Summary
여기에서, 우리는 다발성 골수종 환자로부터의 골수 도말에 대한 계내 혼성화 검출에서 위상간 형광의 성공을 개선하기 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
형광 계내 혼성화 (FISH) 검출은 가장 흔한 혈액학적 악성 종양 중 하나인 다발성 골수종 (MM)의 유전 적 위험 계층화에 없어서는 안될 방법입니다. MM의 식별 특성은 골수에 악성 혈장 세포가 축적되어 있다는 것이다. MM에 대한 FISH 보고서는 항-CD138 자기 비드로 분류하거나 세포질 면역 글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 모든 유핵 세포보다는 정제되거나 확인된 클론 혈장 세포에 주로 초점을 맞춥니다. 골수 간 상 핵은 일반적으로 신선한 골수 세포로부터 얻어집니다. 그러나, 혈장 세포 표본의 만족스러운 농축은 다량의 신선한 헤파린 항응고 골수를 필요로 하며, 이는 어려운 골수 추출 또는 골수 건조 탭의 경우에는 얻을 수 없다. 여기에서, 우리는 염색 또는 염색되지 않은 골수 도말에 대한 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 새로운 방법을 확립한다. 골수 얼룩은 항응고 된 골수 표본보다 쉽게 얻을 수 있습니다.
Introduction
다발성 골수종 (MM)은 생물학적 이질성이 강하고 임상 효능이 큰 개인차를 가진 악성 혈장 세포 (PC) 질환으로 생존 기간은 수개월에서 수십 년 사이입니다. 세포유전학적 특성은 MM의 중요한 예후 지표이다. 위험 계층화 시스템과 유전 적 특성에 기반한 개별화 된 치료법은 MM1에 대한 임상 연구에 대한 강렬한 관심의 주제가되었습니다. 골수 (BM)의 형광 계내 혼성화 (FISH) 패널에서 테스트 된 PC의 수차에는 del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t (4;14) (IGH / FGFR3), t (11;14) (IGH / MYEOV), t (14;16) (IGH / MAF), t (14 : 20) (IGH / MAFB), 1q21 (CKS1B) 이득 / 증폭 및 1p (CDKN2C) 결실이 포함됩니다.
표준 형이상상 세포유전학은 MM 환자의 초기 평가에 포함되어야 한다. 기존의 G 밴드 핵형이 전체 염색체 분석의 이점을 제공하지만,이 방법의 낮은 수율은 많은 위음성 결과를 초래합니다2. 전통적으로, PC는 B 림프구 분화의 최종 단계 생성물이기 때문에 분할이 불가능한 것으로 간주되어 왔다. 이로 인해 분할 이미지를 얻기가 어렵습니다. 장기 배양(6일)을 통한 MM에서의 개선된 세포유전학적 분석 및 사이토카인에 의한 배양의 자극은 새로 진단된 MM 환자에서 세포유전학적 이상을 확인하기 위한 유망한 방법일 수 있다3. 그러나 배양 시간이 6일로 연장되었을 때조차도, 세포유전학적 이상은 MM 환자의 30%-50%에서 정확하게 보고되었다4. 또한, MM은 그의 예후 이질성을 반영하는 복잡한 세포유전학적 수차를 특징으로 한다. 그러나 전통적인 염색체 밴딩 기술의 해상도가 낮기 때문에 MM에서 염색체 이상을 쉽게 탐지하지 못할 수 있습니다.
세포질 면역글로불린 경쇄 κ/λ로 CD138 양성 자기 비드 기반 PC 분류 또는 마킹 후, 바람직하게는 상간 FISH는 MM5,6의 분석에 없어서는 안 될 필수 요소이다. CD138 양성 선별 샘플은 종양 세포의 최적화된 수율을 위해 강력하게 권장된다. 그러나, 세포유전학적 수차의 정확한 정량화는 PC 분류를 위해 적어도 4mL의 항응고된 BM을 필요로 한다. 또한, CD138 면역자기 비드 분류와 FISH 또는 세포질 κ/λ 경쇄 면역글로불린과 FISH 테스트(cIg-FISH)의 조합은 수많은 실험 비용을 증가시키고 시간이 많이 걸립니다.
보통, PC 비율은 염색된 BM 도말 또는 BM 생검 섹션7,8의 형태학적 검사로부터 먼저 평가된다. 최고 품질의 BM 표본 (첫 번째 골수 흡인물 샘플)은 형태 학적 테스트에 사용되는 반면, FISH 또는 기타 검출을 위해 보내진 샘플은 종종 말초 혈액으로 희석 비율이 높은 보조 흡인물 샘플입니다.
1990년대 초, 여러 연구에 따르면 BM 도말들은 간질성 FISH 검사에 직접 사용될 수 있으며, 이는 신뢰할 수 있고 반복 가능한 방법인 것으로 입증되었습니다9. 말초 혈액 및 BM 도말의 FISH와 결합 된 세포 형태학 및 에스테라제 세포 화학에 기초한 우아한 연구는 과립 및 림프구성 백혈병 환자의 염색체 이상을 밝히는 데 큰 임상 적 중요성을 확인했습니다10.
본원에서, 우리는 MM 환자에서 상간 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
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Protocol
이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 우한 대학의 중난 병원 윤리위원회 (제 2019065 호)의 승인을 받았습니다. 표본은 중국 우한대학교 중난병원의 혈액학과에 있는 MM 환자로부터 채취하였다.
1. BM 도말의 제조
- BM 용액의 첫 번째 0.2 mL를 깨끗한 일회용 유리 슬라이드 위에 놓습니다.
- BM을 신속하게 제거하여 날카로운 꼬리로 BM 얼룩을 균일 한 두께로 퍼뜨립니다. 그런 다음 자연적으로 건조시킵니다.
- BM 필름을 실온에서 약 10초 동안 Wright-Giemsa 용액 1mL로 덮으십시오.
- 1 mL의 인산염 완충액을 슬라이드에 첨가한다.
참고: 염료 용액이 건조하거나 슬라이드에서 흘러나오지 않도록 주의하십시오. - 염료 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 유지하십시오.
- 슬라이드를 깨끗한 물로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다.
- 순방향 광 현미경을 사용하여 악성 PC를 탐지합니다. PC는 잘 분산되어 있어야합니다.
2. BM 얼룩의 물고기 전처리
- 하이브리드화 된 영역을 10 분 동안 고정 용액으로 덮어 PC를 변색하고 수정하십시오.
- 신선한 고정 용액을 준비하려면 메탄올과 빙초산을 3:1의 부피비로 혼합하십시오.
- 슬라이드를 탈이온수(dH2O)로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다.
- 2x SSC 버퍼가 들어있는 항아리를 수조에서 56°C로 예열한다. 사용하기 전에 버퍼를 20x SSC로 갓 희석하십시오.
- 20x SSC를 준비하려면 염화나트륨 176g과 시트르산나트륨 88g을 dH2O 800mL와 완전히 섞는다. pH를 측정하고 pH 5.3 ± 0.2로 조정한다. 그런 다음 dH2O를 추가하여 최종 부피를 1L로 가져옵니다.
- 제조된 BM 얼룩을 예열된 2x SSC 완충액에서 10분 동안 세척하고, 이를 실온에서 탈이온수에 침지시켰다.
- 도말기를 에탄올 구배(각각 1분 동안 70%, 85%, 및 100% 에탄올)로 탈수시킨다. 도말기를 10 분 동안 공기 건조시킵니다.
3. BM 얼룩 물고기와 세척
참고: 모든 단계는 형광 담금질을 방지하기 위해 어두운 방에서 수행되었다.
- 염색체 17 (CEP17) 프로브 혼합물의 TP53 / 센트로미어를 혼성화 영역에 추가하고 커버 슬립으로 덮으십시오. 미세한 핀셋으로 부드럽게 눌러 아래에서 기포를 제거하십시오.
- 커버슬립의 모든면을 고무 시멘트로 밀봉하여 견고성을 유지하십시오.
- 고무 시멘트를 응고 한 후 슬라이드를 자동 FISH 기계에 놓습니다. 78°C에서 5분 동안 변성을 수행하고, 이어서 37°C에서 하룻밤 동안 혼성화시켰다.
- FISH 기계에서 슬라이드를 가져옵니다. 미세한 뾰족한 핀셋을 사용하여 고무 시멘트를 부드럽게 제거하십시오.
- 슬라이드를 실온에서 2x SSC에 약 1 또는 2분 동안 담그고 커버슬립을 닦아냅니다.
- 슬라이드를 68°C에서 2분 동안 수조에서 0.4x 예열된 0.4x SSC/0.3% NP-40 완충액으로 세척한다.
- 20x SSC(pH 5.3) 20mL와 950mL의 dH2O를 완전히 혼합하여 0.4x SSC/0.3% NP-40 용액을 준비합니다. 그런 다음 NP-40 3 mL를 넣고 완전히 용해 될 때까지 완전히 혼합하십시오. pH를 측정하고 NaOH로 7.0-7.5로 조정한다. 그런 다음 dH2O를 첨가하여 전체 용액의 최종 부피를 1 L로 가져옵니다.
- 슬라이드를 2x SSC로 37°C 수조에서 1분 동안 세척한다. 어둠 속에서 똑바로 세워 10 분 동안 완전히 말리십시오.
- 10μL의 DAPI를 혼성화 영역에 추가하고 커버슬립으로 덮으십시오.
4. 물고기 분석 및 이미징
- 형광 현미경 상에서 적합한 필터 세트를 사용하여 혼성화된 슬라이드를 본다.
- 단색 청색 형광단 광학 필터를 사용하여 세포 핵의 형광 강도를 관찰하십시오. DAPI 필터 세트에서 세포 핵 이미지를 촬영합니다.
- 염색체 센트로미어 프로브를 사용하여 세포에 얼마나 많은 염색체가 포함되어 있는지 보여줍니다. CEP17에 녹색 형광을 부착하십시오. 스펙트럼 녹색 형광단 광학 필터를 사용하여 CEP17의 위치를 관찰하십시오. CEP17 신호 이미지를 녹색 필터 세트 아래에서 가져옵니다.
- TP53 유전자를 주황색 형광으로 표지하십시오. 스펙트럼 오렌지 형광단 광학 필터를 사용하여 TP53을 관찰하십시오. 이 세트에서 TP53 신호 이미지를 가져옵니다.
- 이 세 이미지를 병합하고 숫자 이상이 있는지 검사하십시오.
참고: 정상 위상 세포에서는 청색 형광이 있는 핵 내부에서 두 개의 주황색과 두 개의 녹색 신호가 관찰되며, 이는 한 쌍의 정상 염색체 17을 나타냅니다(그림 1).
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Representative Results
새로 진단된 MM 환자의 초기 형태학적 평가에서, BM 도말에서 PC의 15%는 정상 PC보다 더 많은 양의 세포질과 함께 더 크고 어두운 핵을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 2A). 면역표현형 기술에 의해 검출된 헤파린 항응고된 BM의 첫 번째 튜브는 모노클로날 비정상적 PC의 2.3%만을 밝혀냈다. FISH 또는 cIg-FISH 기술과 조합된 CD138 면역자기 비드 분류는 정확한 FISH 결과를 얻기 위해 필수적이다. 그러나, 흡기 BM은 드라이 탭인 경우에 제한된다. BM 도말은 상간 FISH를 시험하기 위해 사용되었다. BM 필름에서 대표적인 비뚤어진 PC를 형광 현미경 스테이지 버니어 캘리퍼에 의해 국소화하였다(도 2B). FISH는 TP53 및 CEP17 에 대해 시험하기 위해 BM 도말에 적용되었다. FISH 결과는 하나의 상간 PC 핵에서 네 개의 주황색과 네 개의 녹색 신호를 보여 주었고 (그림 2C), 염색체 17의 네 사본이 메타 페이즈 PC 핵에 국한되었음을 시사합니다. 핵형화 결과는 배양 시간을 최대 3일까지 연장하고 FISH 분석 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석함으로써 얻어졌다(도 2D). BM 도말에 대한 상간 FISH 결과의 정확성이 더욱 검증되었습니다.
그림 1: 위상 간 세포(1000x)에 대한 TP53/CEP17 FISH 프로브의 정상 신호. 세포 핵의 형광 강도는 파란색, TP53 은 주황색, CEP17은 녹색이었다. 이 3 개의 정상 간상 세포에서 두 개의 주황색과 두 개의 녹색 신호가 청색 형광 핵 내부에 나타나 정상 염색체 17의 두 쌍을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다발성 골수종 (MM) 환자에서 골수 (BM)의 형태학 및 유전 이미지. (a) BM 도말의 Wright-Giemsa 염색 후 화살표()로 표시된 군집형 분포를 갖는 골수종 세포(
1000×). (b) 형광현미경(1000×)에서 흑백 카메라로 촬영한 회색조 이미지 상에서 화살표(
)로 표시된 비누클레에이트 혈장세포세포. (c) TP53/센트로미어 염색체 17(CEP17)의 형광 계내 혼성화(FISH) 프로브 BM 번짐에 대한 시험. FISH는 각 핵(→)에서 네 개의 TP53과 네 개의 CEP17 신호를 드러낸다(1000×). (D) 비정상적인 염색체 핵도그램은 하나의 핵에서 두 쌍의 염색체 17을 나타낸다(
). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
MM에서 유전 적 위험 계층화에 FISH를 적용하는 것이 필수적입니다. FISH 보고의 중요한 부분은 모든 유핵세포가 아니라, 항-CD138 마그네틱 비드로 분류하거나 세포질 면역글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 특이적으로 정제되거나 확인된 클론 PC이다. PC 분류 후 상간 FISH 또는 cIg-FISH는 BM에서 PC의 상대적으로 낮은 비율로 인해 MM의 진단에 유의한 것으로 밝혀졌다. 그러나 이러한 방법에는 복잡한 공정, 높은 시편 요구 사항 및 높은 실험 비용을 포함한 몇 가지 단점이 있습니다. 오십 대의 PC는 현미경 스테이지 Vernier 캘리퍼로 신속하게 찾을 수 있습니다. BM 도말은 항응고제 BM 표본보다 훨씬 쉽게 얻을 수 있는데, 항응고된 BM을 얻기 위해서는 핵을 얻기 위한 복잡한 절차가 필요하기 때문이다. 따라서, 우리는 MM 세포의 검출을 위한 BM 도말 FISH에 대한 설득력 있는 방법을 확립하였다.
첫째, BM 얼룩은 숙련 된 형태 학적 분석가가 만들어야합니다. BM을 얼룩으로 퍼뜨리기 위해, 스프레더는 30°-45°의 각도로 흡인물 앞에 놓이고, 유체와 접촉하기 위해 뒤로 당겨진다11. 그런 다음, 스프레더는 일정한 움직임으로 균일하게 앞으로 움직입니다. BM 도말의 밀도는 길이가 슬라이드12의 대략 삼사분의 일이 되도록 조정되어야 합니다. BM 필름은 모든 가장자리의 셀을 감지할 수 있도록 슬라이드보다 좁아야 합니다13. 하이브리드화 영역의 선택과 PC의 현지화는 우리 프로토콜에서 매우 중요했으며, 이를 위해서는 숙련된 형태학적 분석가가 필요합니다. 더 적은 수의 PC를 포함하는 BM 스미어의 경우, 전방 형광 현미경 오일 침지 목표물과 목표 단계에서 Vernier 캘리퍼를 사용하여 PC를 현지화해야 하며, 단색 촬영으로 이미지를 촬영할 수 있습니다. 예를 들어, PC가 형태학적 검사에 의해 BM 필름에서 총 유핵세포의 3%만을 차지하는 경우, 8mm x 8mm의 잘 분산된 하이브리드 영역은 FISH 테스트를 위해 50대 이상의 PC를 포함해야 한다. FISH 혼성화 후, 최소 50대의 PC에서 형광 신호는 숙련된 분석가에 의해 계산되어야 합니다14.
그러나이 기술의 한계는 신선한 BM 얼룩에 대한 요구 사항입니다. BM 얼룩이 2 년 이상 저장되면 결과 FISH 이미지가 모호하여 오해가 발생할 수 있습니다.
종합하면, 상기 언급된 BM 도말 FISH는 BM 추출이 어렵거나 BM 드라이 탭이 발생할 때 혈액학적 악성 종양이 있는 환자에게, 심지어 유핵세포가 적은 저증식성 질환에서도 광범위하게 사용될 수 있다. 혈액학적 악성 종양을 앓고 있는 더 많은 환자들이 이 방법으로 혜택을 받을 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 WNLO 2018WNLOKF023의 혁신 기금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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