Summary
このプロトコールは、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を研究するために、Na+の存在または非存在下でのミトコンドリア複合体活性CI+ CIIIおよびCII + CIIIを使用して比較アッセイを記述する。
Abstract
内側ミトコンドリア膜(IMM)のユビキノン(CoQ)プールは、複合体IまたはFAD依存性酵素のいずれかに部分的にセグメント化されている。このような細分化は、凍結融解ミトコンドリアにおける電子供与体としてNADHまたはコハク酸塩を用いた比較アッセイによって容易に評価することができ、そこではシトクロムc(cyt c)の減少が測定される。このアッセイは、IMMに対するNa+ の効果に依存しており、その流動性を低下させる。ここでは、NaClまたはKClの存在下でNADH-cyt-c酸化還元酵素活性およびコハク酸-cytc酸化還元酵素活性を測定するためのプロトコールを提示する。キュベット内の試薬の混合物に段階的に依存する反応は、Na+ またはK+の存在下で4分間分光光度法で測定される。同じ混合物を、吸光度の非特異的変化を差し引くために、特定の酵素阻害剤の存在下で並行して行う。NADH-cyt c酸化還元酵素活性は、これらの陽イオンのいずれの存在下においても低下しない。しかしながら、コハク酸−cytoc酸化還元酵素活性は、NaClの存在下では低下する。この簡単な実験は、1)IMM流動性およびCoQ伝達の減少におけるNa+ の効果を強調する。2)超錯体I+III2 がユビキノン(CoQ)転移をIMM流動性の低下による影響を受けることから保護すること。3)CIIとCIIIとの間のCoQ転移が、CIIとCIIIとの間のCoQ転移とは機能的に異なること。これらの事実は、IMMにおける機能的に分化したCoQプールの存在を支持し、それらがミトコンドリアの変化するNa+ 環境によって調節され得ることを示している。
Introduction
ミトコンドリア酸化リン酸化系(OXPHOS)は、ミトコンドリアによるアデノシン三リン酸(ATP)合成、活性酸素種(ROS)産生、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)またはコハク酸塩などの還元等価物の消費を駆動する主な経路である。OXPHOS系は5つのタンパク質複合体から構成される:複合体I(CI)はNADHを酸化し、CoQをユビキノール(CoQH2)に還元する。複合体II(CII)は、コハク酸塩をフマル酸に酸化し、CoQをCoQH2に還元する。複合体III(CIII)は、CoQH2を酸化してCoQに戻し、シトクロムc(cyt c)を減少させる。最後に、複合体IV(CIV)はcyt cを酸化し、酸素を水に還元する。この酸化還元鎖、いわゆる電子輸送鎖(mETC)は、IMMを横切るH+のポンピングに結合し、複合体V(CV)がアデノシン二リン酸(ADP)をATPにリン酸化するために使用される電気化学的勾配を作り出す。
mETC 複合体は、IMM 内で単独で存在することも、スーパーコンプレックスと呼ばれる第 4 次構造にアセンブルすることもできます。CIVはCIIIと集合し、III2+IVまたはQ-レスピラソームを形成する(CoQH2の存在下で呼吸することができるように)1,2,3またはホモ二量体またはホモオリゴマー4を形成することができる。CIIIはCIと相互作用し、超錯体I+III25を形成することができる。最後に、CIはまた、Q-スピリアソームと相互作用することができ、I+III2+IVまたはN-スピリアソーム(NADHを消費する呼吸ができるので)1,6,7,8,9,10を構築する。
CoQおよびcyt cは、それぞれCI/CIIからCIIIへ、およびCIIIからCIVへ電子を伝達する役割を担う移動式電子伝達体である。スーパーコンプレックスがこれらのキャリアに機能的な局所的な制限を課すかどうかは、過去20年間にわたって激しい議論の問題でした2,7,11,12,13,14,15,16,17。しかし、いくつかの独立したグループは、CoQおよびcyt cがIMM内のプールに機能的にセグメント化できることを実証している。CoQに関して、CIのための特定のCoQプール(CoQNAD)およびFAD依存性酵素専用の別のプール(CoQFAD)1、7、12、18、19に機能的にセグメント化することができる。しかしながら、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を区別するために、代替オキシダーゼ(AOX)の過剰発現およびCIIIの非存在下でCIを組み立てることができる特異的mtDNA変異体の生成が必要であった1,19,20。
低酸素状態における活性酸素種(ROS)産生のメカニズムは最近まで知られていなかった。急性低酸素症では、CIは活性/不活性(A / D)遷移を起こし、これはH+ポンピングNADH-CoQ酸化還元酵素活性の低下を伴う。このようなH+ポンピングの減少は、ミトコンドリアマトリックスを酸性化し、ミトコンドリアマトリックス中のリン酸カルシウム沈殿物を部分的に溶解させ、可溶性Ca2+を放出する。この可溶性Ca2+の増加は、Na+と引き換えにCa2+を押し出すNa+/Ca2+交換体(NCLX)を活性化する。ミトコンドリアNa+増加は、IMMの内側のリン脂質と相互作用し、その流動性およびCIIとCIIIとの間のCoQ移動を減少させ、最終的にスーパーオキシドアニオン、酸化還元シグナル21を生成する。興味深いことに、CoQ転移はCIIとCIIIの間でのみ減少し、CIとCIIIの間では減少しなかったため、1)Na+はミトコンドリア内の既存のCoQプールの1つだけを調節することができた。2) IMM 内に機能的に分化した CoQ プールが存在する。したがって、ミトコンドリア酵素活性の研究に広く使用されているプロトコールを使用して、言及されたCoQプールの存在を評価することができる。
現在のプロトコールは、酸化されたcyt cの還元の測定に基づいており、CIIIの基質は、コハク酸塩(すなわち、CII基質)またはNADH(すなわち、CI基質)の存在下での吸光度による。同じサンプルを2つに分け、そのうちの1つはKClで処理し、もう1つは同じ濃度のNaClで処理します。このように、Na+がIMM流動性を低下させることを考えると、CoQがIMM内のユニークなプールに存在する場合、CI+CIIIおよびCII+CIIIの両方がNa+の存在下で減少するであろう。しかし、部分的にセグメント化された機能的CoQプールにCoQが存在する場合、Na+の効果はCII + CIII活性にはほとんど(またはのみ)明らかであるが、CI + CIIIには明らかではない。最近発表された21のように、Na+はCIIとCIIIの間のCoQ転移にのみ影響し(図1C,D)、CIとCIIIの間(図1A,B)には影響しない。
このプロトコルは、多数の技術とともに、IMM内に部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を確認するために使用され、1つはCI(すなわち、CoQNAD)に捧げられ、もう1つはFAD結合酵素(すなわち、CoQFAD)専用である1,3,7;この観察は、議論され続けているが、22、いくつかのグループによって独立して裏付けられている7,19。したがって、スーパーコンプレックスへのCIのスーパーアセンブリは、CoQの局所移動度に影響を与え、スーパーコンプレックス1、7、13、14、23、24、25内のCIIIによるその使用を容易にする。
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Protocol
すべての動物実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って行われ、2010年9月22日の欧州連合指令(2010/63/UE)および2013年2月1日のスペイン勅令(53/2013)に従って、スペインのCentro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III(CNIC)の機関倫理委員会によって承認されました。使用される動物の数とその苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。
注:ミトコンドリアCoQプールのセグメンテーションを研究するためのこの比較アッセイは、以下のように記載されている:
1. タンパク質の定量
- 実験前に野生型マウス肝臓から単離したミトコンドリア26 (すなわち、ミトコンドリア膜)を3回凍結融解し、細胞小器官を反応基質に透過させる。
- 単離されたミトコンドリア試料のタンパク質量をブラッドフォードまたはビシンコニン酸(BCA)法により定量する。ブラッドフォードの場合、1 mLの1xブラッドフォード試薬に2 μLのサンプルを加えます。
- サンプルをそれぞれ20μgの4つのサブサンプルに分割します(すなわち、A、B、C、D; 図2A)。
2. CI+CIII活性の測定
メモ:プロトコルのこの部分では、サンプルAとBを使用してCI + CIII活性を測定します(図2B)。
- サンプルAとBをそれぞれ10μgの2つのサブサンプル(すなわちA1、A2、B1、およびB2)に分割します。各サブサンプルを 1 mL キュベットに 30 μL の cyt c (10 mg/mL)、10 μL の 100 mM マロン酸塩と混合し、予熱した C1/C2 バッファー (表 1) を 37 °C で 980 μL まで加えます (キュベット A2 および B2 の場合は 979 μL)。
警告: この手順では、有毒な試薬であるマロン酸塩とシアン化カリウムを使用します。
注:cyt c(10 mg/mL)は、pHを7.2に調整した10 mMK2HPO4 溶液1 mLに10 mgのcyt cを混合することによって新鮮に調製する必要があり、実験中ずっと氷中で維持されなければならない。 - キュベットA1およびA2に10 μLの1 M KClを加え、キュベットB1およびB2に10 μLの1 M NaClを加える。
- 1 μL の 1 mM ロテノンをサブサンプル A2 および B2 を含むキュベットに加えます。
警告: この手順では、毒性試薬ロテノンを使用します。 - 測定の直前に、すべてのキュベットに10 μLのNADH(10 mM)を加えます。
注:10μLは、好ましくはキュベットのステップに添加されるので、反応は混合時に開始される。 - キュベットを慎重に3回ひっくり返して混ぜる。吸光度キュベットリーダー(UV/VISJASCO分光光度計)に入れます。
- [測定>パラメータ>全般]をクリックし、測定パラメータを波長:550nm、時間:4分の読み取り値に設定します。[同意する] ボタンと [開始] ボタンを押して、実験を開始します。
- 測定の最後に、[ ファイル ]と[名前 を付けて保存]をクリックして、吸光度の線形増加を含む傾きを保存します。斜面は手動で収集することもできます。
3. CII+CIII活性の測定
注: プロトコルのこの部分では、サンプル C と D を使用して CII+CIII 活性を測定します (図 2C)。
- サンプル C と D をそれぞれ 10 μg の 2 つのサブサンプル (つまり、C1、C2、D1、および D2) に分割します。各サブサンプルを 1 mL キュベットに 30 μL の cyt c (10 mg/mL)、1 μL の 1 mM ロテノンと混合し、予熱した C1/C2 バッファーを 37 °C で 980 μL まで加えます (キュベット C2 および D2 の場合は 970 μL)。
警告: この手順では、シアン化カリウムとロテノンの毒性試薬を使用します。
注:cyt c(10 mg/mL)は、pHを7.2に調整した10 mMK2HPO4 溶液1 mLに10 mgのcyt cを混合することによって新鮮に調製する必要があり、実験中ずっと氷中で維持されなければならない。 - キュベットC1およびC2に10 μLの1 M KClを加え、キュベットD1およびD2に10 μLの1 M NaClを加える。
- 1 μL の 1 mM アンチマイシン A をサブサンプル C2 および D2 を含むキュベットに加えます。
警告:このステップには、毒性試薬アンチマイシンAの使用が含まれます。 - 測定の直前に、10 μLのコハク酸塩(1 M)をすべてのキュベットに加えます。
注:10μLは、好ましくはキュベットのステップに添加されるので、反応は混合時に開始される。 - キュベットを慎重に混ぜ、3回ひっくり返します。吸光度キュベットリーダー(UV/VIS分光光度計)に入れます。
- 一般>測定>パラメータをクリックし、測定パラメータを波長:550nm、時間:4分の読み取りに設定します。[同意する] ボタンと [開始] ボタンを押して、実験を開始します。
- 測定の最後に、[ ファイル ]と[名前 を付けて保存]をクリックして、吸光度の線形増加を含む傾きを保存します。斜面は手動で収集することもできます。
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Representative Results
このプロトコルの一般的な結果を以下に示します(図3)。減少したcytc吸光度が550nmに位置するように、すべての非阻害サブサンプルは550nmにおける吸光度の増加を示さなければならない。阻害されたサブサンプルは、理想的には平坦な線またはわずかに増加する傾きを示す(図3)。阻害サブサンプルからの傾きは、阻害されていないサブサンプルから減算されます。
サンプルAおよびBは、いずれも相関阻害によって補正され、NADH:cyt c酸化還元酵素活性を表し、同様の傾きを有する(図3A)。しかしながら、サブサンプルCおよびDは、いずれもそれらの相関阻害によって補正され、コハク酸:cyt c酸化還元酵素活性を表すが、サブサンプルCの活性がサブサンプルDの活性よりも高いという点で異なっている(図3B)。なお、基礎吸光度はサンプル間で若干異なる場合がある(図3A)。
これらの結果(すなわち、それらの阻害剤によって既に補正された傾き; 表2)使用されるタンパク質の量(0.01mg)をa.u./min/mgタンパク質として割ることによって表すことができる。この値から、cyt c減少の速度は、ランバービールの法則21を用いてさらに計算することができる。
重要なことに、これらの結果は、いくつかの要因によって異なり得る:(i)サンプルの起源。異なる組織および細胞型がOXPHOS複合体およびスーパー複合体の可変組成を有することを考えると、絶対値および相対変化はサンプル間で異なる可能性がある。(ii)異なる組織がOXPHOS複合体およびスーパー複合体の組成が可変であり得ることを考えると、凍結融解ミトコンドリアをより多く添加すること(特定の組織のより低い絶対値を補償するため)を反応混合物に加えることは、サンプル中のタンパク質/リン脂質のmg当たりのNa+ またはK+ の比が減少するという二次的な効果を有し得る。したがって、ミトコンドリアの量またはサンプルに添加されるNa+/K+ 濃度のいずれかを変化させる場合は注意が必要です。(iii)実験間変動は、凍結融解サイクルの持続時間および温度、市販のバッチの試薬、または単離されたミトコンドリアの可変保存緩衝液から生じ得る。
図1:Na+はCIIとCIIIの間の電子移動を特異的に減少させるが、CIとCIIIの間では減少させない。 (A)超錯体I+III2においてCoQ NADを介して起こるNADHとcyt cとの間の電子移動の概略図。(b)NADHとcyt cとの間の電子移動は、超錯体I+III2中のCoQNADを介して起こるが、ミトコンドリア内Na+の影響を受けない。(c)CIIにおけるCoQFADを介して起こるコハク酸とcyt cとの間の電子移動の概略図。(d)NADHとcyt cとの間の電子移動は、超錯体I+III2中のCoQFADを介して起こるが、高いミトコンドリア内Na+によって減少する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:元のサンプルの細分化から速度論的測定までのプロトコルの概略図。(A)すべてのサブサンプルの同じ原点を強調したサブサンプル分割の概略図。(b)サブサンプルA1およびB1におけるCI+CIII活性に対する試薬の添加の連続するステップのスキーム。赤い円は、NADH が理想的に追加される場所を表します。サブサンプルA2およびB2との唯一の違いは、後者にロテノンが余分に添加されていることであることに注意してください。(c)サブサンプルC1およびD1におけるCII+CIII活性に対する試薬の添加の連続するステップのスキーム。赤い円は、コハク酸塩が理想的に追加されるべき場所を表す。サブサンプルC2およびD2との唯一の違いは、後者におけるアンチマイシンAの余分な添加であることに留意されたい。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NADHまたはコハク酸塩添加時のマウス肝臓ミトコンドリア膜によるcyt c減少に対するNa+ の効果。(a)NADHを酸化するマウス肝臓ミトコンドリア膜によるcyt c還元に対するNa+ の効果を示す代表的な微量。(b)コハク酸を酸化するマウス肝臓ミトコンドリア膜によるcyt c還元に対するNa+ の効果を示す代表的な微量。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 化合物 | 濃度 |
| K2HPO4 | 25ミリオンメートル |
| マグネシウム2 | 5ミリオン |
| ティッカー | 3ミリオン |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | 2.5 ミリグラム/ミリリットル |
表 1: C1/C2 バッファーの構成 緩衝液組成物はモル濃度で提示される。
| 予想料金 | +KCl (平均) | +KCl (SD) | +NaCl (平均) | +NaCl (SD) | マン・ホイットニー P 値 |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| 個々の値 | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| 個々の値 | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
表 2: 予想料金の範囲 各アクティビティの期待値は、任意の単位で表されます。+KClと+NaClの間の対応する統計的検定も提示される。「n」は反復数を表す。
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Discussion
このプロトコルは、部分的にセグメント化されたCoQプールの存在を識別するための非常に簡単な手順を表していますが、考慮すべきいくつかの重要なステップがあります。基質(すなわち、NADHまたはコハク酸塩)は、これらの化合物の自己酸化が起こり得るので最後に添加することが好ましい。キュベットの反転は、読み取りを妨げる可能性のある気泡の形成を避けるために注意する必要があります。
さらに、現在の手法には、言及する価値のあるいくつかの制限があります。測定は無傷のミトコンドリアでは行われない。したがって、緩衝液の人工的な含有量および割合は、ミトコンドリアの天然環境との相違をもたらし得る。
試薬は過剰に添加され、無傷の組織における基質の真の可用性を表していない可能性があります。
現在の方法は、多くの研究室で容易に入手できない非常に特異的な遺伝子モデルおよび機器の生成および使用を暗示している1。このプロトコルは、広く入手可能な試薬およびツールを使用して、部分的に分化したCoQプールの存在を測定するための信頼性が高く簡単な方法を提供します。これにより、ミトコンドリア病の遺伝子モデルを比較した今後の研究に応用することができる。
mETC中の移動性電子伝達体の移動度は、部分的に分化したプールの存在が受け入れられつつある7,12,18,28,29が依然として非常に議論されているトピック25,27である。最近、AOX1を発現するいくつかのOXPHOS変異体の高分解能呼吸測定と詳細な生化学的特性評価、ならびに天然脂質環境7を保存する洗練された凍結電子顕微鏡研究が議論に光を当てました。これは、部分的にセグメント化された機能的なCoQプールの存在を支持する重い議論を提起します。
さらに、生理学的刺激は、異なるCoQプールによって調節されることが示されている。特に、ミトコンドリア内Na+によって駆動される急性低酸素反応。低酸素状態のミトコンドリアにおけるNa+ レベルが高いほど、CIIとCIIIの間の電子移動が減少し、CIIIのレベルでQサイクルが解離し、スーパーオキシドアニオンが生成される。対照的に、CIとCIIIとの間の電子移動は減少しなかった21。現在のプロトコルでは、これらの結果が得られる手順を幅広く説明しています。
研究中の治療がセルルまたはインビボで行われる場合、CI、CII、およびCIIIの単離された複雑な活性であり、それらの個々の量または単一の活性が治療とともに変化する可能性があるため、さらなる対照を現在のプロトコールに適用することができる。上記と非常によく似た手順に従って、Na+の存在下または非存在下でのこれらの単離された活性21のいずれにおいても差異は見られなかった。なお、Na+はD/A遷移30を増大させることができることが記載されている。しかしながら、この観察に使用されたプロトコルは、サブミトコンドリア粒子(SMP)の使用を含んでいたが、我々のプロトコルはミトコンドリア膜を使用し、考慮された効果30のためにIMM全体にわたる膜電位の必要性を強調した。
凍結融解サイクルは洗剤のように膜を溶解しないので、単一の複合体およびスーパー複合体は依然としてリン脂質二重層に結合していることに留意すべきである。これは、CIまたはCIIのいずれかを介した凍結融解ミトコンドリア酸素消費量が、シトクロムc31の存在下で測定され得るという事実によって証明される。さらに、凍結融解サイクルがCII + CIII活性に及ぼす影響がある場合、「NaCl 10mM」サンプルだけでなく、「KCl 10mM」サンプルにも見られるであろう。これにより、測定が不可能になるか(CIIは膜分解によってCIIIから分離されるため)、K+とNa+の違いが見られない点まで低下します。ただし、図 2B に示すように、そうではありません。プロトコルへのKClの添加は、測定された活性に対する浸透圧またはイオン強度のいずれかの可能性のある影響を破棄するように設計されています。どちらの場合も、「10 mM KCl」サンプルと「10 mM NaCl」サンプルの最終的な浸透圧は等しく(116 mEq/L)、サンプル間の唯一の違いは10 mM K+または10 mM Na+の存在です。それにもかかわらず、バッファーからのK+陽イオンが効果を持つと、「KCl 10 mM」と「NaCl 10 mM」の両方のサンプルで現れ、どちらのサンプルでもそのような効果は識別できません。
異なる陽イオンがリン脂質に結合する能力において、実際に重要なのは配位化学と各陽イオンのイオン半径である(我々の元の論文21で実験的に強調されているように、そして理論的にはBöckmann et al.32で強調されているように)。K+が6の平均配位数を示すのに対し、Na+平均配位数は5であり、異なる配位複素幾何学をもたらし、これはリン脂質二重層33に対するK+およびNa+の非常に異なる効果に変換される。
また、K+とNa+のイオン半径が異なることにも留意すべきである。K+が280pmのイオン半径を有するのに対し、Na+は227pmのイオン半径を有する。この差は、イオン半径が低い(すなわち、電子殻が少ない)と負に荷電した分子との相互作用をより強くし、正のイオン核が余分な電子殻(すなわち、より高いイオン半径)を有するかのように露出するので、アニオン(または双性イオン)との相互作用に直接影響する。実際、すべての陽イオンはおそらくリン脂質と相互作用することができる。しかし、特定の化学的物理的性質を有するものだけが、Na+のようなリン脂質二重層に特異的な効果を有することができる。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
我々は、技術支援をしてくれたR・マルティネス・デ・メナ博士、M・M・ムニョス・エルナンデス・A・C・ヒメネス博士及びE・R・マルティネス・ヒメネス博士に感謝する。この研究はMICIN:RTI2018-099357-B-I00およびHFSP(RGP0016/2018)によって支援された。CNICは、カルロス3世サルード研究所(ISCIII)、シエンシア大臣、イノヴァシオン・イ・ユニベルシダデス(MCNU)、プロCNIC財団の支援を受けており、セヴェロ・オチョア・センター・オブ・エクセレンス(SEV-2015-0505)です。図 2 は、BioRender.com で作成したものです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
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