma Múltiplo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o sucesso da fluorescência interfásico na detecção de hibridização in situ em manchas de medula óssea de múltiplos pacientes com mieloma.
Abstract
A fluorescência na detecção de hibridização situ (FISH) é um método indispensável na estratificação de risco genético em mieloma múltiplo (MM), que é uma das malignidades hematológicas mais comuns. A característica de identificação de MM são células plasmáticas malignas acumuladas na medula óssea. Os relatórios de PEIXEs para MM se concentram principalmente em células plasmáticas clonais purificadas ou identificadas, em vez de todas as células nucleadas, classificando-se com contas magnéticas anti-CD138 ou marcando com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ ou λ. Os núcleos interfasos da medula óssea são geralmente obtidos a partir de células frescas da medula óssea. No entanto, o enriquecimento satisfatório das amostras de células plasmáticas requer grandes quantidades de medula óssea anticoagulada de heparina fresca, que não pode ser obtida no caso de difícil extração de medula óssea ou uma torneira seca de medula óssea. Aqui, estabelecemos um novo método para melhorar o sucesso da detecção de PEIXEs em manchas de medula óssea manchadas ou não manchadas. Manchas de medula óssea são mais fáceis de obter do que espécimes de medula óssea anticoagulados.
Introduction
O mieloma múltiplo (MM) é uma doença maligna de células plasmáticas (PC) com forte heterogeneidade biológica e grandes diferenças individuais na eficácia clínica, com períodos de sobrevivência que variam de meses a décadas. Características citogenéticas são indicadores prognósticos importantes da MM. O sistema de estratificação de risco e os tratamentos individualizados baseados em características genéticas tornaram-se temas de intenso interesse em pesquisas clínicas sobre MM1. As aberrações de PCs testados em fluorescência no painel de hibridização situ (FISH) da medula óssea (BM) incluem del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) de ganho/amplificação e exclusão de 1p (CDKN2C).
A citogenética metafase padrão deve ser incluída na avaliação inicial dos pacientes com MM. Embora o karyotipping convencional de banda G ofereça o benefício de uma análise de cromossomo inteiro, o baixo rendimento deste método leva a muitos resultados falsos negativos2. Tradicionalmente, os PCs têm sido vistos como em grande parte incapazes de se dividir porque são os produtos em estágio final da diferenciação de linfócitos B. Isso dificulta a obtenção de imagens divididas. A análise citogenética aprimorada em MM com culturas de longo prazo (6 dias) e estimulação de culturas por citocinas pode ser um método promissor para identificar anormalidades citogenéticas em pacientes recém-diagnosticados em MM3. Mesmo quando o tempo de cultura foi prolongado para 6 dias, no entanto, anormalidades citogenéticas foram relatadas com precisão em 30%-50% dos pacientes com MM4. Além disso, a MM é caracterizada por complexas aberrações citogenéticas que refletem sua heterogeneidade prognóstica. No entanto, a resolução da tecnologia tradicional de banda cromossomo é baixa, o que pode facilmente levar à detecção perdida de anormalidades cromossômicas em MM.
O PEIXE interfásico, preferencialmente após a classificação ou marcação de PC baseado em contas magnéticas cd138 positivos com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ/λ, é indispensável na análise de MM5,6. Uma amostra selecionada com CD138 positivo é fortemente recomendada para o rendimento otimizado das células tumorais. No entanto, a quantitação precisa de aberrações citogenéticas requer pelo menos 4 mL de BM anticoagulado para classificação de PC. Além disso, as combinações de classificação de contas imunomagnéticas CD138 com mímulas citoplasmáticas de cadeia luminosa com teste de PEIXE (cIg-FISH) aumentam inúmeros custos experimentais e são demoradas.
Normalmente, a razão do PC é primeiramente avaliada a partir do exame morfológico de manchas manchadas de BM ou seções de biópsia BM7,8. Amostras de BM da mais alta qualidade (primeiras amostras de aspiração de medula) são utilizadas para testes morfológicos, enquanto aquelas enviadas para FISH ou outra detecção são muitas vezes as amostras secundárias aspiradas com altas proporções de diluição com sangue periférico.
Já na década de 1990, vários estudos mostraram que as manchas de MMC podem ser usadas diretamente para exames intersticiais de PEIXEs, o que provou ser um método confiável e repetível9. Um estudo elegante baseado na morfologia celular e citoquímica esterase combinado com peixes de sangue periférico e manchas de BM confirmou sua grande significância clínica para elucidar anormalidades cromossômicas em pacientes com leucemia granulócítica e linfocítica10.
Aqui, fornecemos um novo método para melhorar o sucesso da detecção de peixes interfasos em pacientes mm.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aplicação de PEIXEs à estratificação de risco genético em MM é essencial. A parte crítica dos relatórios fish não são todas as células nucleadas, mas os PCs clonais especificamente purificados ou identificados por classificação com contas magnéticas anti-CD138 ou marcação com cadeia de luz de imunoglobulina citoplasmática κ ou λ. Peixes interfásicos após a classificação do PC ou cIg-FISH foram considerados significativos no diagnóstico de MM devido à proporção relativamente menor de PCs no B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi apoiado pelo Fundo de Inovação da WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
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