Interfase fluorescens in situ Hybridisering av benmargssmøring av flere myeloma
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å forbedre suksessen til interfase fluorescens in situ hybridiseringsdeteksjon på benmargssmør fra flere myelomapasienter.
Abstract
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) deteksjon er en uunnværlig metode i genetisk risikostratifisering i multippel myeloma (MM), som er en av de vanligste hematologiske maligniteter. Den identifiserende egenskapen til MM er akkumulerte ondartede plasmaceller i benmarg. FISH-rapporter for MM fokuserer hovedsakelig på rensede eller identifiserte kloniske plasmaceller, i stedet for alle nukleerte celler, ved å sortere med anti-CD138 magnetiske perler eller markere med cytoplasmatisk immunoglobulin lyskjede κ eller λ. Benmarg interfasekjerner er vanligvis hentet fra friske benmargsceller. Imidlertid krever tilfredsstillende berikelse av plasmacelleprøver store mengder fersk heparin antikoagulert benmarg, som ikke kan oppnås i tilfelle vanskelig benmargsutvinning eller en benmargstørr kran. Heri etablerer vi en ny metode for å forbedre suksessen med FISKEdeteksjon på fargede eller uoppdagede benmargssmør. Benmargssmør er lettere å oppnå enn antikoagulerte benmargsprøver.
Introduction
Multiple myeloma (MM) er en ondartet plasmacellesykdom (PC) med sterk biologisk heterogenitet og store individuelle forskjeller i klinisk effekt, med overlevelsesperioder fra måneder til tiår. Cytogenetiske egenskaper er viktige prognostiske indikatorer på MM. Risikostratifiseringssystemet og individualiserte behandlinger basert på genetiske egenskaper har blitt temaer av intens interesse for klinisk forskning på MM1. Avvikene av PCer testet i et fluorescens in situ hybridiseringspanel (FISH) av benmarg (BM) inkluderer del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) forsterkning/forsterkning og sletting av 1p (CDKN2C).
Standard metafasecytogenetikk bør inngå i den første vurderingen av MM-pasienter. Selv om konvensjonell G-banded karyotyping gir fordelen av en hel kromosomanalyse, fører det lave utbyttet av denne metoden til mange falske negative resultater2. Tradisjonelt har PCer blitt sett på som i stor grad ute av stand til å splitte fordi de er sluttfaseproduktene av B-lymfocyttdifferensiering. Dette gjør det vanskelig å få tak i delte bilder. Forbedret cytogenetisk analyse i MM med langsiktige kulturer (6 dager) og stimulering av kulturer ved cytokiner kan være en lovende metode for å identifisere cytogenetiske abnormiteter hos nylig diagnostiserte MM-pasienter3. Selv når kulturtiden ble forlenget til 6 dager, ble imidlertid cytogenetiske abnormiteter nøyaktig rapportert hos 30% -50% av MM-pasientene4. Videre er MM preget av komplekse cytogenetiske avvik som gjenspeiler dens prognostiske heterogenitet. Imidlertid er oppløsningen av tradisjonell kromosombåndteknologi lav, noe som lett kan føre til manglende påvisning av kromosomale abnormiteter i MM.
Interfase FISK, helst etter CD138-positiv magnetisk perlebasert PC-sortering eller merking med cytoplasmatisk immunoglobulin lyskjede κ/λ, er uunnværlig i analysen av MM5,6. En CD138-positiv utvalgt prøve anbefales på det sterkeste for det optimaliserte utbyttet av tumorceller. Imidlertid krever nøyaktig kvantisering av cytogenetiske avvik minst 4 ml antikoagulert BM for PC-sortering. I tillegg øker kombinasjonene av enten CD138 immunomagnetisk perlesortering med FISK eller cytoplasmatisk κ/λ lyskjedeimmunoglobulin med FISKE-testing (cIg-FISH) mange eksperimentelle kostnader og er tidkrevende.
Vanligvis vurderes PC-forholdet først fra den morfologiske undersøkelsen av fargede BM-smør eller BM biopsi seksjoner7,8. BM-prøver av høyeste kvalitet (første margaspiratprøver) brukes til morfologisk testing, mens de som sendes til FISK eller annen deteksjon ofte er sekundære aspiratprøver med høye forhold mellom fortynning og perifert blod.
Allerede på 1990-tallet viste flere studier at BM-smørere kan brukes direkte til interstitielle FISH-undersøkelser, som har vist seg å være en pålitelig og repeterbar metode9. En elegant studie basert på cellemorfologi og esterase cytokjemi kombinert med FISK av perifert blod og BM smører bekreftet sin store kliniske betydning for å belyse kromosomale abnormiteter hos pasienter med granulocytisk og lymfocytisk leukemi10.
Heri gir vi en ny metode for å forbedre suksessen til interfase FISKEdeteksjon hos MM-pasienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelsen av FISH til genetisk risikostratifisering i MM er avgjørende. Den kritiske delen av FISH-rapporter er ikke alle nukleerte celler, men kloniske PCer renset eller identifisert ved å sortere med anti-CD138 magnetiske perler eller merking med cytoplasmatisk immunoglobulin lyskjede κ eller λ. Interfase FISK etter PC-sortering eller cIg-FISH ble funnet å være signifikant i diagnosen MM på grunn av den relativt lavere andelen PCer i BM. Imidlertid har disse metodene noen mangler, inkludert komplekse prosesser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet av Innovasjonsfondet i WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma – A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry’s Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
