제브라피쉬 각막 상처 치유: 마모에서 상처 폐쇄 영상 분석까지
Summary
이 프로토콜은 세포 수준에서 후속 상처 폐쇄를 평가하기 위해 마모를 통해 제브라 피쉬의 안구 표면을 손상시키는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 안구 버를 이용하여 각막 상피를 부분적으로 제거하고 주사 전자 현미경을 사용하여 상처 폐쇄 중 세포 형태의 변화를 추적합니다.
Abstract
눈의 투명한 표면으로서 각막은 맑은 시력을 위해 도움이됩니다. 그것의 위치 때문에,이 조직은 환경 모욕을 받기 쉽습니다. 사실, 임상적으로 가장 자주 발생하는 눈 부상은 각막에 대한 부상입니다. 각막 상처 치유는 작은 포유류 (즉, 생쥐, 쥐 및 토끼)에서 광범위하게 연구되었지만 각막 생리학 연구는 제브라 피쉬가 고전적인 연구 모델임에도 불구하고 제브라 피쉬를 포함한 다른 종을 무시했습니다.
이 보고서는 제브라 피쉬에서 각막 찰과상을 수행하는 방법을 설명합니다. 상처는 안구 버를 사용하여 마취 된 물고기에서 생체 내에서 수행됩니다. 이 방법은 재현 가능한 상피 상처를 허용하여 나머지 눈을 그대로 유지합니다. 찰과상 후, 상처 폐쇄는 3 시간 동안 모니터링되고, 그 후에 상처는 재상피화됩니다. 주사 전자 현미경을 사용하여, 화상 처리, 상피 세포 형상, 및 정점 돌출부를 조사하여 각막 상피 상처 폐쇄 동안 다양한 단계를 연구할 수 있다.
제브라 피쉬 모델의 특성은 조직이 도전받을 때 상피 조직 생리학 및 상피 세포의 집단 행동에 대한 연구를 허용합니다. 또한, 눈물막의 영향을 박탈당한 모델을 사용하면 스트레스에 대한 각막 반응에 관한 새로운 해답을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 또한 물리적 상처를 입은 임의의 상피 조직에 관여하는 세포 및 분자 사건의 묘사를 허용한다. 이 방법은 전임상 시험에서 약물 효과의 평가에 적용될 수 있다.
Introduction
대부분의 상피는 외부 환경과 접촉하기 때문에 신체적 상해가 발생하기 쉽기 때문에 상처 치유 과정 연구에 매우 적합합니다. 잘 연구 된 조직 중에서 각막은 상처 치유의 세포 및 분자 측면을 조사하는 데 매우 유용한 모델입니다. 투명한 외부 표면으로서, 그것은 눈에 물리적 보호를 제공하고 망막에 빛을 집중시키는 첫 번째 요소입니다. 망막의 구조와 세포 구성은 종1에 따라 다르지만, 각막의 이러한 요소는 종에 관계없이 모든 카메라 형 눈에서 일반적으로 유사합니다.
각막은 세 개의 주요 층2로 구성되어 있습니다. 첫 번째와 가장 바깥 쪽 층은 상피이며, 상피는 투명성을 보장하기 위해 끊임없이 갱신됩니다. 두 번째 층은 엄격하게 조직 된 콜라겐 섬유의 두꺼운 층 내에 각질 세포라고 불리는 흩어져있는 세포를 포함하는 스트로마입니다. 세 번째이자 가장 안쪽에있는 층은 내피이며, 이는 영양소와 액체가 전방 챔버에서 바깥 층으로 확산 될 수있게합니다. 상피 및 기질 세포는 성장 인자 및 사이토카인을 통해 상호작용한다3. 이러한 상호작용은 상피 손상 후 각질세포의 신속한 아폽토시스 및 후속 증식에 의해 강조된다4,5. 펑크와 같은 더 깊은 상처의 경우, 각질세포는 치유 과정6에서 적극적으로 참여합니다.
외부 환경과 접촉하기 때문에 각막의 신체적 부상이 흔합니다. 이들 중 다수는 모래나 먼지와 같은 작은 이물질(7)에 의해 발생한다. 눈 마찰의 반사는 광범위한 상피 찰과상과 각막 리모델링으로 이어질 수 있습니다8. 상처의 크기와 깊이에 따르면, 이러한 신체적 상해는 고통스럽고 치유하는 데 며칠이 걸립니다9. 모델의 최적 상처 치유 특성은 상처 폐쇄의 세포 및 분자 측면에 대한 이해를 촉진한다. 또한, 이러한 모델은 이전에 입증 된 바와 같이 각막 치유를 가속화 할 수있는 잠재력을 가진 새로운 분자를 테스트하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다10,11.
여기에 설명 된 프로토콜은 각막 신체 손상을 연구하기위한 관련 모델로 제브라 피쉬를 사용하는 것을 목표로합니다. 이 모델은 분자를 탱크 물에 직접 첨가 할 수 있으므로 치유 각막과 접촉 할 수 있으므로 약리학 적 스크리닝 연구에 매우 편리합니다. 여기에 제공된 세부 사항은 과학자들이 제브라 피쉬 모델에 대한 연구를 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 생체내 손상은 둔화된 안구 버로 수행된다. 인접한 상피 세포에 대한 영향 또는 그것으로부터 멀리 떨어진 곳에서 중앙 각막 상피를 특이적으로 제거함으로써 분석될 수 있다. 최근 몇 년 동안, 설치류 각막 12,13,14,15,16,17에 대한 그러한 방법에 초점을 맞춘 수많은 보고서; 그러나 현재까지 단 하나의 보고서 만이 제브라 피쉬18에이 방법을 적용했습니다.
그것의 단순성 때문에, 육체적 상처는 상처 폐쇄에서 상피 세포의 역할을 묘사하는데 유용하다. 각막 손상의 또 다른 잘 정립 된 모델은 화학 화상, 특히 알칼리 화상 19,20,21입니다. 그러나, 이러한 접근법은 말초 각막 및 각막 스트로마(19)를 포함하는 전체 눈 표면을 간접적으로 손상시킨다. 실제로, 알칼리 화상은 잠재적으로 각막 궤양, 천공, 상피 혼탁 및 신속한 신생혈관화22를 유도하며, 알칼리 화상의 통제 할 수없는 결과는 일반적인 상처 치유 연구를위한 접근 방식을 실격시킵니다. 문제의 연구의 특정 초점에 따라 각막 상처 치유를 조사하기 위해 수많은 다른 방법들이 또한 사용된다(예를 들어, 완전한 상피 탈지23, 부분-두께 상처(24)에 대한 화학적 및 기계적 손상의 조합, 스트로마(25)로 연장되는 상처에 대한 엑시머 레이저 절제). 안구 버의 사용은 상처에 대한 상피 반응에 초점을 제한하고 재현성이 높은 상처를 제공합니다.
상처 가해의 각 방법과 마찬가지로, 안구 버의 사용은 장단점이 있습니다. 가장 큰 단점은 반응이 대부분 상피적이며, 임상 환경에서 볼 수있는 찰과상을 완벽하게 반영하지 못한다는 것입니다. 그러나이 방법은 설정 및 수행 할 수있는 용이성, 정밀도, 재현성 및 비 침습적이라는 사실을 포함하여 많은 장점을 가지고 있으므로 동물이 잘 견딜 수있는 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
각막 신체 상해는 안과 환자가 병원을 방문하는 가장 흔한 원인입니다. 따라서 각막 병리 생리학의 다양한 측면에 대한 연구를위한 관련 모델을 수립하는 것이 중요합니다. 지금까지, 마우스는 각막 상처 치유의 연구에 가장 일반적으로 사용되는 모델이다. 그러나 각막 상처 치유에 대한 특정 약물의 영향을 검증하기 위해 뮤린 상처 입은 눈에 점안액을 추가하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Zebrafish 유닛에 대한 접근에 대해 Pertti Panula와 Henri Koivula에게 제브라 피쉬 실험에 대한 지침과 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 핀란드 아카데미, Jane and Aatos Erkko Foundation, Finnish Cultural Foundation 및 ATIP-Avenir Program의 지원을 받았습니다. 이미징은 HiLIFE 및 Biocenter Finland가 지원하는 Electron Microscopy 유닛과 생명 공학 연구소의 Light Microscopy Unit에서 수행되었습니다.
Materials
| 0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
| adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| Dissecting plate | in-house | ||
| Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
| double-distilled water | in-house | ||
| Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
| Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
| Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
| mounts | Agar Scientific | G301P | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Plastic spoons | any provider | ||
| Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Soft sponge | any provider | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscope | Leica |
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