Interfase fluorescens in situ Hybridisering af knoglemarvsudstrygninger af myelomatose
Summary
Her præsenterer vi en protokol til forbedring af succesen med interfasefluorescens in situ-hybridiseringsdetektion på knoglemarvsudstrygninger fra myelomatosepatienter.
Abstract
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) detektion er en uundværlig metode i genetisk risikostratificering i multipelt myelom (MM), som er en af de mest almindelige hæmatologiske maligniteter. Den identificerende egenskab ved MM er akkumulerede maligne plasmaceller i knoglemarv. FISH-rapporter for MM fokuserer primært på oprensede eller identificerede klonale plasmaceller snarere end alle nukleerede celler ved at sortere med anti-CD138 magnetiske perler eller markere med cytoplasmatisk immunoglobulinlyskæde κ eller λ. Knoglemarvsinterfasekerner opnås normalt fra friske knoglemarvsceller. Tilfredsstillende berigelse af plasmacelleprøver kræver imidlertid store mængder frisk heparin antikoguleret knoglemarv, som ikke kan opnås i tilfælde af vanskelig knoglemarvsekstraktion eller en knoglemarvstørhane. Heri etablerer vi en ny metode til at forbedre succesen med FISH-detektion på farvede eller ufarvede knoglemarvsudtværinger. Knoglemarvsudstrygninger er lettere at opnå end antikoagulerede knoglemarvsprøver.
Introduction
Myelomatose (MM) er en ondartet plasmacellesygdom (PC) med stærk biologisk heterogenitet og store individuelle forskelle i klinisk effekt med overlevelsesperioder fra måneder til årtier. Cytogenetiske egenskaber er vigtige prognostiske indikatorer for MM. Risikostratificeringssystemet og individualiserede behandlinger baseret på genetiske egenskaber er blevet emner af intens interesse for klinisk forskning på MM1. Afvigelserne af pc’er, der er testet i et fluorescens in situ-hybridiseringspanel (FISH) af knoglemarv (BM), omfatter del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) forstærkning/forstærkning og 1p (CDKN2C) deletion.
Standard metafasecytogenetik bør indgå i den indledende vurdering af MM-patienter. Selvom konventionel G-båndet karyotyping giver fordelen ved en helkromosomanalyse, fører det lave udbytte af denne metode til mange falske negative resultater2. Traditionelt er pc’er blevet betragtet som stort set ude af stand til at opdele, fordi de er slutstadiet af B-lymfocytdifferentiering. Dette gør det vanskeligt at få opdelte billeder. Forbedret cytogenetisk analyse i MM med langtidskulturer (6 dage) og stimulering af kulturer med cytokiner kan være en lovende metode til at identificere cytogenetiske abnormiteter hos nydiagnosticerede MM-patienter3. Selv når dyrkningstiden blev forlænget til 6 dage, blev cytogenetiske abnormiteter imidlertid nøjagtigt rapporteret hos 30%-50% af MM-patienterne4. Desuden er MM karakteriseret ved komplekse cytogenetiske aberrationer, der afspejler dets prognostiske heterogenitet. Opløsningen af traditionel kromosombåndsteknologi er imidlertid lav, hvilket let kan føre til manglende påvisning af kromosomale abnormiteter i MM.
Interfase FISH, helst efter CD138-positiv magnetisk perlebaseret PC-sortering eller mærkning med cytoplasmatisk immunoglobulinlyskæde κ/λ, er uundværlig i analysen af MM5,6. En CD138-positiv udvalgt prøve anbefales kraftigt til det optimerede udbytte af tumorceller. Imidlertid kræver nøjagtig kvantation af cytogenetiske aberrationer mindst 4 ml antikoaguleret BM til pc-sortering. Derudover øger kombinationerne af enten CD138 immunomagnetisk perlesortering med FISH eller cytoplasmatisk κ/λ lyskædeimmunglobulin med FISH-test (cIg-FISH) adskillige eksperimentelle omkostninger og er tidskrævende.
Normalt vurderes PC-forholdet først ud fra den morfologiske undersøgelse af farvede BM-udstrygninger eller BM-biopsiafsnit7,8. BM-prøver af højeste kvalitet (første marvsaspiratprøver) anvendes til morfologisk testning, mens de, der sendes til FISH eller anden påvisning, ofte er de sekundære aspireringsprøver med høje fortyndingsforhold med perifert blod.
Allerede i 1990’erne viste flere undersøgelser, at BM-udstrygninger kan anvendes direkte til interstitielle FISH-undersøgelser, hvilket har vist sig at være en pålidelig og repeterbar metode9. En elegant undersøgelse baseret på cellemorfologi og esterasecytokemi kombineret med FISH af perifert blod og BM-udstrygninger bekræftede dens store kliniske betydning for belysning af kromosomale abnormiteter hos patienter med granulocytisk og lymfatisk leukæmi10.
Heri leverer vi en ny metode til forbedring af succesen med interfase FISH-detektion hos MM-patienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelsen af FISH til genetisk risikostratificering i MM er afgørende. Den kritiske del af FISH-rapporter er ikke alle nukleerede celler, men klonale pc’er, der specifikt er renset eller identificeret ved sortering med anti-CD138 magnetiske perler eller mærkning med cytoplasmatisk immunoglobulinlyskæde κ eller λ. Interfase FISH efter PC-sortering eller cIg-FISH viste sig at være signifikant ved diagnosen MM på grund af den relativt lavere andel af pc’er i BM. Disse metoder har dog nogle mangler, herunder komplek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev støttet af innovationsfonden for WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma – A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry’s Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
