Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Cellulære membranaffinitetskromatografikolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63118
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

Summary

Protokollen beskriver fremstillingen af cellemembranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner med immobiliserede cellemembranfragmenter indeholdende funktionelle transmembrantropomyosinkinasereceptor B-proteiner. Anvendelsen af CMAC-kolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med disse receptorer og er til stede i komplekse naturlige blandinger, forklares også.

Abstract

Kemikalier syntetiseret af planter, svampe, bakterier og marine hvirvelløse dyr har været en rig kilde til nye lægemiddelhits og bly. Lægemidler som statiner, penicillin, paclitaxel, rapamycin eller artemisinin, der almindeligvis anvendes i medicinsk praksis, er først blevet identificeret og isoleret fra naturlige produkter. Identifikation og isolering af biologisk aktive specialiserede metabolitter fra naturlige kilder er imidlertid en udfordrende og tidskrævende proces. Traditionelt isoleres og renses individuelle metabolitter fra komplekse blandinger efter ekstraktion af biomasse. Derefter testes de isolerede molekyler i funktionelle assays for at verificere deres biologiske aktivitet. Her præsenterer vi brugen af cellulære membranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner til at identificere biologisk aktive forbindelser direkte fra komplekse blandinger. CMAC-kolonner giver mulighed for identifikation af forbindelser, der interagerer med immobiliserede funktionelle transmembranproteiner (TMP'er) indlejret i deres oprindelige phospholipid-dobbeltlagsmiljø. Dette er en målrettet tilgang, som kræver, at man kender den TMP, hvis aktivitet man har til hensigt at modulere med den nyligt identificerede lægemiddelkandidat til små molekyler. I denne protokol præsenterer vi en tilgang til at forberede CMAC-kolonner med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til at samle CMAC-kolonnen med immobiliserede TrkB-receptorer ved hjælp af neuroblastomcellelinjer, der overudtrykker TrkB-receptorer. Vi præsenterer yderligere tilgangen til at undersøge kolonnens funktionalitet og dens anvendelse til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med TrkB-receptorer.

Introduction

Botaniske blandinger er rige på farmakologisk aktive forbindelser1, der tjener som en god kilde til identifikation af nye lægemiddelhits og fører 2,3,4,5. Opdagelsen af nye lægemidler fra naturlige produkter har været en frugtbar tilgang, og mange aktuelt godkendte lægemidler stammer fra forbindelser, der først blev identificeret i naturen. Den kemiske mangfoldighed af naturlige forbindelser er svær at matche af menneskeskabte biblioteker af kemisk syntetiserede molekyler. Mange naturlige forbindelser interagerer med og modulerer humane proteinmål og kan betragtes som evolutionært optimerede lægemiddellignende molekyler6. Disse naturlige forbindelser er særligt velegnede til identifikation af lægemiddellende til brug ved neurologiske lidelser6. To af de i øjeblikket FDA-godkendte lægemidler til behandling af Alzheimers sygdom (AD) er afledt af naturlige alkaloider, nemlig: galantamin og rivastigmin (et derivat af physostigmin)6. L-DOPA, i øjeblikket det mest almindeligt foreskrevne lægemiddel til Parkinsons sygdom, blev først identificeret fra den brede bønne (Vicia faba L.) 7. Pergolid og lisurid, dopaminerge receptoragonister er derivaterne af naturlige ergotalkaloider fra den parasitære svamp Claviceps purpurea8. Reserpin, et alkaloid isoleret fra indisk slangerod (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var et af de første antipsykotiske lægemidler9. For nylig har dysreguleret immunrespons og systemisk inflammation været forbundet med udviklingen af adskillige neurologiske lidelser, såsom større depressiv lidelse eller neurodegenerative sygdomme10. En plantebaseret kost sammen med andre livsstilsinterventioner har vist sig at forbedre kognitive og funktionelle evner hos ældre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Visse elektrofile molekyler, der tilhører triterpener og polyfenoler, har vist sig at modulere inflammatoriske reaktioner i både in vitro- og in vivo-modeller 12. For eksempel interfererer naturlige forbindelser indeholdende α.β-umættet carbonyl (f.eks. Curcumin, cinnamaldehyd) eller isothiocyanatgruppe (f.eks. Sulforafan) med Toll-lignende receptor-4 (TLR4) dimerisering, der hæmmer nedstrømssyntesen af proinflammatoriske cytokiner i en murininterleukin-3-afhængig pro-B-cellelinje12,22 . Epidemiologisk dokumentation peger stærkt på, at fytokemikalier i kosten, der findes i komplekse fødevarematricer, også kan udgøre en levedygtig kilde til nye lægemiddelledninger6.

En af de største hindringer for identifikationen af biologisk aktive molekyler i planteekstrakter, herunder plantebaserede fødevarer, er kompleksiteten af de undersøgte prøver. Traditionelt isoleres, renses de enkelte forbindelser og testes efterfølgende for biologisk aktivitet. Denne tilgang fører normalt til identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser. Fænotypiske lægemiddelopdagelsesmetoder uden et defineret molekylært mål er afhængige af biostyret fraktionering af komplekse blandinger23. I denne fremgangsmåde fraktioneres et ekstrakt i mindre komplekse underfraktioner, der efterfølgende testes i fænotypiske assays. Isolering og oprensning af aktive forbindelser styres af biologisk aktivitet verificeret i assayet. Kendskabet til identiteten af et specificeret lægemiddelmål kan i væsentlig grad fremskynde identifikationen af farmakologisk aktive forbindelser, der er til stede i komplekse blandinger. Disse tilgange er normalt baseret på immobilisering af det molekylære mål, for eksempel et enzym, på en fast overflade, som magnetiske perler23. De immobiliserede mål anvendes efterfølgende i screeningsforsøgene, hvilket resulterer i isolering af forbindelser, der interagerer med målet. Mens denne tilgang i vid udstrækning er blevet anvendt til identifikation af forbindelser rettet mod cytosoliske proteiner, er den blevet mindre almindeligt anvendt til identifikation af kemikalier, der interagerer med transmembranproteiner (TMP'er)23. En yderligere udfordring i immobiliseringen af TMP'er stammer fra det faktum, at proteinets aktivitet afhænger af dets interaktion med cellemembranphospholipider og andre molekyler i dobbeltlagstoget, såsom kolesterol23,24. Det er vigtigt at bevare disse subtile interaktioner mellem proteiner og deres oprindelige phospholipid dobbeltlagsmiljø, når man forsøger at immobilisere transmembranmålet.

I cellulær membranaffinitetskromatografi (CMAC) immobiliseres cellemembranfragmenter og ikke oprensede proteiner på de stationære fasepartikler af kunstig membran (IAM)23. IAM stationære faser fremstilles ved kovalent binding af phosphatidylcholinanaloger på silica. For nylig er der udviklet nye klasser af IAM stationære faser, hvor frie amin- og silanolgrupper er ende-capped (IAM. Personlig computer. DD2 partikler). Under CMAC-kolonnernes forberedelse immobiliseres cellemembranfragmenter på overfladen af IAM-partikler gennem adsorption.

CMAC-kolonner er blevet brugt til dato til at immobilisere forskellige klasser af TMP'er, herunder ionkanaler (f.eks. Nikotinreceptorer), GPCR'er (f.eks. Opioidreceptorer), proteintransportører (f.eks. P-glycoprotein) osv.24. De immobiliserede proteinmål er blevet anvendt til karakterisering af farmakodynamik (f.eks. dissociationskonstant, Kd) eller bestemmelse af bindingskinetik (kon og koff) af små molekyleligander, der interagerer med målet, samt i processen med identifikation af potentielle nye lægemiddelledninger, der er til stede i komplekse matricer24 . Her præsenterer vi forberedelsen af CMAC-kolonner med den immobiliserede tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser.

Tidligere undersøgelser viste, at aktiveringen af den hjerneafledte neurotrofiske faktor (BDNF) / TrkB-vej er forbundet med forbedring af visse neurologiske lidelser, såsom AD eller større depressiv lidelse 25,26,27,28. Det blev rapporteret, at BDNF-niveauer og dets receptor TrkB-ekspression falder i AD, og lignende reduktioner forringer hippocampus funktion i dyremodeller af AD29. Nedsatte niveauer af BDNF blev rapporteret i serum og hjerne hos AD-patienter 30,31,32. Tau-overekspression eller hyperphosphorylering viste sig at nedregulere BDNF-ekspression i primære neuroner og AD-dyremodeller 33,34,35. Derudover blev BDNF rapporteret at have beskyttende virkninger på β-amyloidinduceret neurotoksicitet in vitro og in vivo36. Direkte BDNF-administration i rottehjernen viste sig at øge indlæring og hukommelse hos kognitivt svækkede dyr37. BDNF / TrkB opstod som et gyldigt mål for at forbedre neurologiske og psykiatriske lidelser, herunder AD28,38. Målretning af BDNF/TrkB-signalvejen til udvikling af terapier i AD vil potentielt forbedre vores forståelse af sygdommen39. Desværre kan BDNF i sig selv ikke anvendes som behandling på grund af dets dårlige farmakokinetiske egenskaber og negative bivirkninger40. Små molekyleaktivatorer af TrkB / BDNF-veje er blevet undersøgt som potentielle TrkB-ligander 41,42,43. Blandt testede agonister med små molekyler har 7,8-dihydroxyflavon (7,8-DHF) vist sig at aktivere BDNF/TrkB-vejen 41,44,45,46. Et derivat af 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diylbis(methylcarbamat)) overvejes i øjeblikket som et muligt lægemiddel til AD47. For nylig blev det vist, at flere antidepressiva virker gennem direkte binding til TrkB og fremme af BDNF-signalering, hvilket yderligere understreger vigtigheden af at forfølge TrkB som et gyldigt mål til behandling af forskellige neurologiske lidelser48.

Protokollen beskriver processen med at samle funktionel TrkB-kolonne og TrkB-NULL negativ kontrolkolonne. Kolonnerne er karakteriseret ved hjælp af et kendt naturprodukt småmolekylær ligand: 7,8-DHF. Derudover beskriver vi processen med screening af komplekse matricer ved hjælp af planteekstrakt som et eksempel til identifikation af forbindelser, der interagerer med TrkB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur af SH-SY5Y neuroblastomceller (TrkB og TrkB-NULL (forældre) cellelinjer)

BEMÆRK: Cellelinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) og SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 blev købt hos Kerafast. Dyrkede celler anvendes som en kilde til de transmembranreceptorer, der skal immobiliseres til fremstilling af CMAC-kolonner. Følgende trin beskriver, hvordan man opnår cellemembranfragmenter og samler funktionelle CMAC-kolonner.

  1. Cellerne dyrkes i et cellekulturmedium fremstillet ved at blande 450 ml RPMI-medier, 50 ml FBS, 5 ml penicillin/streptomycinopløsning og 0,3 mg/ml geneticin (G418) i en 150 mm cellekulturskål ved 37 °C i en fugtig atmosfære med 5 % CO2.

2. Cellehøst

  1. Bekræft cellesammenløb (80% -90%) ved hjælp af et mikroskop, nået efter 3-4 dage efter cellepasning.
  2. Aspirer cellekultur medium ovenfra cellerne og vask cellerne to gange med fosfatbufret saltvand (PBS, 1x, pH 7,4). Fjern PBS og tilsæt 2 ml lavkoncentreret trypsin (0,25%) for at løsne celler.
  3. Hvirvl forsigtigt pladen for jævnt at dække alle cellerne med trypsinopløsning og inkuber cellerne i ca. 2 minutter ved 37 °C i en fugtig atmosfære med 5% CO2. Tilsæt 8 ml cellekulturmedium til løsrivelse af celler og overfør løsrevne celler til et 50 ml konisk rør og læg det på is.
  4. Brug et hæmocytometer til at estimere antallet af celler (ca. 3 x 107 celler). Bland cellesuspension ved pipettering op og ned for at opnå jævn celletæthed i blandingen. Placer 10 μL cellesuspension under dæksedlen, og tæl cellerne under et mikroskop ved hjælp af et 40x mål.

3. Cellehomogenisering

  1. Der fremstilles stamopløsninger af følgende proteasehæmmere: benzamidin (200 mM), phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 10 mM) og kommercielt tilgængelig proteasehæmmere cocktail (100x koncentration) indeholdende 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonylfluoridhydrochlorid (AEBSF), aprotinin, bestatin og leupeptin.
    FORSIGTIG: PMSF bør kun håndteres inde i stinkhætten.
    1. Forbered benzamidin stamopløsning (200 mM) ved at opløse 120 mg benzamidin i 5 ml ultrarent deioniseret vand. Opbevares ved 4 °C og anvendes inden for en dag. Frisk tilbered opløsning før hver brug (anbefales).
    2. PMSF-stamopløsning (10 mM) fremstilles ved at opløse 0,017 g PMSF i 10 ml ethanol. Opbevares ved - 20 °C.
    3. Forbered proteasehæmmercocktail (100x) ved at opløse kommercielt tilgængelig proteasehæmmerblanding i 1 ml ultrarent deioniseret vand. Bland grundigt og aliquot 200-300 μL af cocktailen og opbevar ved - 20 °C før brug.
  2. Forbered ATP-stamopløsning (100 mM) ved at opløse 55.114 mg ATP-dinatriumsalthydrat i 1 ml deioniseret ultrarent vand. Blandingen blandes grundigt og alikvotes 100 μL og opbevares ved - 20 °C inden brug.
  3. Forbered buffer ved at opløse 3,03 g tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCI, 50 mM), 2,9 g natriumchlorid (NaCl, 100 mM), 0,22 g calciumchlorid vandfrit (CaCl2, 3 mM), 0,2 g magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2, 2 mM) og 0,19 kaliumchlorid (KCl, 5 mM) i 500 ml ultrarent deioniseret vand.
  4. Homogeniseringsbufferen fremstilles ved at blande 17,3 ml af bufferen fremstillet i trin 3,3 med 0,3 ml (3 mM) benzamidinstamopløsning, 0,2 ml (0,1 mM) PMSF-stamopløsning, 0,2 ml proteasehæmmercocktailblanding, 20 μL (100 μM) ATP-stamopløsning, 2 ml (10 %) glycerol og 0,029 g (5 mM) EDTA (tabel 1). Juster pH til 7,4 ved hjælp af saltsyreopløsning.
  5. Spin ned cellerne høstet i trin 2,3 ved 4 ° C i 5 minutter ved 400 x g. Fjern supernatanten og vask den resterende cellepille med 10 ml iskold PBS (1x, pH 7,4). Spin ned cellerne igen ved 4 ° C i 5 minutter ved 400 x g.
  6. Kassér supernatanten, og erstat den med 20 ml homogeniseringsbuffer fremstillet i trin 3.4. Placer det koniske rør på is.
  7. Overfør cellesuspensionen til en 40 ml Dounce homogenisatorvævskværn og læg den på is. Homogeniser suspensionen manuelt på is ved hjælp af 40 op-og-ned-pestleslag. Overfør homogeniseret cellesuspension til et 50 ml konisk rør.
  8. Homogenatet centrifugeres ved 4 °C i 7 minutter ved 400 x g. Pillen kasseres, og supernatanten overføres til et nyt konisk rør og centrifugeres ved 4 °C i 30 minutter ved 47900 x g. Gem cellemembranpillen og kassér supernatanten.

4. Cellemembranopløselighed

  1. Opløselighedsbufferen fremstilles ved at blande 8,7 ml af bufferopløsningen fremstillet i trin 3,3 med 0,1 ml (0,1 mM) PMSF-stamopløsning, 0,15 ml (3 mM) benzamidinstamopløsning, 0,1 ml proteasehæmmercocktail, 10 μL (100 μM) ATP-stamopløsning, 1 ml (10 %) glycerol og 0,2 g (2 %) natriumcholat (tabel 2).
  2. Overfør opløselighedsbufferen til det koniske rør med cellemembranfragmenter opnået i trin 3.8 og resuspend pelleten. Drej den resulterende blanding ved 150 o / min ved 4 ° C i 18 timer.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan eksperimentet sættes på pause for cellemembranpilleopløselighed natten over.

5. Cellemembran immobilisering på IAM. Personlig computer. DD2 partikler

  1. Efter 18 timer centrifugeres opløselighedsblandingen ved 4 °C i 30 minutter ved 47900 x g.
  2. Opbevar supernatanten og kassér pelleten. Tilsæt 100 mg IAM. Personlig computer. DD2-partikler til supernatanten hvirvler og roterer den resulterende suspensionsblanding ved 150 o / min ved 4 ° C i 1 time.
  3. For at lette immobiliseringen af cellemembranfragmenter på IAM. Personlig computer. DD2-partikler fortsætter til dialysetrinnet som beskrevet nedenfor.
    1. Forbered dialysebuffer i 4 liter ultrarent deioniseret vand ved at tilsætte 24 g tris-HCI (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 gCaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) og 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabel 3).
      BEMÆRK: PMSF er ikke opløseligt i vand, derfor opløses det først i lille volumen ethanol og tilsættes derefter langsomt i bægerglasset med bufferen.
    2. Juster pH til 7,4 med saltsyreopløsning. Bufferen anbringes ved 4 °C i mindst 1 time, inden bufferen fortsættes til dialysetrinnet.
    3. Forbered dialyserør ved at skære 10 cm cellulosemembrandialyseslange (10 K MWCO, 35 mm) og overfør suspensionen indeholdende IAM. Personlig computer. DD2-partikler og cellemembranfragmenter ind i dialyserøret. Brug dialyseslangeklip til at lukke begge ender af dialyserøret.
    4. Anbring dialyserøret, der indeholder IAM. Personlig computer. DD2 stationær fase i dialysebufferen og dialysere ved 4 °C i 24 timer under forsigtig omrøring.
    5. Efter 24 timer anbringes dialyseslangen i den frisklavede dialysebuffer og fortsætter dialysen i yderligere 24 timer.

6. Pakning af CMAC-kolonner

  1. Forbered ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4), der skal bruges til at vaske IAM. Personlig computer. DD2-partikler og i kolonnekarakteriseringsforsøg ved at opløse 0,7708 g ammoniumacetat i 1 liter ultrarent deioniseret vand. Juster pH til 7,4 med saltsyreopløsning.
  2. Efter 48 timers dialyse fjernes dialyserøret fra dialysebufferen og overføres indholdet af dialyserøret til et 15 ml konisk rør.
  3. Blandingen centrifugeres ved 4 °C i 5 minutter ved 400 x g. Supernatanten kasseres, og den resterende pellet vaskes tre gange med 10 ml ammoniumacetatbuffer, idet blandingen centrifugeres ved 4 °C i 5 minutter ved 400 x g efter hver vask.
  4. Efter den tredje vask suspenderes den resterende pellet i 1 ml ammoniumacetatbuffer. Bland det grundigt og brug den resulterende opslæmning til at pakke 5/20 glassøjlen for at give CMAC-kromatografikolonnen.
  5. For at pakke kolonnen skal du først placere et bundfilter, der tidligere er gennemblødt med ammoniumacetatbuffer, i filterholderen. Monter filterholderen i glassøjlen, og skru søjlehætten for at sikre holderens position. Placer søjlen lodret i en fingerklemme, og fastgør den i laboratoriestativet. Anbring et bægerglas under kolonnen.
  6. Ved hjælp af en enkeltkanals pipettor overføres et lille volumen af opslæmningen opnået i trin 6.4 til glassøjlen. Hæld materialet langsomt og hold pipettespidsen mod glassøjlevæggen. Lad emballagematerialet sætte sig, inden du hælder endnu et volumen gylle.
  7. For at fremskynde pakningsprocessen skal du fjerne bufferen ovenfra det stationære bed ved hjælp af en mikropipette mellem hvert trin. Gentag disse trin, indtil 1 ml af gyllen er pakket.
  8. Anbring et topfilter, og skru adapterenheden, så der ikke er nogen resterende buffer over den stationære fase, som vist i figur 1. Fastgør adapterenhedens position med adapterlåsen.
  9. Tilslut søjlen til en højtydende væskekromatografipumpe (HPLC), indstil strømningshastigheden til 0,2 ml/min., og vask søjlen natten over med ammoniumacetatbuffer. Kolonnen er nu klar til karakteriseringstrinnet. Kolonnen opbevares ved 4 °C indtil brug.
    BEMÆRK: Ved længere opbevaring (kolonne må ikke anvendes i mere end en uge) køres kolonnen med 0,05 % natriumazidopløsning i ammoniumacetatbufferen og opbevares ved 4 °C.
    FORSIGTIG: Natriumazid er meget giftigt, når det indtages oralt eller absorberes gennem huden; det bør kun håndteres under stinkhætten. Sørg for at bære en laboratoriefrakke, sikkerhedsbriller og handsker (nitril foretrækkes), når du arbejder med natriumazid.

7. Karakterisering af CMAC-kolonne

  1. Konfokal mikroskopi og BDNF-binding
    1. Forbered IAM. Pcc. DD2 stationære fasepartikler med immobiliserede cellemembranfragmenter opnået separat fra SH-SY5Y neuroblastomceller, der overudtrykker TrkB- og SH-SY5Y TrkB-NULL-celler ved at følge instruktionerne fra trin 1 til trin 6.4.
    2. For prøver, der vil blive inkuberet med BDNF før antistoffarvning, fremstilles BDNF-stamopløsning ved at opløse 10 μg BDNF i 100 μL ultrarent deioniseret vand. Opløsningen opbevares ved -20 °C.
      1. Overfør i separate 1,5 ml mikrocentrifugerør, 100 μL alikvot IAM. Personlig computer. DD2-kolonnepakningsmateriale med immobiliserede SH-SY5Y neuroblastomceller, der overudtrykker TrkB og 100 μL aliquot af IAM. Personlig computer. DD2-kolonnepakningsmateriale med immobiliserede SH-SY5Y TrkB-NULL-celler suspenderet i ammoniumacetatbuffer.
      2. Der tilsættes 390 μL ammoniumacetatbuffer, 10 μL BDNF-stamopløsning og 0,5 μL ATP-stamopløsning (fremstillet i trin 3.2) i hvert rør og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med gynge.
    3. For prøver, der ikke vil blive inkuberet med BDNF før antistoffarvning, overføres 100 μL alikvote IAM. Personlig computer. DD2-søjlepakningsmateriale med immobiliserede SH-SY5Y Neuroblastomceller, der overudtrykker TrkB suspenderet i ammoniumacetat i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    4. Der tilsættes 400 μL ammoniumacetatbuffer og 0,5 μL ATP-stamopløsning (fremstillet i trin 3.2) i hvert rør og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med gynge.
    5. Prøverne fremstillet i trin 7.1.2 og 7.1.4 cent centrifugeres ved 1 min. ved 10.000 x g , og supernatanten kasseres.
    6. De resulterende pellets vaskes med 500 μL ammoniumacetatbuffer i 10 minutter og centrifugeres igen ved 4 °C i 1 min ved 10.000 x g og kasseres supernatanten.
    7. Til hver af pellets tilsættes 220 μL ammoniumacetatbuffer, 25 μL 10% normalt gedeserum og 5 μL primært anti-BDNF-antistof. Inkuber i et koldt rum (4 °C) natten over med gyngen.
    8. Efter afslutningen af inkubationstrinnet drejes blandingen i 1 min. ved 10.000 x g ved 4 °C og kasseres supernatanten.
    9. Den resulterende pellet vaskes 3 gange med ammoniumacetatbuffer indeholdende 1% mildt vaskemiddel (f.eks. natriumchonat) i 10 minutter, og blandingerne centrifugeres i 1 min ved 10.000 x g ved 4 °C og kasseres supernatanten.
    10. Sekundær antistofopløsning fremstilles ved at blande 900 μL ammoniumacetatbuffer, 100 μL 10 % normalt gedeserum og 1 μL fluoroforkonjugeret sekundært antistof (1:1.000 fortynding). Der tilsættes 300 μL sekundær antistofopløsning til hver af de pellets, der er opnået i trin 7.1.9. og inkubere natten over ved 4 ° C med rocking.
    11. Blandingen centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
    12. Den resulterende pellet vaskes 3 gange med ammoniumacetatbuffer indeholdende 1% mildt vaskemiddel (f.eks. natriumchonat) i 10 minutter, og blandingen centrifugeres i 1 min ved 10.000 x g ved 4 °C og kasseres supernatanten.
    13. Resuspend de resulterende pellets i 50 μL ammoniumacetatbuffer. Anbring 20 μL af hver af blandingerne på et dias og dæk med en dækseddel.
    14. Billede IAM. Personlig computer. DD2-partikler med de immobiliserede cellemembranfragmenter ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop med excitation ved 488 nm og emission ved 520 nm genereret ved hjælp af et solid state-lasersystem. Brug et 20x mål med en NA på 0,75 og WD på 0,35 mm.
  2. Frontal affinitetskromatografi ved anvendelse af 7,8-DHF som markørligand
    1. Tilslut en CMAC-søjle til et HPLC-system med en diode-array-detektor og/eller massespektrometer.
    2. Der fremstilles 500 ml 1 mM opløsning af 7,8-DHF i ammoniumacetatbuffer indeholdende 5 % methanol.
    3. Pumpens konstante koncentration af markørliganden (1 mM) gennem CMAC-kolonnen ved 0,4 ml/min. strømningshastighed ved stuetemperatur. Overvåg elueringsprofilen ved hjælp af enten en DIODE ARRAY DETECTION (DAD) (bølgelængde 254 nm) detektor eller massespektrometer (brug enkeltionovervågningstilstand; m/z 253 i negativ ioniseringstilstand).
    4. Efter afslutningen af kørslen udføres vask natten over ved at køre ammoniumacetatbuffer gennem søjlen.
    5. Gentag trin 7.2.2. - 7.2.4. ved hjælp af forskellige koncentrationer af markørliganden (750 nM, 500 nM, 300 nM), vask af søjlerne natten over efter hvert løb. Brug frontal affinitetskromatografi til at beregne ligand Kd, som gennemgået detaljeret, andetsteds. 24,51
  3. Forskydningsundersøgelser med Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) ekstrakt
    1. Der fremstilles 500 ml 500 nM opløsning af 7,8-DHF i ammoniumacetatbuffer indeholdende 5 % methanol og 0,2 % vandig gotu kola-ekstrakt (10 mg/ml).
    2. Pump konstant koncentration af markørliganden (500 nM) med ekstraktet gennem søjlen ved 0,4 ml/min strømningshastighed ved stuetemperatur. Overvåg elueringsprofilen ved hjælp af enten en DAD-detektor (bølgelængde 254 nm) eller et massespektrometer (brug enkeltionovervågningstilstand; m/z 253 i negativ ioniseringstilstand).
    3. Efter afslutningen af kørslen udføres vask natten over ved at køre ammoniumacetatbuffer gennem søjlen.
    4. Plot elueringsprofilerne for 500 nM 7,8-DHF og den, der er opnået efter at have kørt opløsningen med gotu kola-ekstrakt for at inspicere for markørligandforskydning.

8. Manglende peak kromatografi tilgang til at identificere potentielle TrkB bindemidler fra gotu kola ekstrakt

  1. Fraktionering af gotu kola ekstrakt på CMAC kolonner
    1. Tilslut CMAC TrkB- og TrkB-NULL-kolonnerne separat til et HPLC-system, og injicer 50 μL af det vandige gotu kola-ekstrakt (10 mg/ml) på hver af kolonnerne. Pumpammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) indeholdende 5 % methanol gennem kolonnen ved 0,4 ml/min. strømningshastighed ved stuetemperatur.
    2. Saml fraktioner separat fra CMAC TrkB og TrkB-NULL kolonner som følger: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
    3. Frys og lyofiliser de opnåede fraktioner. Resuspend lyofiliserede fraktioner i 50 μL methanol, inden du fortsætter til ultra-performance væskekromatografi og massespektrometrianalyse.
  2. Ultra-performance væskekromatografi quadrupole time-of-flight massespektrometri (UPLC-QTOF-MS) analyse af gotu kola CMAC fraktioner
    1. Alle fraktionerne i punkt 8.1.3 analyseres. ved hjælp af et massespektrometer kombineret med et UPLC-system (UPLC-MS E-analysetilstand). Analyser fraktionerne ved hjælp af en C18-kolonne (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) med en C18 VanGuard-forsøjle (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
    2. Eluter kolonnen ved hjælp af følgende gradientopløsninger ved en strømningshastighed på 0,3 ml/min med mobil fase A (vand med 0,1% myresyre) og B (acetonitril med 0,1% myresyre): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
    3. Indstil injektionsvolumenet for hver prøve til 3 μL. Udfør MSE i opløsning positive og negative iontilstande med kollisionsenergi ved 4V for lav energi og 20-35 V for høj energi.
    4. Brug følgende ESI-kildebetingelser i positiv ioniseringstilstand: kapillærspænding 1,5 kV, prøveudtagningskegle 40 V, kildeforskydning 80, kildetemperatur 100 °C, isoleringstemperatur 350 °C, keglegasstrøm 38,0 L/t, desolvationsgas 400 L/h.
    5. Brug følgende ESI-kildebetingelser i negativ ioniseringstilstand: kapillærspænding 1,45 kV, prøveudtagningskegle 40 V, kildeforskydning 80, kildetemperatur 110 °C, isoleringstemperatur 300 °C, keglegasstrøm 50,0 l/t, desolvationsgasstrøm 652 l/t.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokollen blev to CMAC-kromatografiske kolonner samlet: en med de immobiliserede SH-SY5Y neuroblastomcellemembranfragmenter med overudtrykt TrkB og en med SH-SY5Y TrkB-NULL cellemembranfragmenter. Den korrekt monterede CMAC-kolonne er vist i figur 1, og de trin, der er involveret i immobilisering af cellemembranfragmenter, er vist i figur 2.

Siden immobiliseringen af TrkB-receptorer på IAM. Personlig computer. DD2 kromatografisk stationær fase var ikke blevet forsøgt før, den vellykkede immobilisering af receptorerne blev bekræftet ved antistoffarvning og frontal affinitetskromatografi ved anvendelse af en markørligand: 7,8-DHF. En skematisk repræsentation af antistoffarvningseksperimentet er vist i figur 2. Cellemembranfragmenter opnået fra neuroblastomcellelinje, der overudtrykker TrkB-receptorer og cellemembranfragmenter fra forældrenes cellelinje uden TrkB-receptorer (TrkB-NULL)) blev immobiliseret på IAM. Personlig computer. DD2-partikler ved hjælp af den optimerede protokol. Derefter blev partiklerne med immobiliserede cellemembranfragmenter inkuberet med BDNF (fysiologisk ligand) og derefter med primære og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer (figur 2). Iam. Personlig computer. DD2-partikler med immobiliserede neuroblastom TrkB-cellemembranfragmenter og i nærvær af BDNF resulterede i fluorescerende mærkede partikler (figur 3C). Der blev ikke observeret fluorescens (bortset fra svag baggrundsfluorescens), når TrkB-NULL-cellemembranindkapslede IAM-partikler blev undersøgt (figur 3A), eller når der ikke blev anvendt BDNF i tilfælde af TrkB-cellemembranindkapslede IAM-partikler (figur 3B).

For at karakterisere bindingen af en lille markørligand (7,8-DHF) til de immobiliserede TrkB-receptorer blev frontal affinitetskromatografi udført med forskellige koncentrationer på 7,8-DHF. Et typisk kromatogram med stigende 7,8-DHF-koncentrationer på en funktionel CMAC-kolonne er vist i figur 4. Specifik binding af 7,8-DHF til den immobiliserede TrkB blev bekræftet af de koncentrationsafhængige fald i retentionstiden for markørliganden. Frontal affinitetskromatografiresultater opnået på en ikke-funktionel CMAC-kolonne er vist i figur 5. Manglen på koncentrationsafhængige ændringer i tilbageholdelsen af markørliganden indikerer det mislykkede forsøg på CMAC-forberedelse.

Forbindelser, der injiceres på CMAC-kolonnen, interagerer ikke kun specifikt, men kan også ikke-specifikt interagere med IAM. Personlig computer. DD2-partikler, phospholipid-dobbeltlag af de immobiliserede cellemembranfragmenter og andre proteiner, der er til stede i dobbeltlagstoget. For at udelukke forbindelser, der ikke specifikt interagerer med CMAC-kolonnen under screeningsprocessen af komplekse ekstrakter for TrkB-bindemidler, er det vigtigt at forberede CMAC-negativ kontrolkolonne ved at immobilisere cellemembranfragmenter af forældrecellelinjen, der ikke udtrykker det målrettede protein (i dette tilfælde TrkB-NULL). Frontal affinitetskromatografiresultater opnået på en negativ CMAC TrkB-NULL-kolonne er vist i figur 6.

Funktionelle CMAC-kolonner kan bruges til forskellige formål, såsom karakterisering af det målrettede protein, undersøgelse af interaktioner mellem individuelle forbindelser med de immobiliserede mål (f.eks. Opnåelse af dissociationskonstant, Kd) eller bestemmelse af bindingskinetik (ktil og fra) osv.24. Kolonnerne kan også bruges til at screene komplekse prøver, såsom planteekstrakter for tilstedeværelsen af forbindelser, der binder til TrkB-receptorer, og derfor potentielt indeholder molekyler, der fungerer som TrkB-agonister eller antagonister. For at kontrollere, om et ekstrakt potentielt indeholder forbindelser, der interagerer med de immobiliserede receptorer, udføres et simpelt forskydningseksperiment. Resultatet af konkurrenceeksperimentet udført med gotu kola-ekstrakt og 500 nM 7,8-DHF på en funktionel TrkB-kolonne er vist i figur 7. Tilsætningen af 0,2 % vandig gotu kola-ekstrakt (10 mg/ml) resulterede i en signifikant reduktion på 7,8-DHF-retention, hvilket indikerer tilstedeværelsen af konkurrerende ligand(er) for agonistbindingsstedet. Resultatet af forskydningseksperimentet udført på cmac-negative TrkB-NULL-kolonnen er vist i figur 8. Den manglende reduktion af 7,8-DHF-retention på denne kolonne bekræfter yderligere manglen på funktionelle TrkB-receptorer på CMAC TrkB-NULL-kolonnen.

For at identificere specialiserede metabolitter, der specifikt interagerer med de immobiliserede mål, anvendes CMAC-kolonner i en tilgang kaldet manglende topkromatografi52 efter forskydningseksperimentet. I denne fremgangsmåde kromatograferes et lille volumen af det undersøgte ekstrakt parallelt på kolonnen, der indeholder det undersøgte immobiliserede mål og CMAC-negative kontrolkolonne. Disse to kolonner adskiller sig i udtrykket af målet, derfor skyldes eventuelle forskelle i retentionsmønstrene for individuelle molekyler den specifikke karakter af interaktioner med de undersøgte mål på CMAC-kolonnen, der indeholder disse TMP'er. Tidsinddygtige fraktioner fra begge kolonner indsamles, koncentreres og analyseres efterfølgende på en C18-kolonne. De opnåede kromatogrammer sammenlignes, og forbindelser repræsenteret af toppe, der ligeledes bevares på begge kolonner, mærkes som ikke-specifikt interagerende molekyler. Tilstedeværelsen af en top i senere fraktioner på CMAC-kolonnen med de immobiliserede receptorer og manglen på en top, der repræsenterer den samme forbindelse i tidlige fraktioner af CMAC-negativ kolonne, repræsenterer specifik interaktion mellem forbindelsen og det immobiliserede mål. De forbindelser, der er identificeret i dette trin, kan målrettes til isolering og yderligere testning uden behov for at udføre biostyret fraktionering. Den manglende peak kromatografi tilgang blev brugt til at identificere forbindelser, der specifikt interagerer med TrkB receptorer fra gotu kola ekstrakt. Gotu kola-ekstrakt blev fraktioneret på både TrkB- og TrkB-NULL-kolonner, og forbindelser, der var til stede i disse fraktioner, blev analyseret under anvendelse af UPLC-QTOF-MS. Undersøgelse af kromatogrammerne for hver af fraktionerne førte til identifikation af en forbindelse, der var stærkt bevaret på TrkB-kolonnen (50-55 min fraktion), mens den eluerede tidligt på TrkB-NULL-kolonnen (0-5 min fraktion), hvilket indikerer specifik interaktion med de immobiliserede TrkB-receptorer (figur 9). Forbindelsen, der eluerer ved ~ 17,48 min (figur 9), er nu målrettet mod isolering og test i funktionelle assays.

Figure 1
Figur 1. Korrekt monteret CMAC-kolonne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. CMAC-forberedelsestrin og fluorescerende antistofmærkning af de immobiliserede receptorer. Skematisk repræsentation af fremstillingen af en CMAC-kolonne (1-4) og antistofmærkningseksperimentet (5-8). (1) Homogeniserede cellemembranfragmenter indeholdende målrettet transmembranprotein, TrkB. (2) Opløselige cellemembranfragmenter i en micellær struktur. (3) Cellemembranfragmenter immobiliseret på overfladen af IAM-partiklerne. (4) IAM-partikler med immobiliserede cellemembranfragmenter pakket ind i en glassøjle. (5) Immobiliseret TrkB-receptor i cellemembranfragmenterne. (6) Binding af den naturlige ligand BDNF til den funktionelle TrkB-receptor. (7) Binding af de primære antistoffer mod BDNF-molekyler. (8) Binding af fluoroformærkede sekundære antistoffer til de primære antistoffer, hvilket resulterer i grøn fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Immobilisering af cellemembranfragmenter med TrkB-receptorer på IAM-partikler. Konfokale mikroskopibilleder, der viser immobilisering af cellemembranfragmenter med funktionelle TrkB-receptorer på IAM-partikler. (A) Cellemembranfragmenter fra SH-SY5Y TrkB-NULL-cellelinje immobiliseret på IAM-partikler efter inkubation med BDNF, primært antistof og fluoroformærket sekundært antistof. (B) Cellemembranfragmenter fra SH-SY5Y Neuroblastomcellelinjer, der udtrykker TrkB immobiliseret på IAM-partikler efter inkubation med primært antistof og fluoroformærket sekundært antistof uden BDNF. (C) Cellemembranfragmenter fra SH-SY5Y neuroblastomcellelinjer, der udtrykker TrkB immobiliseret på IAM-partikler efter inkubation med BDNF, primært antistof og fluoroformærket sekundært antistof. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Frontal affinitetskromatogrammer på 7,8-DHF på TrkB CMAC-kolonnen. Frontalt kromatogram med stigende koncentrationer på 7,8-DHF på TrkB CMAC-kolonnen, hvor A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM og D - 300 nM. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% methanol blev anvendt som eluent ved en strømningshastighed på 0,4 ml/min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Frontal affinitetskromatogrammer på 7,8-DHF på ikke-funktionel TrkB CMAC-kolonne. Frontalt kromatogram med forskellige koncentrationer på 7,8-DHF på den ikke-funktionelle TrkB CMAC-kolonne, hvor A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 nM og D - 500 nM. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% methanol blev anvendt som eluent ved en strømningshastighed på 0,4 ml/min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Frontal affinitetskromatogrammer på 7,8-DHF på TrkB-NULL CMAC-kolonnen. Frontalt kromatogram med stigende koncentrationer på 7,8-DHF på TrkB-NULL CMAC-kolonnen, hvor A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM og D - 300 nM. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5 % methanol blev anvendt som eluent ved en strømningshastighed på 0,4 ml/min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Frontal affinitetskromatogrammer af 7,8-DHF med 0,2% gotu kola ekstrakt på TrkB CMAC-kolonnen. Repræsentativ frontal elueringsprofil for (A) 500 nM 7,8-DHF + 0,2 % gotu kola-ekstrakt (10 mg/ml) og (B) 500 nM 7,8-DHF på CMAC TrkB-kolonnen. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% methanol blev anvendt som eluent ved en strømningshastighed på 0,4 ml/min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8. Frontal affinitetskromatogrammer af 7,8-DHF med 0,2% gotu kola ekstrakt på TrkB-NULL CMAC kolonnen. Repræsentativ frontal elueringsprofil for (A) 500 nM 7,8-DHF og (B) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% gotu kola-ekstrakt (10 mg/ml) på TrkB-NULL CMAC-kolonnen. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% methanol blev anvendt som eluent ved en strømningshastighed på 0,4 ml/min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9. UPLC-MS-kromatogrammer af gotu kola-ekstraktfraktioner. UPLC-MS-kromatogrammer af gotu kola-ekstraktfraktioner (A) elueret mellem 0-5 minutter fra TrkB-NULL CMAC-kolonnen og (C) elueret mellem 50-55 minutter fra CMAC TrkB-kolonnen. En forbindelse med en retentionstid på 17,48 minutter til stede i begge fraktioner, som bekræftet af matchende massespektre (B og D), blev identificeret som et potentielt TrkB-bindemiddel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Homogeniseringsbuffer
1 Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCI) 50 mM
2 Natriumchlorid (NaCl) 100 mM
3 Vandfrit calciumchlorid (CaCl2) 3 mM
4 Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2) 2 mM
5 Kaliumchlorid (KCl) 5 mM
6 Phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) 0,1 mM
7 Benzamidin 3 mM
8 Proteasehæmmer cocktail (100X) (1/100)
9 Glycerol 10%
10 Adenosin 5'-triphosphat (ATP) dinatriumsalthydrat 100 μM
11 Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) 5mM

Tabel 1. Homogeniseringsbuffersammensætning.

Opløselighedsbuffer
1 Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCI) 50 mM
2 Natriumchlorid (NaCl) 100 mM
3 Vandfrit calciumchlorid (CaCl2) 3 mM
4 Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2) 2 mM
5 Kaliumchlorid (KCl) 5 mM
6 Phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) 0,1 mM
7 Benzamidin 3 mM
8 Proteasehæmmer cocktail (100X) (1/100)
9 Glycerol 10%
10 Adenosin 5'-triphosphat (ATP) dinatriumsalthydrat 100 μM
11 Natriumkolat 2%

Tabel 2. Opløselighedsbuffersammensætning.

Dialyse buffer
1 Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCI) 50 mM
2 Natriumchlorid (NaCl) 100 mM
3 Vandfrit calciumchlorid (CaCl2) 0,1 mM
4 Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) 5 mM
5 Phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) 0,1 mM

Tabel 3. Dialysebuffersammensætning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifikation af aktive forbindelser til stede i komplekse blandinger af specialiserede metabolitter er en meget udfordrende opgave23. Traditionelt isoleres individuelle forbindelser, og deres aktivitet testes i forskellige assays. Denne fremgangsmåde er tidskrævende og dyr og fører ofte til isolering og identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser23. I øjeblikket anvendes screeningsassays med høj kapacitet og er stærkt afhængige af screening af kombinatoriske kemibiblioteker med allerede kendte mål og er ikke designet til at identificere og isolere biologisk aktive forbindelser, der er til stede i komplekse blandinger53.

CMAC gør det muligt at identificere forbindelser, der er rettet mod TMP'er 23,24,54. I denne teknik immobiliseres cellemembranfragmenter med TMP'er på overfladen af IAM stationære fasepartikler23,24. CMAC er en unik tilgang, der muliggør immobilisering af cellemembranfragmenter med målrettede proteiner på den faste støtte, der efterligner cellemembranphospholipid dobbeltlag24. Dette gør det muligt at bevare funktionaliteten af immobiliserede proteinmål og giver tæt på fysiologiske forhold, samtidig med at CMAC anvendes til at identificere små molekyler, der interagerer med TMP'er. CMAC giver fordelen ved opdagelse af nye kemiske stilladser fra unikke naturlige produktbiblioteker, der ikke kan testes ved hjælp af andre af de aktuelt anvendte assays23 . Den foreslåede tilgang gør det muligt at identificere forbindelser, der interagerer med TMP'er, uden at afsløre arten af denne interaktion. Interaktionsmåden (allosterisk eller ortosterisk interaktion; hæmning eller aktivering) skal verificeres ved hjælp af funktionelle cellebaserede assays. CMAC med de immobiliserede proteinmål kan også anvendes til karakterisering af farmakodynamik (f.eks. dissociationskonstant, Kd) eller bestemmelse af bindingskinetik (ktil ogfra) af små molekyleligander, der interagerer med målet, samt i processen med karakterisering af bindingsstederne på det immobiliserede protein24 . Selvom CMAC kun tillader identifikation af forbindelser, der binder til TMP'er, er det en innovativ tilgang, der væsentligt fremskynder det første skridt i lægemiddelopdagelsesrørledningen, da det ikke kræver sammensat oprensning, som i øjeblikket har været den største flaskehals i lægemiddelopdagelsesprocessen fra naturlige blandinger.

Selvom den præsenterede protokol fokuserer på immobilisering af en transmembranreceptor (TrkB), kan CMAC-teknologi anvendes til fremstilling af kolonner med andre mål. Et af de afgørende aspekter af CMAC-præparat er valget af cellelinje eller væv, der bruges til at isolere cellemembranfragmenter. Hvis kolonner anvendes til screening af komplekse blandinger for forbindelser, der interagerer med de immobiliserede receptorer, anbefales det at anvende cellelinjer, der overudtrykker det målrettede protein. Anvendelse af en sådan cellelinje vil resultere i et højere antal immobiliserede mål og øge chancen for identifikation af forbindelser med en lavere affinitet mod målet eller mindre rigelige molekyler. Hvis man fokuserer på karakteriseringen af det immobiliserede protein, anbefales brugen af en indfødt cellelinje, da posttranslationelle modifikationer, proteinet gennemgår, såvel som phospholipidmiljøet, kan afvige væsentligt i den transfekterede cellelinje.

Nogle aspekter af cellemembranisolering og immobilisering på IAM-partikler er kritiske og kan kræve ændringer afhængigt af receptortypen eller proteinkilden. For at forhindre proteolytisk spaltning af de immobiliserede proteiner er det vigtigt at anvende korrekte proteasehæmmere i homogeniserings- og opløselighedsbufferne. En litteratursøgning anbefales for at identificere nødvendige proteasehæmmere. I processen med protokoloptimering fastslog vi, at tilsætningen af ATP og glycerol øger antallet af bindingssteder (Bmax) på CMAC-kolonner ved immobilisering af TrkB. Andre cofaktorer kan være nødvendige ved optimering af immobiliseringen af andre typer transmembranmål24. I øjeblikket undersøger vi tilsætningen af kolesterol i processen med TrkB-immobilisering, da kolesterol for nylig viste sig at ændre virkningerne af TrkB-ligander48. Det blev tidligere rapporteret, at tilsætning af kolesterol og / eller andre lipider kan være nødvendig for at opnå funktionelle CMAC-kolonner24.

Forskellige typer detektorer kan anvendes til at overvåge kolonneeluatet, herunder diodearraydetektor til ligander med kromoforer, massespektrometri eller radiostrømsdetektor til radioaktive ligander.

Overvågning af CMAC-kolonnernes stabilitet er af afgørende betydning. CMAC-kolonner kan være stabile i op til flere måneder afhængigt af typen af immobiliseret protein, hyppigheden af brugen og opbevaringsbetingelserne. Det anbefales at opbevare kolonnen i 0,05 % natriumazidopløsning i ammoniumacetatbufferen ved 4 °C, hvis kolonnen forbliver ubrugt i mere end en uge. Det er vigtigt at vaske kolonnen grundigt med ammoniumacetatbuffer efter længere perioder, før du forsøger at bruge den. Det anbefales at overvåge kolonnens funktionalitet ved at injicere en valgt koncentration af en markørligand ugentligt.

På trods af mange fordele har CMAC-teknologien flere begrænsninger, der skal tages i betragtning, når kolonnerne bruges i lægemiddelopdagelsesbestræbelser. For det første falder antallet af immobiliserede transmembranmål med tiden, og derfor anbefales det, at det samlede antal bindingssteder overvåges ugentligt24. En af grundene til dette fald er konsekvensen af immobiliseringsprocessen, der er baseret på adsorption og ikke involverer indførelsen af kovalente bindinger. Lipofile forbindelser kan bevares stærkt på CMAC-kolonner på grund af signifikant uspecifik binding til IAM-overfladen og phospholipid-dobbeltlag. Dette øger analysetiden betydeligt, hvilket reducerer gennemstrømningen. Processen med CMAC-søjleforberedelse er cellelinjespecifik og kræver en grundig forståelse af arten af immobiliserede proteiner, hvilket gør den mindre egnet til mindre karakteriserede mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Lukasz Ciesla samarbejder med Regis Technologies, leverandøren af IAM. Personlig computer. DD2 partikler.

Acknowledgments

Z.C.A. blev støttet af Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoc Research Fellowship Program. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Center for Complimentary and Integrative Medicine fra National Institutes of Health under tildelingsnummer 1R41AT011716-01. Dette arbejde blev også delvist støttet af American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies bevilling til L.C. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon C2 DUVb Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
  3. Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
  4. Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
  5. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
  6. Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
  7. Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
  8. Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
  9. Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
  10. Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
  11. Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
  12. Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
  13. Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
  14. Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
  15. Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
  16. Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
  17. Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
  18. Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
  19. Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
  20. Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
  21. Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
  22. Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
  23. Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
  24. Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
  25. Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
  26. Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
  27. Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
  28. Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
  29. Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
  30. Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
  31. Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
  32. Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
  33. Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
  34. Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
  35. Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
  36. Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
  37. Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
  38. Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
  39. Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
  40. Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
  41. Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
  42. Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
  43. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  44. Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
  45. Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
  46. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  47. Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
  48. Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
  49. Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
  50. Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
  51. Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C. Frontal Affinity Chromatography-Mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (8), 1907-1917 (2007).
  52. Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
  53. Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
  54. Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).

Tags

Biokemi udgave 179
Cellulære membranaffinitetskromatografikolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arituluk, Z. C., Adhikari, B.,… More

Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter