Hibridación de fluorescencia in situ interfásica de frotis de médula ósea de mieloma múltiple
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para mejorar el éxito de la detección de hibridación de fluorescencia in situ interfásica en frotis de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple.
Abstract
La detección de hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método indispensable en la estratificación del riesgo genético en el mieloma múltiple (MM), que es una de las neoplasias hematológicas malignas más comunes. La característica identificativa de MM son las células plasmáticas malignas acumuladas en la médula ósea. Los informes FISH para MM se centran principalmente en células plasmáticas clonales purificadas o identificadas, en lugar de todas las células nucleadas, mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ o λ. Los núcleos de interfase de la médula ósea generalmente se obtienen de células frescas de la médula ósea. Sin embargo, el enriquecimiento satisfactorio de las muestras de células plasmáticas requiere grandes cantidades de médula ósea fresca anticoagulada con heparina, que no se puede obtener en el caso de una extracción difícil de la médula ósea o un grifo seco de médula ósea. Aquí, establecemos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH en frotis de médula ósea teñidos o no manchados. Los frotis de médula ósea son más fáciles de obtener que las muestras de médula ósea anticoaguladas.
Introduction
El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad maligna de células plasmáticas (PC) con una fuerte heterogeneidad biológica y grandes diferencias individuales en la eficacia clínica, con períodos de supervivencia que van desde meses hasta décadas. Las características citogenéticas son importantes indicadores pronósticos de la MM. El sistema de estratificación del riesgo y los tratamientos individualizados basados en características genéticas se han convertido en temas de intenso interés en la investigación clínica sobre MM1. Las aberraciones de los PC probados en un panel de hibridación fluorescente in situ (FISH) de médula ósea (BM) incluyen del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) ganancia/amplificación y deleción 1p (CDKN2C).
La citogenética metafásica estándar debe incluirse en la evaluación inicial de los pacientes con MM. Aunque el cariotipo convencional con banda G ofrece el beneficio de un análisis cromosómico completo, el bajo rendimiento de este método conduce a muchos resultados falsos negativos2. Tradicionalmente, las PC han sido vistas como en gran medida incapaces de dividirse porque son los productos de la etapa final de la diferenciación de linfocitos B. Esto dificulta la obtención de imágenes divididas. La mejora del análisis citogenético en MM con cultivos a largo plazo (6 días) y la estimulación de cultivos por citoquinas pueden ser un método prometedor para identificar anomalías citogenéticas en pacientes con MM recién diagnosticados3. Sin embargo, incluso cuando el tiempo de cultivo se prolongó a 6 días, las anomalías citogenéticas se informaron con precisión en el 30%-50% de los pacientes con MM4. Además, la MM se caracteriza por aberraciones citogenéticas complejas que reflejan su heterogeneidad pronóstica. Sin embargo, la resolución de la tecnología tradicional de bandas cromosómicas es baja, lo que puede conducir fácilmente a la detección errónea de anomalías cromosómicas en MM.
La interfase FISH, preferiblemente después de la clasificación o marcado de PC basada en perlas magnéticas CD138 positivas con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ/λ, es indispensable en el análisis de MM5,6. Se recomienda encarecidamente una muestra seleccionada CD138 positiva para el rendimiento optimizado de las células tumorales. Sin embargo, la cuantificación precisa de las aberraciones citogenéticas requiere al menos 4 ml de BM anticoagulado para la clasificación de PC. Además, las combinaciones de clasificación de perlas inmunomagnéticas CD138 con FISH o inmunoglobulina de cadena ligera citoplasmática κ/λ con pruebas FISH (cIg-FISH) aumentan numerosos costos experimentales y consumen mucho tiempo.
Por lo general, la relación de PC se evalúa primero a partir del examen morfológico de frotis de BM teñido o secciones de biopsia de BM7,8. Las muestras BM de la más alta calidad (primeras muestras de aspirado de médula) se utilizan para pruebas morfológicas, mientras que las enviadas para FISH u otra detección son a menudo las muestras de aspirado secundario con altas proporciones de dilución con sangre periférica.
Ya en la década de 1990, múltiples estudios demostraron que los frotis de BM se pueden usar directamente para los exámenes intersticiales de FISH, lo que ha demostrado ser un método confiable y repetible9. Un elegante estudio basado en la morfología celular y la citoquímica de la esterasa combinado con FISH de sangre periférica y frotis de BM confirmó su gran importancia clínica para dilucidar anomalías cromosómicas en pacientes con leucemia granulocítica y linfocítica10.
Aquí, proporcionamos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH interfásico en pacientes con MM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aplicación de FISH a la estratificación del riesgo genético en MM es esencial. La parte crítica de los informes fish no son todas las células nucleadas, sino los PC clonales específicamente purificados o identificados mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con inmunoglobulina citoplasmática de cadena ligera κ o λ. Se encontró que la interfase FISH después de la clasificación de PC o cIg-FISH era significativa en el diagnóstico de MM debido a la proporción relativamente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado por el Fondo de Innovación de WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma – A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry’s Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
