Zebra Balığı Kornea Yara İyileşmesi: Aşınmadan Yara Kapatma Görüntüleme Analizine
Summary
Bu protokol, hücresel düzeyde sonraki yara kapanmasını değerlendirmek için zebra balıklarının oküler yüzeyine aşınma yoluyla zarar vermeye odaklanır. Bu yaklaşım, kornea epitelini kısmen çıkarmak için bir oküler çapaktan yararlanır ve yara kapanması sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanır.
Abstract
Gözün şeffaf yüzeyi olarak, kornea net görme için etkilidir. Konumu nedeniyle, bu doku çevresel hakaretlere eğilimlidir. Nitekim klinik olarak en sık karşılaşılan göz yaralanmaları korneada görülen yaralanmalardır. Kornea yara iyileşmesi küçük memelilerde (yani fareler, sıçanlar ve tavşanlar) kapsamlı bir şekilde incelenirken, kornea fizyolojisi çalışmaları, zebra balığı klasik bir araştırma modeli olmasına rağmen, zebra balığı da dahil olmak üzere diğer türleri ihmal etmiştir.
Bu rapor, zebra balığı üzerinde kornea aşınması gerçekleştirmenin bir yöntemini açıklamaktadır. Yara, oküler çapak kullanılarak anestezi uygulanan balıklarda in vivo olarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, gözün geri kalanını sağlam bırakarak tekrarlanabilir bir epitel yarasına izin verir. Aşınmadan sonra, yara kapanması 3 saat boyunca izlenir, daha sonra yara reepitelize edilir. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak, ardından görüntü işleme, epitel hücre şekli ve apikal çıkıntılar, kornea epitel yarası kapanması sırasında çeşitli adımları incelemek için araştırılabilir.
Zebra balığı modelinin özellikleri, epitel dokusu fizyolojisinin ve dokuya meydan okunduğunda epitel hücrelerinin kolektif davranışının incelenmesine izin verir. Ayrıca, gözyaşı filminin etkisinden yoksun bir modelin kullanılması, korneanın strese tepkisi ile ilgili yeni cevaplar üretebilir. Son olarak, bu model aynı zamanda fiziksel bir yaraya maruz kalan herhangi bir epitel dokusunda yer alan hücresel ve moleküler olayların tanımlanmasına da izin verir. Bu yöntem, preklinik testlerde ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde uygulanabilir.
Introduction
Epitelyaların çoğu dış çevre ile temas halinde olduğundan, fiziksel yaralanmaya eğilimlidirler, bu da onları yara iyileşme süreçlerinin incelenmesi için çok uygun hale getirir. İyi çalışılmış dokular arasında kornea, yara iyileşmesinin hücresel ve moleküler yönlerinin araştırılmasında son derece yararlı bir modeldir. Şeffaf bir dış yüzey olarak göze fiziksel koruma sağlar ve ışığı retinaya odaklayan ilk unsurdur. Retinanın yapısı ve hücre bileşimi tür1 arasında farklılık gösterirken, korneanın bu elementleri, türlerden bağımsız olarak tüm kamera tipi gözlerde genellikle benzerdir.
Kornea üç ana tabakadan oluşur2. İlk ve en dış katman, şeffaflığını sağlamak için sürekli yenilenen epiteldir. İkinci katman, kesinlikle organize edilmiş kollajen liflerinin kalın bir tabakası içinde, keratositler adı verilen dağınık hücreler içeren stromadır. Üçüncü ve en içteki tabaka, ön odadan dış katmanlara besin ve sıvı difüzyonuna izin veren endoteldir. Epitel ve stromal hücreler büyüme faktörleri ve sitokinler yoluyla etkileşime girer3. Bu etkileşim, epitel yaralanması 4,5 sonrası hızlı apoptoz ve ardından keratositlerin proliferasyonu ile vurgulanmaktadır. Delinme gibi daha derin bir yara durumunda, keratositler iyileşme sürecinde aktif rol alır6.
Dış çevre ile temas halinde olmak, kornea fiziksel yaralanmaları yaygındır. Birçoğu kum veya toz gibi küçük yabancıcisimlerden kaynaklanır 7. Göz ovuşturma refleksi geniş epitel sıyrıklarına ve kornea yeniden şekillenmesine yol açabilir8. Yara büyüklüğüne ve derinliğine göre, bu fiziksel yaralanmalar ağrılıdır veiyileşmesi birkaç gün sürer 9. Bir modelin optimal yara iyileşme özellikleri, yara kapanmasının hücresel ve moleküler yönlerinin anlaşılmasını kolaylaştırır. Ayrıca, bu tür modeller, daha önce10,11’de gösterildiği gibi, kornea iyileşmesini hızlandırma potansiyeline sahip yeni molekülleri test etmek için de yararlı olduğunu kanıtlamıştır.
Burada açıklanan protokol, zebra balıklarını kornea fiziksel yaralanmasını incelemek için ilgili bir model olarak kullanmayı amaçlamaktadır. Bu model, moleküllerin doğrudan tank suyuna eklenmesine ve dolayısıyla iyileşen bir kornea ile temas etmesine izin verdiği için farmakolojik tarama çalışmaları için oldukça uygundur. Burada verilen detaylar, bilim adamlarının zebra balığı modeli üzerindeki çalışmalarını gerçekleştirmelerine yardımcı olacaktır. İn vivo yaralanma donuk bir oküler çapak ile gerçekleştirilir. Bitişik veya ondan uzak bir mesafedeki epitel hücreleri üzerindeki etki, merkezi kornea epitelinin spesifik olarak çıkarılmasıyla analiz edilebilir. Son yıllarda, çok sayıda rapor kemirgen kornea 12,13,14,15,16,17; ancak, bugüne kadar, sadece tek bir rapor bu yöntemi zebra balığı18’e uygulamıştır.
Sadeliği nedeniyle, fiziksel yara, epitel hücrelerinin yara kapanmasındaki rolünü tanımlamada yararlıdır. Kornea yaralanmasının bir başka köklü modeli kimyasal yanık, özellikle alkali yanık 19,20,21’dir. Bununla birlikte, böyle bir yaklaşım dolaylı olarak periferik kornea ve kornea stroma19 dahil olmak üzere tüm göz yüzeyine zarar verir. Gerçekten de, alkali yanıklar potansiyel olarak kornea ülserlerini, perforasyonları, epitelyal opaklaşmayı ve hızlı neovaskülarizasyonuindükler 22 ve alkali yanıkların kontrol edilemeyen sonucu, genel yara iyileşmesi çalışmaları için bu yaklaşımı diskalifiye eder. Söz konusu çalışmanın özel odağına göre kornea yarasının iyileşmesini araştırmak için çok sayıda başka yöntem de kullanılmaktadır (örneğin, tam epitel debridmanı23, kısmi kalınlıktaki yara 24 için kimyasal ve mekanik yaralanma kombinasyonu, stroma25’e uzanan yaralar için excimer lazer ablasyonu). Oküler çapak kullanımı, odak noktasını yaraya epitel yanıtı ile sınırlar ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir yara sağlar.
Her yara açma yönteminde olduğu gibi, oküler çapak kullanımının avantajları ve dezavantajları vardır. En büyük dezavantajı, yanıtın çoğunlukla epitel olması, klinik ortamda görülen sıyrıkları tam olarak yansıtmamasıdır. Bununla birlikte, bu yöntemin, kurulabileceği ve gerçekleştirilebildiği kolaylık, hassasiyeti, tekrarlanabilirliği ve invaziv olmaması da dahil olmak üzere sayısız avantajı vardır, bu da onu hayvanlar tarafından iyi tolere edilen bir yöntem haline getirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kornea fiziksel yaralanmaları, oftalmoloji hastalarının hastaneye ziyaretlerinin en sık nedenidir. Bu nedenle, kornea patofizyolojisinin farklı yönlerinin incelenmesi için ilgili modellerin oluşturulması önemlidir. Şimdiye kadar, fare kornea yara iyileşmesi çalışması için en yaygın kullanılan modeldir. Bununla birlikte, belirli ilaçların kornea yarasının iyileşmesi üzerindeki etkisini doğrulamak için murin yaralı gözlere göz damlası eklemek zor olabilir. Bu bakımdan, zebra balığı modeli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Zebra balığı birimine erişim için Pertti Panula’ya ve zebra balığı deneylerine rehberlik ve yardım için Henri Koivula’ya teşekkür eder. Bu araştırma Finlandiya Akademisi, Jane ve Aatos Erkko Vakfı, Finlandiya Kültür Vakfı ve ATIP-Avenir Programı tarafından desteklenmiştir. Görüntüleme, HiLIFE ve Biocenter Finlandiya tarafından desteklenen Elektron Mikroskobu ünitesinde ve Işık Mikroskobu Ünitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü’nde gerçekleştirildi.
Materials
| 0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
| adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| Dissecting plate | in-house | ||
| Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
| double-distilled water | in-house | ||
| Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
| Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
| Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
| mounts | Agar Scientific | G301P | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Plastic spoons | any provider | ||
| Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Soft sponge | any provider | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscope | Leica |
References
- Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
- Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).
- Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
- Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
- Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
- Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
- Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
- Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
- Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
- Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
- Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
- Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
- Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
- . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
- Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
- Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
- Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
- van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
- Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
