Zebrafisk hornhinde sårheling: Fra slid til sårlukning billeddannelsesanalyse

Summary

Denne protokol fokuserer på at beskadige zebrafiskens okulære overflade gennem slid for at vurdere den efterfølgende sårlukning på celleniveau. Denne tilgang udnytter en okulær burr til delvist at fjerne hornhindeepitelet og bruger scanningselektronmikroskopi til at spore ændringer i cellemorfologi under sårlukning.

Abstract

Som øjets gennemsigtige overflade er hornhinden medvirkende til klart syn. På grund af sin placering er dette væv tilbøjeligt til miljømæssige fornærmelser. Faktisk er de øjenskader, der oftest opstår klinisk, dem til hornhinden. Mens hornhindesårheling er blevet grundigt undersøgt hos små pattedyr (dvs. mus, rotter og kaniner), har hornhindefysiologistudier forsømt andre arter, herunder zebrafisk, på trods af at zebrafisk er en klassisk forskningsmodel.

Denne rapport beskriver en metode til at udføre en hornhinde slid på zebrafisk. Såret udføres in vivo på anæstesiiseret fisk ved hjælp af en okulær burr. Denne metode giver mulighed for et reproducerbart epitelsår, der efterlader resten af øjet intakt. Efter slid overvåges sårlukning i løbet af 3 timer, hvorefter såret reepitheialiseres. Ved hjælp af scanning elektronmikroskopi, efterfulgt af billedbehandling, kan epitelcelleformen og apikale fremspring undersøges for at studere de forskellige trin under hornhindeepitelsårlukning.

Zebrafiskmodellens karakteristika gør det muligt at studere epitelvævets fysiologi og epitelcellernes kollektive opførsel, når vævet udfordres. Desuden kan brugen af en model, der er berøvet tårefilmens indflydelse, give nye svar vedrørende hornhinderespons på stress. Endelig tillader denne model også afgrænsning af de cellulære og molekylære hændelser, der er involveret i ethvert epitelvæv, der udsættes for et fysisk sår. Denne metode kan anvendes til evaluering af lægemiddeleffektivitet i præklinisk testning.

Introduction

Da de fleste epiteler er i kontakt med det ydre miljø, er de tilbøjelige til fysisk skade, hvilket gør dem velegnede til undersøgelse af sårhelingsprocesser. Blandt de velundersøgte væv er hornhinden en yderst nyttig model i undersøgelsen af de cellulære og molekylære aspekter af sårheling. Som en gennemsigtig ydre overflade giver den fysisk beskyttelse til øjet og er det første element, der fokuserer lyset på nethinden. Mens nethindens struktur og cellesammensætning varierer mellem art¹, er disse elementer i hornhinden generelt ens i alle kamera-type øjne, uanset art.

Hornhinden består af tre hovedlag². Det første og yderste lag er epitelet, som konstant fornyes for at sikre dets gennemsigtighed. Det andet lag er stroma, som indeholder spredte celler, kaldet keratocytter, inden for et tykt lag af strengt organiserede kollagenfibre. Det tredje og inderste lag er endotelet, som tillader næringsstof- og væskediffusion fra det forreste kammer til de ydre lag. Epitel- og stromalcellerne interagerer via vækstfaktorer og cytokiner³. Denne interaktion fremhæves af den hurtige apoptose og efterfølgende spredning af keratocytter efter epitelskade ^4,5. I tilfælde af et dybere sår, såsom en punktering, tager keratocytter en aktiv rolle i helingsprocessen⁶.

At være i kontakt med det ydre miljø er hornhinde fysiske skader almindelige. Mange af dem er forårsaget af små fremmedlegemer⁷, såsom sand eller støv. Refleksen af øjengnidning kan føre til omfattende epitelafskrabninger og hornhinde ombygning⁸. Ifølge sårstørrelse og dybde er disse fysiske skader smertefulde og tager flere dage at helbrede⁹. De optimale sårhelingsegenskaber ved en model letter forståelsen af de cellulære og molekylære aspekter af sårlukning. Desuden har sådanne modeller også vist sig nyttige til test af nye molekyler med potentiale til at fremskynde hornhindeheling, som tidligere påvist^10,11.

Protokollen beskrevet her har til formål at bruge zebrafisk som en relevant model til at studere hornhinde fysisk skade. Denne model er yderst praktisk til farmakologiske screeningsundersøgelser, da den gør det muligt at tilsætte molekyler direkte til tankvandet og derfor komme i kontakt med en helbredende hornhinde. Detaljerne her vil hjælpe forskere med at udføre deres undersøgelser af zebrafiskmodellen. In vivo-skaden udføres med en sløvet okulær burr. Virkningen på epitelceller, der støder op til eller i en afstand fra den, kan analyseres ved specifikt at fjerne det centrale hornhindeepitel. I de senere år har talrige rapporter fokuseret på en sådan metode på gnaverhornhinde 12,13,14,15,16,17; Indtil videre har kun en enkelt rapport imidlertid anvendt denne metode på zebrafisk¹⁸.

På grund af sin enkelhed er det fysiske sår nyttigt til at afgrænse epitelcellernes rolle i sårlukning. En anden veletableret model af hornhindeskade er den kemiske forbrænding, især alkaliforbrændingen 19,20,21. En sådan tilgang beskadiger imidlertid indirekte hele øjenoverfladen, herunder den perifere hornhinde og hornhinde stroma¹⁹. Faktisk inducerer alkaliforbrændinger potentielt hornhindesår, perforeringer, epiteloacificering og hurtig neovaskularisering²², og det ukontrollable resultat af alkaliforbrændinger diskvalificerer denne tilgang til generelle sårhelingsundersøgelser. Talrige andre metoder anvendes også til at undersøge hornhindesårheling i henhold til det pågældende undersøgelses særlige fokus (f.eks. Fuldstændig epiteldebridering²³, kombinationen af kemisk og mekanisk skade for delvis tykkelse sår²⁴, excimerlaserablation for sår, der strækker sig til stroma²⁵). Brugen af en okulær burr begrænser fokuspunktet til epitelresponset på såret og giver et meget reproducerbart sår.

Som med hver metode til sårpåføring har brugen af en okulær burr fordele og ulemper. Den største ulempe er, at responsen for det meste er epitel, det afspejler ikke perfekt de slid, der ses i den kliniske indstilling. Denne metode har imidlertid mange fordele, herunder den lethed, hvormed den kan oprettes og udføres, dens præcision, dens reproducerbarhed og det faktum, at den er ikke-invasiv, hvilket gør den til en metode, der tolereres godt af dyr.

Protocol

Alle forsøg blev godkendt af det nationale dyreforsøgsråd. 1. Præparater Forbered tricain-stamopløsningen, der anvendes til anæstesi26 på forhånd (0,4% stamopløsning anvendt i denne protokol). Brug handsker og opbevar materialerne i en stinkhætte, når det er muligt. For 50 ml af en 0,4% opløsning vejes 200 mg tricainpulver i et 50 ml rør. Pulveret opløses i ca. 45 ml dobbeltdestilleret vand. Juster pH-værdien …

Representative Results

Denne undersøgelse beskriver en metode ved hjælp af en oftalmisk burr i zebrafisk hornhinde sårheling eksperimenter. Metoden er modificeret fra tidligere studier på mus, hvor graten viste sig at fjerne epitelcellelagene effektivt13. Udfordringerne ved zebrafisk hornhindesår omfatter øjets relativt lille størrelse og i tilfælde af tidskrævende eksperimenter behovet for at opretholde en konstant vandstrøm gennem gællerne (som beskrevet af Xu og kolleger28). De vigt…

Discussion

Hornhinde fysiske skader er den mest almindelige årsag til oftalmologi patientbesøg på hospitalet. Derfor er det vigtigt at etablere relevante modeller til undersøgelse af forskellige aspekter af hornhindepatofysiologi. Indtil videre er musen den mest anvendte model til undersøgelse af hornhindesårheling. Det kan dog være svært at tilføje øjendråber på murine sårede øjne for at validere virkningen af specifikke lægemidler på hornhindesårheling. I den forbindelse er zebrafiskemodellen særlig nyttig til f…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica