ריפוי פצעים בקרנית דגי זברה: משחיקה לניתוח הדמיה לסגירת פצעים

Summary

פרוטוקול זה מתמקד בפגיעה במשטח העין של דגי הזברה באמצעות שחיקה כדי להעריך את סגירת הפצעים הבאים ברמה התאית. גישה זו מנצלת בר עיני כדי להסיר חלקית את אפיתל הקרנית ומשתמשת במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה של התא במהלך סגירת הפצע.

Abstract

כמשטח השקוף של העין, הקרנית היא אינסטרומנטלית לראייה ברורה. בשל מיקומו, רקמה זו נוטה עלבונות סביבתיים. ואכן, פציעות העיניים הנתקלות לעתים קרובות ביותר מבחינה קלינית הן אלה לקרנית. בעוד שריפוי פצעי קרנית נחקר בהרחבה ביונקים קטנים (כלומר, עכברים, חולדות וארנבות), מחקרים בפיזיולוגיה של הקרנית הזניחו מינים אחרים, כולל דגי זברה, למרות שדגי זברה הם מודל מחקר קלאסי.

דו”ח זה מתאר שיטה לביצוע שחיקה בקרנית על דגי זברה. הפצע מבוצע ב vivo על דגים מרדימים באמצעות בר עינית. שיטה זו מאפשרת פצע אפיתל לשחזור, משאיר את שאר העין ללא פגע. לאחר שחיקה, סגירת הפצע מנוטרת במהלך 3 שעות, ולאחר מכן הפצע הוא reepithelialized. באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, ואחריו עיבוד תמונה, צורת תא האפיתל, בליטות apical ניתן לחקור כדי לחקור את השלבים השונים במהלך סגירת פצע אפיתל הקרנית.

המאפיינים של מודל דגי הזברה מאפשרים לחקור את הפיזיולוגיה של רקמת האפיתל ואת ההתנהגות הקולקטיבית של תאי האפיתל כאשר הרקמה מאותגרת. יתר על כן, השימוש במודל שנמנע מהשפעת סרט הדמעות יכול לייצר תשובות חדשות לגבי תגובת הקרנית ללחץ. לבסוף, מודל זה מאפשר גם את התיחום של האירועים התאיים והמולקולריים המעורבים בכל רקמת אפיתל הנתונה לפצע פיזי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת להערכה של יעילות התרופה בבדיקות פרה קליניות.

Introduction

כמו רוב האפיתליה נמצאים במגע עם הסביבה החיצונית, הם נוטים לפגיעה גופנית, מה שהופך אותם מתאימים היטב לחקר תהליכי ריפוי הפצע. בין הרקמות הנחקרות היטב, הקרנית היא מודל שימושי ביותר בחקירת ההיבטים התאיים והמולקולריים של ריפוי פצעים. כמשטח חיצוני שקוף, הוא מספק הגנה פיזית לעין והוא האלמנט הראשון שממקד את האור ברשתית. בעוד המבנה והרכב התאים של הרשתית שונים בין מינים¹, יסודות אלה של הקרנית דומים בדרך כלל בכל העיניים מסוג המצלמה, ללא קשר למינים.

הקרנית מורכבת משלוש שכבות עיקריות². השכבה הראשונה והחיצונית ביותר היא האפיתל, המתחדש כל הזמן כדי להבטיח את שקיפותו. השכבה השנייה היא הסטרומה, המכילה תאים מפוזרים, הנקראים קרטוציטים, בתוך שכבה עבה של סיבי קולגן מאורגנים בקפדנות. השכבה השלישית והפנימית ביותר היא האנדותל, המאפשרת דיפוזיה תזונתית ונוזלית מהתא הקדמי לשכבות החיצוניות. תאי האפיתל והסטרומליים מתקשרים באמצעות גורמי גדילה וציטוקינים³. אינטראקציה זו מודגשת על ידי אפופטוזיס מהירה והתפשטות עוקבת של קרטוציטים לאחר פגיעה אפיתל ^4,5. במקרה של פצע עמוק יותר, כגון ניקוב, קרטוציטים לוקחים חלק פעיל בתהליך הריפוי⁶.

להיות במגע עם הסביבה החיצונית, פציעות פיזיות הקרנית שכיחות. רבים מהם נגרמים על ידי חפצים זרים קטנים⁷, כגון חול או אבק. הרפלקס של שפשוף העיניים יכול להוביל לשריטות אפיתל נרחבות ושיפוץ הקרנית⁸. על פי גודל הפצע ועומקו, פציעות פיזיות אלה כואבות ולוקח כמה ימים לרפא⁹. מאפייני ריפוי הפצע האופטימליים של מודל מקלים על הבנת ההיבטים התאיים והמולקולריים של סגירת הפצע. יתר על כן, מודלים כאלה הוכיחו גם שימושי לבדיקת מולקולות חדשות עם פוטנציאל להאיץ את ריפוי הקרנית, כפי שהוכח בעבר^10,11.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד להשתמש בדגי זברה כמודל רלוונטי לחקר פגיעה גופנית בקרנית. מודל זה נוח מאוד למחקרי סינון פרמקולוגיים שכן הוא מאפשר להוסיף מולקולות ישירות למי הטנק, ולכן, לבוא במגע עם קרנית מרפאת. הפרטים המפורטים כאן יסייעו למדענים לבצע את מחקריהם על מודל דגי הזברה. הפציעה in vivo מבוצעת עם בר עיני קהה. ניתן לנתח את ההשפעה על תאי האפיתל הסמוכים או במרחק ממנו על ידי הסרה ספציפית של אפיתל הקרנית המרכזי. בשנים האחרונות, דיווחים רבים התמקדו בשיטה כזו על קרנית מכרסמים 12,13,14,15,16,17; עם זאת, עד כה, רק דו”ח אחד יישם שיטה זו על דגי זברה¹⁸.

בגלל הפשטות שלה, הפצע הפיזי שימושי בתיחום התפקיד של תאי אפיתל בסגירת הפצע. מודל מבוסס נוסף של פגיעה בקרנית הוא הכוויה הכימית, במיוחד לשרוף אלקלי 19,20,21. עם זאת, גישה כזו פוגעת בעקיפין בכל פני השטח של העין, כולל הקרנית ההיקפית וסטרומה הקרנית¹⁹. ואכן, כוויות אלקלי עלולות לגרום לכיבים בקרנית, ניקובים, אטימות אפיתל וניאווסקולריזציה מהירה²², והתוצאה הבלתי נשלטת של כוויות אלקליות פוסלת גישה זו למחקרי ריפוי פצעים כלליים. שיטות רבות אחרות משמשות גם כדי לחקור ריפוי פצעי קרנית על פי המוקד המסוים של המחקר המדובר (למשל, פסולת אפיתל מלאה²³, שילוב של פגיעה כימית ומכאנית עבור פצע^{בעובי חלקי 24}, אבלציה לייזר excimer עבור פצעים המשתרעים על סטרומה²⁵). השימוש בבר עיני מגביל את המוקד לתגובת האפיתל לפצע ומספק פצע רב לשחזור.

כמו בכל שיטה של גרימת פצע, השימוש בר עינית יש יתרונות וחסרונות. החיסרון העיקרי הוא כי התגובה להיות בעיקר אפיתל, זה לא משקף באופן מושלם את השריטות לראות בסביבה הקלינית. עם זאת, לשיטה זו יש יתרונות רבים, כולל הקלות שבה ניתן להגדיר ולבצע אותה, הדיוק שלה, הרבייה שלה, והעובדה שהיא לא פולשנית, מה שהופך אותה לשיטה נסבלת היטב על ידי בעלי חיים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים. 1. הכנות הכן את פתרון מניית tricaine המשמש להרדמה26 מראש (פתרון מלאי 0.4% המשמש בפרוטוקול זה). השתמש כפפות ולשמור את החומרים בברדס אדים במידת האפשר. עבור 50 מ”ל של פתרון 0.4%, לשקול 200 מ”ג של אבקת …

Representative Results

מחקר זה מתאר שיטה באמצעות בר עיניים בניסויי ריפוי פצעי קרנית דגי זברה. השיטה משתנה ממחקרים קודמים על עכברים, שם הוכח כי הבר מסיר את שכבות תאי האפיתל ביעילות13. האתגרים בפציעת קרנית דגי הזברה כוללים את גודלה הקטן יחסית של העין, ובמקרה של ניסויים הגוזלים זמן רב, הצורך לשמור על זרי?…

Discussion

פציעות גופניות בקרנית הן הגורם הנפוץ ביותר לביקורי חולי עיניים בבית החולים. לכן, חשוב להקים מודלים רלוונטיים לחקר היבטים שונים של פתולוגיה הקרנית. עד כה, העכבר הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר ריפוי פצעי הקרנית. עם זאת, הוספת טיפות עיניים על עיניים פגועות מורין כדי לאמת את ההשפעה של תרופות ספציפ?…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica