Zebrafish कॉर्नियल घाव हीलिंग: घर्षण से घाव बंद इमेजिंग विश्लेषण करने के लिए
Summary
यह प्रोटोकॉल सेलुलर स्तर पर बाद के घाव के बंद होने का आकलन करने के लिए घर्षण के माध्यम से ज़ेब्राफ़िश की ओकुलर सतह को नुकसान पहुंचाने पर केंद्रित है। यह दृष्टिकोण आंशिक रूप से कॉर्नियल एपिथेलियम को हटाने के लिए एक ओकुलर का शोषण करता है और घाव बंद होने के दौरान सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है।
Abstract
आंख की पारदर्शी सतह के रूप में, कॉर्निया स्पष्ट दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है। अपने स्थान के कारण, यह ऊतक पर्यावरणीय अपमान के लिए प्रवण है। दरअसल, आंखों की चोटों को सबसे अधिक बार नैदानिक रूप से सामना करना पड़ता है, वे कॉर्निया के लिए हैं। जबकि कॉर्नियल घाव भरने का बड़े पैमाने पर छोटे स्तनधारियों (यानी, चूहों, चूहों और खरगोशों) में अध्ययन किया गया है, कॉर्नियल फिजियोलॉजी अध्ययनों ने ज़ेबराफ़िश सहित अन्य प्रजातियों की उपेक्षा की है, ज़ेबराफ़िश एक क्लासिक शोध मॉडल होने के बावजूद।
यह रिपोर्ट ज़ेब्राफ़िश पर कॉर्नियल घर्षण करने की एक विधि का वर्णन करती है। घाव एक ओकुलर burr का उपयोग कर anesthetized मछली पर विवो में प्रदर्शन किया जाता है। यह विधि एक पुनरुत्पादक उपकला घाव के लिए अनुमति देती है, जिससे आंख के बाकी हिस्सों को बरकरार रखा जाता है। घर्षण के बाद, घाव बंद करने की निगरानी 3 घंटे के दौरान की जाती है, जिसके बाद घाव को फिर से मापा जाता है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, छवि प्रसंस्करण के बाद, उपकला सेल आकार, और एपिकल प्रोट्रूशियंस की जांच कॉर्नियल उपकला घाव बंद होने के दौरान विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए की जा सकती है।
ज़ेब्राफ़िश मॉडल की विशेषताएं उपकला ऊतक शरीर विज्ञान के अध्ययन और उपकला कोशिकाओं के सामूहिक व्यवहार की अनुमति देती हैं जब ऊतक को चुनौती दी जाती है। इसके अलावा, आंसू फिल्म के प्रभाव से वंचित एक मॉडल का उपयोग तनाव के लिए कॉर्नियल प्रतिक्रिया के बारे में नए जवाब पैदा कर सकता है। अंत में, यह मॉडल किसी भी उपकला ऊतक में शामिल सेलुलर और आणविक घटनाओं के चित्रण की भी अनुमति देता है जो एक भौतिक घाव के अधीन है। इस विधि को प्रीक्लिनिकल परीक्षण में दवा की प्रभावशीलता के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
जैसा कि अधिकांश एपिथेलिया बाहरी वातावरण के संपर्क में हैं, वे शारीरिक चोट के लिए प्रवण हैं, जिससे उन्हें घाव भरने की प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाया जाता है। अच्छी तरह से अध्ययन किए गए ऊतकों में, कॉर्निया घाव भरने के सेलुलर और आणविक पहलुओं की जांच में एक बेहद उपयोगी मॉडल है। एक पारदर्शी बाहरी सतह के रूप में, यह आंख को शारीरिक सुरक्षा प्रदान करता है और रेटिना पर प्रकाश को केंद्रित करने वाला पहला तत्व है। जबकि रेटिना की संरचना और कोशिका संरचना प्रजातियों1 के बीच भिन्न होती है, कॉर्निया के ये तत्व आमतौर पर प्रजातियों की परवाह किए बिना सभी कैमरा-प्रकार की आंखों में समान होते हैं।
कॉर्निया तीन मुख्य परतों से बना है2। पहली और सबसे बाहरी परत उपकला है, जिसे इसकी पारदर्शिता सुनिश्चित करने के लिए लगातार नवीनीकृत किया जाता है। दूसरी परत स्ट्रोमा है, जिसमें बिखरे हुए कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें केराटोसाइट्स कहा जाता है, सख्ती से संगठित कोलेजन फाइबर की मोटी परत के भीतर। तीसरी और सबसे भीतरी परत एंडोथेलियम है, जो पूर्वकाल कक्ष से बाहरी परतों तक पोषक तत्व और तरल प्रसार की अनुमति देती है। उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाएं विकास कारकों और साइटोकिन्स3 के माध्यम से बातचीत करती हैं। इस बातचीत को तेजी से एपोप्टोसिस और उपकला चोट 4,5 के बाद केराटोसाइट्स के बाद के प्रसार द्वारा उजागर किया गया है। एक गहरे घाव के मामले में, जैसे कि एक पंचर, केराटोसाइट्स उपचार प्रक्रिया में एक सक्रिय भाग लेतेहैं 6।
बाहरी वातावरण के संपर्क में होने के नाते, कॉर्नियल शारीरिक चोटें आम हैं। उनमें से कई छोटे विदेशी वस्तुओं के कारण होते हैं7, जैसे कि रेत या धूल। आंख रगड़ के पलटा व्यापक उपकला घर्षण और कॉर्नियल remodeling8 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। घाव के आकार और गहराई के अनुसार, ये शारीरिक चोटें दर्दनाक होती हैं और 9 को ठीक करने में कई दिन लगतेहैं। एक मॉडल की इष्टतम घाव भरने की विशेषताएं घाव बंद होने के सेलुलर और आणविक पहलुओं की समझ की सुविधा प्रदान करती हैं। इसके अलावा, इस तरह के मॉडल कॉर्नियल उपचार में तेजी लाने की क्षमता के साथ नए अणुओं के परीक्षण के लिए भी उपयोगी साबित हुए हैं, जैसा कि पहले10,11 का प्रदर्शन किया गया था।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य कॉर्नियल शारीरिक चोट का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करना है। यह मॉडल औषधीय स्क्रीनिंग अध्ययनों के लिए अत्यधिक सुविधाजनक है क्योंकि यह अणुओं को सीधे टैंक के पानी में जोड़ने की अनुमति देता है और इसलिए, एक उपचार कॉर्निया के संपर्क में आने की अनुमति देता है। यहां दिए गए विवरण वैज्ञानिकों को ज़ेबराफ़िश मॉडल पर अपना अध्ययन करने में मदद करेंगे। इन विवो चोट एक सुस्त ओकुलर के साथ किया जाता है। उपकला कोशिकाओं से सटे या उससे दूरी पर प्रभाव का विश्लेषण विशेष रूप से केंद्रीय कॉर्नियल उपकला को हटाकर किया जा सकता है। हाल के वर्षों में, कई रिपोर्टों ने कृंतक कॉर्निया 12,13,14,15,16,17 पर इस तरह की विधि पर ध्यान केंद्रित किया; हालांकि, आज तक, केवल एक ही रिपोर्ट ने इस विधि को ज़ेबराफ़िश18 पर लागू किया है।
इसकी सादगी के कारण, शारीरिक घाव घाव बंद करने में उपकला कोशिकाओं की भूमिका को चित्रित करने में उपयोगी है। कॉर्नियल चोट का एक और अच्छी तरह से स्थापित मॉडल रासायनिक जला है, विशेष रूप से क्षार 19,20,21 जलाता है। हालांकि, इस तरह का दृष्टिकोण अप्रत्यक्ष रूप से परिधीय कॉर्निया और कॉर्नियल स्ट्रोमा19 सहित पूरी आंख की सतह को नुकसान पहुंचाता है। दरअसल, क्षार जलता है संभावित रूप से कॉर्नियल अल्सर, छिद्र, उपकला opacification, और तेजी से neovascularization22 को प्रेरित करता है, और क्षार जलने का बेकाबू परिणाम सामान्य घाव भरने के अध्ययन के लिए उस दृष्टिकोण को अयोग्य घोषित करता है। कई अन्य तरीकों का उपयोग प्रश्न में अध्ययन के विशेष फोकस के अनुसार कॉर्नियल घाव भरने की जांच करने के लिए भी किया जाता है (उदाहरण के लिए, पूर्ण उपकला डिब्रिडमेंट23, आंशिक-मोटाई घाव24 के लिए रासायनिक और यांत्रिक चोट का संयोजन, स्ट्रोमा25 तक विस्तारित घावों के लिए एक्सिमर लेजर एब्लेशन)। एक ओकुलर बुर का उपयोग घाव के लिए उपकला प्रतिक्रिया के लिए केंद्र बिंदु को प्रतिबंधित करता है और एक अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य घाव प्रदान करता है।
घाव की प्रत्येक विधि के साथ के रूप में, एक ओकुलर burr के उपयोग के फायदे और नुकसान है. मुख्य नुकसान यह है कि प्रतिक्रिया ज्यादातर उपकला होने के नाते, यह नैदानिक सेटिंग में देखे गए घर्षण को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करती है। हालांकि, इस विधि के कई फायदे हैं, जिसमें आसानी से इसे स्थापित और निष्पादित किया जा सकता है, इसकी सटीकता, इसकी पुनरुत्पादकता, और तथ्य यह है कि यह noninvasive है, जिससे यह जानवरों द्वारा अच्छी तरह से सहन की जाने वाली विधि बन जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कॉर्नियल शारीरिक चोटें अस्पताल में नेत्र विज्ञान रोगी के दौरे का सबसे आम कारण हैं। इसलिए, कॉर्नियल पैथोफिजियोलॉजी के विभिन्न पहलुओं के अध्ययन के लिए प्रासंगिक मॉडल स्थापित करना महत्वपूर्ण है। अब तक,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने ज़ेबराफ़िश इकाई तक पहुंच के लिए Pertti Panula और मार्गदर्शन और ज़ेब्राफ़िश प्रयोगों के साथ मदद के लिए हेनरी कोइवुला को धन्यवाद दिया। इस शोध को फिनलैंड की अकादमी, जेन और एटोस एर्को फाउंडेशन, फिनिश सांस्कृतिक फाउंडेशन और एटीआईपी-एवेनिर कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। इमेजिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इकाई और लाइट माइक्रोस्कोपी यूनिट, जैव प्रौद्योगिकी संस्थान में किया गया था, जो HiLIFE और Biocenter Finland द्वारा समर्थित था।
Materials
| 0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
| 0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
| adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| Dissecting plate | in-house | ||
| Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
| double-distilled water | in-house | ||
| Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
| Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
| Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
| mounts | Agar Scientific | G301P | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Plastic spoons | any provider | ||
| Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Soft sponge | any provider | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscope | Leica |
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