Cura da ferida corneal de zebrafish: da abrasão à análise de imagem de fechamento da ferida

Summary

Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.

Abstract

Como a superfície transparente do olho, a córnea é fundamental para uma visão clara. Devido à sua localização, este tecido é propenso a insultos ambientais. De fato, as lesões oculares mais encontradas clinicamente são aquelas para a córnea. Embora a cura de feridas na córnea tenha sido extensivamente estudada em pequenos mamíferos (ou seja, ratos, ratos e coelhos), estudos de fisiologia da córnea negligenciaram outras espécies, incluindo zebrafish, apesar do zebrafish ser um modelo clássico de pesquisa.

Este relatório descreve um método de realização de uma abrasão córnea em zebrafish. A ferida é realizada in vivo em peixes anestesiados usando uma rebarba ocular. Este método permite uma ferida epitelial reprodutível, deixando o resto do olho intacto. Após a abrasão, o fechamento da ferida é monitorado ao longo de 3 h, após o qual a ferida é reeptelializada. Usando microscopia eletrônica de varredura, seguida de processamento de imagem, a forma das células epiteliais e as saliências apical podem ser investigadas para estudar as várias etapas durante o fechamento da ferida epitelial da córnea.

As características do modelo de zebrafish permitem o estudo da fisiologia do tecido epitelial e do comportamento coletivo das células epiteliais quando o tecido é desafiado. Além disso, o uso de um modelo privado da influência do filme lacrimal pode produzir novas respostas sobre a resposta córnea ao estresse. Por fim, este modelo também permite a delineação dos eventos celulares e moleculares envolvidos em qualquer tecido epitelial submetido a uma ferida física. Este método pode ser aplicado à avaliação da eficácia da droga em testes pré-clínicos.

Introduction

Como a maioria da epitélio está em contato com o ambiente externo, elas são propensas a lesões físicas, tornando-as adequadas para o estudo dos processos de cicatrização de feridas. Entre os tecidos bem estudados, a córnea é um modelo extremamente útil na investigação dos aspectos celulares e moleculares da cicatrização de feridas. Como uma superfície externa transparente, fornece proteção física ao olho e é o primeiro elemento a focar a luz na retina. Embora a estrutura e a composição celular da retina diferem entre as espécies¹, esses elementos da córnea são geralmente semelhantes em todos os olhos do tipo câmera, independentemente das espécies.

A córnea é composta por três camadas principais². A primeira e mais externa camada é o epitélio, que é constantemente renovado para garantir sua transparência. A segunda camada é o estroma, que contém células dispersas, chamadas queratócitos, dentro de uma espessa camada de fibras de colágeno estritamente organizadas. A terceira e mais interna camada é o endotélio, que permite a difusão de nutrientes e líquidos da câmara anterior para as camadas externas. As células epiteliais e estromal interagem através de fatores de crescimento e citocinas³. Esta interação é destacada pela rápida apoptose e posterior proliferação de ceratocitos após lesão epitelial ^4,5. No caso de uma ferida mais profunda, como uma punção, os ceratocitos participam ativamente do processo de cura⁶.

Estando em contato com o ambiente externo, lesões físicas da córnea são comuns. Muitos deles são causados por pequenos objetos estranhos⁷, como areia ou poeira. O reflexo da esfregação dos olhos pode levar a extensas escoriações epiteliais e remodelação corneal⁸. De acordo com o tamanho e a profundidade da ferida, essas lesões físicas são dolorosas e levam vários dias para curar⁹. As características ideais de cicatrização da ferida de um modelo facilitam a compreensão dos aspectos celulares e moleculares do fechamento da ferida. Além disso, tais modelos também se mostraram úteis para testar novas moléculas com potencial para acelerar a cura da córnea, como demonstrado anteriormente^10,11.

O protocolo descrito aqui visa usar o zebrafish como um modelo relevante para estudar lesões físicas na córnea. Este modelo é altamente conveniente para estudos de triagem farmacológica, pois permite que as moléculas sejam adicionadas diretamente à água do tanque e, portanto, entre em contato com uma córnea curativa. Os detalhes aqui fornecidos ajudarão os cientistas a realizar seus estudos sobre o modelo de zebrafish. A lesão in vivo é realizada com uma rebarba ocular embotada. O impacto nas células epiteliais adjacentes ou à distância dela pode ser analisado removendo especificamente o epitélio córnea central. Nos últimos anos, inúmeros relatos focaram nesse método na córnea de roedores 12,13,14,15,16,17; no entanto, até o momento, apenas um único relatório aplicou este método ao zebrafish¹⁸.

Devido à sua simplicidade, a ferida física é útil para delinear o papel das células epiteliais no fechamento da ferida. Outro modelo bem estabelecido de lesão corneia é a queima química, especialmente a queimadura de^álcali 19,20,21. No entanto, tal abordagem danifica indiretamente toda a superfície ocular, incluindo a córnea periférica e o estroma córnea¹⁹. De fato, queimaduras alcalinas potencialmente induzem úlceras corneais, perfurações, opificação epitelial e neovascularização rápida²², e o resultado incontrolável de queimaduras alcalinas desqualificadas que se aproximam de estudos gerais de cicatrização de feridas. Inúmeros outros métodos também são usados para investigar a cicatrização de feridas córneas de acordo com o foco particular do estudo em questão (por exemplo, debridamento epitelial completo²³, a combinação de lesão química e mecânica para ferida de espessura parcial²⁴, ablação a laser excimer para feridas que se estendem ao estroma²⁵). O uso de uma rebarba ocular restringe o ponto focal à resposta epitelial à ferida e fornece uma ferida altamente reprodutível.

Como em cada método de infligência de feridas, o uso de uma rebarba ocular tem vantagens e desvantagens. A principal desvantagem é que a resposta sendo principalmente epitelial, não reflete perfeitamente as abrasões vistas no cenário clínico. No entanto, este método tem inúmeras vantagens, incluindo a facilidade com que pode ser configurado e realizado, sua precisão, sua reprodutibilidade e o fato de não ser invasivo, tornando-o um método bem tolerado pelos animais.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo conselho nacional de experimentos com animais. 1. Preparativos Prepare a solução de estoque tricaine utilizada para anestesia26 antecipadamente (solução de estoque de 0,4% utilizada neste protocolo). Use luvas e mantenha os materiais em um capô de fumaça sempre que possível. Para 50 mL de uma solução de 0,4%, pesar 200 mg de pó tricaine em um tubo de 50 mL. Dissolva o pó em aproxima…

Representative Results

Este estudo descreve um método usando uma rebarba oftálmica em experimentos de cura de feridas de córnea de zebrafish. O método é modificado a partir de estudos anteriores em camundongos, onde a rebarba foi demonstrada para remover as camadas de células epiteliais eficientemente13. Os desafios no woundamento corneal de zebrafish incluem o tamanho relativamente pequeno do olho, e no caso de experimentos demorados, a necessidade de manter um fluxo constante de água através das brânquias (co…

Discussion

Lesões físicas da córnea são a causa mais comum de visitas de pacientes oftalmológicos ao hospital. Por isso, é importante estabelecer modelos relevantes para o estudo de diferentes aspectos da fisiopatologia da córnea. Até agora, o rato é o modelo mais usado para o estudo da cicatrização de feridas córneas. No entanto, adicionar colírios nos olhos murinos feridos para validar o impacto de drogas específicas na cicatrização de feridas córneas pode ser difícil. A este respeito, o modelo de zebrafish é p…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica