Zebrafisch-Hornhautwundheilung: Von der Abrieb- bis zur Wundverschluss-Bildgebungsanalyse

Summary

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schädigung der Augenoberfläche von Zebrafischen durch Abrieb, um den anschließenden Wundverschluss auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Ansatz nutzt einen Augengrat, um das Hornhautepithel teilweise zu entfernen, und verwendet Rasterelektronenmikroskopie, um Veränderungen in der Zellmorphologie während des Wundverschlusses zu verfolgen.

Abstract

Als transparente Oberfläche des Auges ist die Hornhaut für eine klare Sicht von entscheidender Bedeutung. Aufgrund seiner Lage ist dieses Gewebe anfällig für Umweltbeleidigungen. In der Tat sind die Augenverletzungen, die klinisch am häufigsten auftreten, die der Hornhaut. Während die Wundheilung der Hornhaut bei kleinen Säugetieren (dh Mäusen, Ratten und Kaninchen) ausführlich untersucht wurde, haben Studien zur Hornhautphysiologie andere Arten, einschließlich Zebrafische, vernachlässigt, obwohl Zebrafische ein klassisches Forschungsmodell sind.

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Durchführung eines Hornhautabriebs an Zebrafischen. Die Wunde wird in vivo an betäubten Fischen mit einem Augengrat durchgeführt. Diese Methode ermöglicht eine reproduzierbare Epithelwunde, wobei der Rest des Auges intakt bleibt. Nach dem Abrieb wird der Wundverschluss im Laufe von 3 h überwacht, danach wird die Wunde reepithelialisiert. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie, gefolgt von der Bildverarbeitung, können die Epithelzellform und apikale Vorsprünge untersucht werden, um die verschiedenen Schritte während des Hornhautepithel-Wundverschlusses zu untersuchen.

Die Eigenschaften des Zebrafischmodells erlauben es, die Epithelgewebephysiologie und das kollektive Verhalten der Epithelzellen zu untersuchen, wenn das Gewebe herausgefordert wird. Darüber hinaus kann die Verwendung eines Modells, das des Einflusses des Tränenfilms beraubt ist, neue Antworten auf die Reaktion der Hornhaut auf Stress liefern. Schließlich ermöglicht dieses Modell auch die Abgrenzung der zellulären und molekularen Ereignisse, die an jedem Epithelgewebe beteiligt sind, das einer physischen Wunde ausgesetzt ist. Diese Methode kann auf die Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit in präklinischen Tests angewendet werden.

Introduction

Da die meisten Epithel in Kontakt mit der äußeren Umgebung stehen, sind sie anfällig für körperliche Verletzungen, was sie gut für das Studium von Wundheilungsprozessen geeignet macht. Unter den gut untersuchten Geweben ist die Hornhaut ein äußerst nützliches Modell bei der Untersuchung der zellulären und molekularen Aspekte der Wundheilung. Als transparente Außenfläche schützt es das Auge physisch und ist das erste Element, das das Licht auf die Netzhaut fokussiert. Während sich die Struktur und die Zellzusammensetzung der Netzhaut zwischen Spezies¹ unterscheiden, sind diese Elemente der Hornhaut im Allgemeinen in allen kameraartigen Augen ähnlich, unabhängig von der Art.

Die Hornhaut besteht aus drei Hauptschichten². Die erste und äußerste Schicht ist das Epithel, das ständig erneuert wird, um seine Transparenz zu gewährleisten. Die zweite Schicht ist das Stroma, das verstreute Zellen, Keratozyten genannt, in einer dicken Schicht streng organisierter Kollagenfasern enthält. Die dritte und innerste Schicht ist das Endothel, das eine Nährstoff- und Flüssigkeitsdiffusion von der Vorderkammer zu den äußeren Schichten ermöglicht. Die Epithel- und Stromazellen interagieren über Wachstumsfaktoren und Zytokine³. Diese Wechselwirkung wird durch die schnelle Apoptose und die anschließende Proliferation von Keratozyten nach Epithelverletzung^{hervorgehoben 4,5}. Bei einer tieferen Wunde, wie z.B. einer Punktion, nehmen Keratozyten aktiv am Heilungsprozess^{teil 6}.

In Kontakt mit der äußeren Umgebung sind körperliche Verletzungen der Hornhaut häufig. Viele von ihnen werden durch kleine Fremdkörper^{verursacht 7}, wie Sand oder Staub. Der Reflex des Augenreibens kann zu ausgedehnten Epithelabschürfungen und Hornhautumbau^{führen 8}. Je nach Wundgröße und -tiefe sind diese körperlichen Verletzungen schmerzhaft und dauern mehrere Tage,^{um 9 zu} heilen. Die optimalen wundheilenden Eigenschaften eines Modells erleichtern das Verständnis der zellulären und molekularen Aspekte des Wundverschlusses. Darüber hinaus haben sich solche Modelle auch als nützlich erwiesen, um neue Moleküle mit dem Potenzial zur Beschleunigung der Hornhautheilung zu testen, wie bereits gezeigt^{wurde 10,11}.

Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, Zebrafische als relevantes Modell zur Untersuchung der körperlichen Verletzung der Hornhaut zu verwenden. Dieses Modell ist sehr praktisch für pharmakologische Screening-Studien, da es ermöglicht, Moleküle direkt in das Tankwasser zu geben und somit mit einer heilenden Hornhaut in Kontakt zu kommen. Die hier bereitgestellten Details werden den Wissenschaftlern helfen, ihre Studien am Zebrafischmodell durchzuführen. Die in vivo Verletzung wird mit einem stumpfen Augengrat durchgeführt. Die Auswirkungen auf Epithelzellen, die an sie angrenzen oder sich in einiger Entfernung davon befinden, können analysiert werden, indem das zentrale Hornhautepithel gezielt entfernt wird. In den letzten Jahren konzentrierten sich zahlreiche Berichte auf eine solche Methode bei Nagetierhornhaut 12,13,14,15,16,17; Bisher hat jedoch nur ein einziger Bericht diese Methode auf Zebrafisch¹⁸ angewendet.

Aufgrund ihrer Einfachheit ist die physische Wunde nützlich, um die Rolle von Epithelzellen beim Wundverschluss zu beschreiben. Ein weiteres etabliertes Modell der Hornhautverletzung ist die chemische Verbrennung, insbesondere die Alkaliverbrennung 19,20,21. Ein solcher Ansatz schädigt jedoch indirekt die gesamte Augenoberfläche, einschließlich der peripheren Hornhaut und des Hornhautstromas¹⁹. Tatsächlich induzieren Alkaliverbrennungen möglicherweise Hornhautgeschwüre, Perforationen, epitheliale Trübung und schnelle Neovaskularisation²², und das unkontrollierbare Ergebnis von Alkaliverbrennungen disqualifiziert diesen Ansatz für allgemeine Wundheilungsstudien. Zahlreiche andere Methoden werden auch verwendet, um die Hornhautwundheilung entsprechend dem besonderen Schwerpunkt der jeweiligen Studie zu untersuchen (z. B. vollständiges Epitheldebridement²³, die Kombination von chemischer und mechanischer Verletzung bei Teildickenwunden 24, Excimer-Laserablation für Wunden, die sich bis zum Stroma²⁵ erstrecken). Die Verwendung eines Augengrats beschränkt den Fokus auf die epitheliale Reaktion auf die Wunde und sorgt für eine hochgradig reproduzierbare Wunde.

Wie bei jeder Methode der Wundzufügung hat die Verwendung eines Augengrats Vor- und Nachteile. Der Hauptnachteil ist, dass die Reaktion meist epithelisch ist und die Abschürfungen im klinischen Umfeld nicht perfekt widerspiegelt. Diese Methode hat jedoch zahlreiche Vorteile, einschließlich der Leichtigkeit, mit der sie eingerichtet und durchgeführt werden kann, ihrer Präzision, ihrer Reproduzierbarkeit und der Tatsache, dass sie nicht-invasiv ist, was sie zu einer Methode macht, die von Tieren gut vertragen wird.

Protocol

Alle Experimente wurden vom nationalen Tierversuchsausschuss genehmigt. 1. Vorbereitungen Bereiten Sie die für die Anästhesie verwendete Tricain-Stammlösung26 im Voraus vor (0,4% ige Stammlösung, die in diesem Protokoll verwendet wird). Verwenden Sie Handschuhe und bewahren Sie die Materialien wann immer möglich in einem Abzug auf. Für 50 ml einer 0,4% igen Lösung wiegen Sie 200 mg Tricainpulver in ein 50-ml-Röhrchen. Lösen Si…

Representative Results

Diese Studie beschreibt eine Methode mit einem ophthalmologischen Grat in Zebrafisch-Hornhaut-Wundheilungsexperimenten. Die Methode ist modifiziert gegenüber früheren Studien an Mäusen, bei denen gezeigt wurde, dass der Grat die Epithelzellschichten effizient13 entfernt. Zu den Herausforderungen bei der Hornhautverletzung von Zebrafischen gehören die relativ geringe Größe des Auges und im Falle zeitaufwendiger Experimente die Notwendigkeit, einen konstanten Wasserfluss durch die Kiemen aufre…

Discussion

Hornhautverletzungen sind die häufigste Ursache für ophthalmologische Patientenbesuche im Krankenhaus. Daher ist es wichtig, relevante Modelle für die Untersuchung verschiedener Aspekte der Pathophysiologie der Hornhaut zu erstellen. Bisher ist die Maus das am häufigsten verwendete Modell für das Studium der Hornhautwundheilung. Das Hinzufügen von Augentropfen auf murinen verwundeten Augen, um die Auswirkungen bestimmter Medikamente auf die Wundheilung der Hornhaut zu validieren, kann jedoch schwierig sein. In dies…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica