التئام جروح قرنية الزرد: من التآكل إلى تحليل التصوير لإغلاق الجرح

Summary

يركز هذا البروتوكول على إتلاف سطح العين لسمك الزرد من خلال التآكل لتقييم إغلاق الجرح اللاحق على المستوى الخلوي. يستغل هذا النهج نتوء العين لإزالة ظهارة القرنية جزئيا ويستخدم المجهر الإلكتروني الماسح لتتبع التغيرات في مورفولوجيا الخلية أثناء إغلاق الجرح.

Abstract

باعتبارها السطح الشفاف للعين ، فإن القرنية مفيدة للرؤية الواضحة. بسبب موقعه ، هذا النسيج عرضة للإهانات البيئية. في الواقع ، فإن إصابات العين الأكثر شيوعا التي تتم مواجهتها سريريا هي تلك الموجودة في القرنية. في حين تمت دراسة التئام جروح القرنية على نطاق واسع في الثدييات الصغيرة (أي الفئران والجرذان والأرانب) ، فقد أهملت دراسات فسيولوجيا القرنية الأنواع الأخرى ، بما في ذلك الزرد ، على الرغم من أن أسماك الزرد هي نموذج بحثي كلاسيكي.

يصف هذا التقرير طريقة لإجراء تآكل القرنية على سمك الزرد. يتم تنفيذ الجرح في الجسم الحي على الأسماك المخدرة باستخدام نتوء العين. تسمح هذه الطريقة بجرح ظهاري قابل للتكرار ، تاركا بقية العين سليمة. بعد التآكل ، يتم مراقبة إغلاق الجرح على مدار 3 ساعات ، وبعد ذلك يتم إعادة ظهارة الجرح. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، متبوعا بمعالجة الصور ، يمكن التحقيق في شكل الخلية الظهارية ، والنتوءات القمية لدراسة الخطوات المختلفة أثناء إغلاق الجرح الظهاري القرنية.

تسمح خصائص نموذج الزرد بدراسة فسيولوجيا الأنسجة الظهارية والسلوك الجماعي للخلايا الظهارية عند تحدي الأنسجة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام نموذج محروم من تأثير الفيلم المسيل للدموع يمكن أن ينتج إجابات جديدة فيما يتعلق باستجابة القرنية للإجهاد. وأخيرا، يسمح هذا النموذج أيضا بتحديد الأحداث الخلوية والجزيئية التي ينطوي عليها أي نسيج ظهاري يتعرض لجرح مادي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على تقييم فعالية الدواء في الاختبارات قبل السريرية.

Introduction

نظرا لأن معظم الظهارة على اتصال بالبيئة الخارجية ، فهي عرضة للإصابة الجسدية ، مما يجعلها مناسبة تماما لدراسة عمليات التئام الجروح. من بين الأنسجة المدروسة جيدا ، تعد القرنية نموذجا مفيدا للغاية في التحقيق في الجوانب الخلوية والجزيئية لالتئام الجروح. كسطح خارجي شفاف ، فإنه يوفر الحماية المادية للعين وهو العنصر الأول لتركيز الضوء على شبكية العين. في حين أن بنية وتكوين الخلية في شبكية العين تختلف بين الأنواع¹ ، فإن هذه العناصر من القرنية متشابهة بشكل عام في جميع العيون من نوع الكاميرا ، بغض النظر عن الأنواع.

تتكون القرنية من ثلاث طبقات رئيسية². الطبقة الأولى والخارجية هي الظهارة ، التي يتم تجديدها باستمرار لضمان شفافيتها. الطبقة الثانية هي السدى ، التي تحتوي على خلايا متناثرة ، تسمى الخلايا القرنية ، داخل طبقة سميكة من ألياف الكولاجين المنظمة بدقة. الطبقة الثالثة والأعمق هي البطانة ، والتي تسمح بانتشار المغذيات والسوائل من الغرفة الأمامية إلى الطبقات الخارجية. تتفاعل الخلايا الظهارية واللحمية عبر عوامل النمو والسيتوكينات³. يتم تسليط الضوء على هذا التفاعل من خلال موت الخلايا المبرمج السريع والانتشار اللاحق للخلايا القرنية بعد الإصابة الظهارية ^4,5. في حالة وجود جرح أعمق ، مثل ثقب ، تلعب الخلايا القرنية دورا نشطا في عملية الشفاء⁶.

كونها على اتصال مع البيئة الخارجية ، والإصابات الجسدية القرنية شائعة. كثير منها ناتج عن أجسام غريبة صغيرة⁷ ، مثل الرمل أو الغبار. يمكن أن يؤدي رد فعل فرك العين إلى سحجات ظهارية واسعة النطاق وإعادة تشكيل القرنية⁸. وفقا لحجم الجرح وعمقه ، فإن هذه الإصابات الجسدية مؤلمة وتستغرق عدة أيام للشفاء⁹. تسهل الخصائص المثلى لالتئام الجروح للنموذج فهم الجوانب الخلوية والجزيئية لإغلاق الجروح. علاوة على ذلك ، أثبتت هذه النماذج أيضا فائدتها لاختبار جزيئات جديدة لديها القدرة على تسريع شفاء القرنية ، كما هو موضح سابقا^10,11.

يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى استخدام أسماك الزرد كنموذج ذي صلة لدراسة الإصابة الجسدية للقرنية. هذا النموذج مناسب للغاية لدراسات الفحص الدوائي لأنه يسمح بإضافة الجزيئات مباشرة إلى ماء الخزان ، وبالتالي ، للتلامس مع قرنية الشفاء. ستساعد التفاصيل المقدمة هنا العلماء على إجراء دراساتهم على نموذج الزرد. يتم تنفيذ الإصابة في الجسم الحي مع لدغ العين باهتة. يمكن تحليل التأثير على الخلايا الظهارية المجاورة أو على مسافة منه عن طريق إزالة ظهارة القرنية المركزية على وجه التحديد. في السنوات الأخيرة ، ركزت العديد من التقارير على مثل هذه الطريقة على قرنية القوارض¹²،13،14،15،^16،17. ومع ذلك ، حتى الآن ، طبق تقرير واحد فقط هذه الطريقة على الزرد¹⁸.

بسبب بساطته ، فإن الجرح المادي مفيد في تحديد دور الخلايا الظهارية في إغلاق الجرح. نموذج آخر راسخ لإصابة القرنية هو الحرق الكيميائي ، وخاصة حرق القلويات¹⁹،^20،21. ومع ذلك ، فإن مثل هذا النهج يضر بشكل غير مباشر بسطح العين بأكمله ، بما في ذلك القرنية الطرفية وسدى القرنية¹⁹. في الواقع ، من المحتمل أن تحفز الحروق القلوية قرحة القرنية ، والثقوب ، والعتامة الظهارية ، والأوعية الدموية الجديدة السريعة²² ، والنتيجة التي لا يمكن السيطرة عليها للحروق القلوية تستبعد هذا النهج للدراسات العامة لالتئام الجروح. تستخدم العديد من الطرق الأخرى أيضا للتحقيق في التئام جروح القرنية وفقا للتركيز الخاص للدراسة المعنية (على سبيل المثال ، التنضير الظهاري الكامل²³ ، والجمع بين الإصابة الكيميائية والميكانيكية للجرح ذي السماكة الجزئية 24 ، والاستئصال بالليزر الإكسيمر للجروح التي تمتد إلى السدى²⁵). استخدام لدغ العين يحد من النقطة البؤرية إلى الاستجابة الظهارية للجرح ويوفر جرحا قابلا للتكرار للغاية.

كما هو الحال مع كل طريقة لإلحاق الجرح ، فإن استخدام نتوء العين له مزايا وعيوب. العيب الرئيسي هو أن الاستجابة تكون في الغالب ظهارية ، فهي لا تعكس تماما السحجات التي شوهدت في الإعداد السريري. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها العديد من المزايا ، بما في ذلك السهولة التي يمكن بها إعدادها وتنفيذها ، ودقتها ، وقابليتها للتكرار ، وحقيقة أنها غير غازية ، مما يجعلها طريقة جيدة التحمل من قبل الحيوانات.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل المجلس الوطني للتجارب على الحيوانات. 1. التحضيرات قم بإعداد محلول مخزون التريكاين المستخدم في التخدير26 مقدما (محلول مخزون 0.4٪ المستخدم في هذا البروتوكول). استخدم القفازات واحتفظ بالمواد في غطاء الدخان كلما أمك…

Representative Results

تصف هذه الدراسة طريقة تستخدم نتوء العين في تجارب التئام جروح القرنية الزردية. تم تعديل هذه الطريقة من الدراسات السابقة على الفئران ، حيث تبين أن اللدغ يزيل طبقات الخلايا الظهارية بكفاءة13. تشمل التحديات في جرح قرنية الزرد الحجم الصغير نسبيا للعين ، وفي حالة التجارب التي تستغر?…

Discussion

إصابات القرنية الجسدية هي السبب الأكثر شيوعا لزيارات مرضى العيون إلى المستشفى. لذلك ، من المهم إنشاء نماذج ذات صلة لدراسة الجوانب المختلفة لفيزيولوجيا القرنية المرضية. حتى الآن ، يعد الماوس هو النموذج الأكثر استخداما لدراسة التئام جروح القرنية. ومع ذلك ، فإن إضافة قطرات العين على العيون ?…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica