Минимально инвазивная, точная и эффективная методика интратермической инъекции мышам
Summary
Настоящий протокол описывает интервенционную радиологическую процедуру, установленную для внутриутимической инъекции мышам, чтобы избежать риска открытой операции и повысить точность слепых чрескожных инъекций.
Abstract
Интратермическая инъекция в мышиные модели является важным методом изучения тимической и иммунной функции, включая генетические и приобретенные Т-клеточные расстройства. Для этого требуются методы прямого осаждения реагентов и/или клеток в тимус живых мышей. Традиционные методы интратимических инъекций включают торакальную хирургию или минимально инвазивные чрескожные слепые инъекции, оба из которых имеют значительные ограничения. Сверхвысокочастотные ультразвуковые устройства визуализации сделали возможными чрескожные инъекции с визуальным контролем у мышей, значительно повысив точность инъекций чрескожного инъекционного подхода и позволив впрыскивать меньшие мишени. Тем не менее, инъекции с визуальным управлением полагаются на использование интегрированной железнодорожной системы, что делает эту процедуру жесткой и трудоемкой. Здесь представлен уникальный, безопасный и эффективный метод чрескожных внутриутомных инъекций у мышей, исключающий зависимость от рельсовой системы для инъекций. Метод основан на использовании микрозвукового блока высокого разрешения для неинвазивного изображения тимуса мыши. Используя технику свободной руки, радиолог может поместить кончик иглы непосредственно в тимус мыши под сонографическим руководством. Мышей очищают и анестезируют перед визуализацией. Для опытного радиолога, специалиста по ультразвуковым процедурам, период обучения заявленной методике довольно короткий, как правило, в течение одного сеанса. Метод имеет низкий уровень заболеваемости и смертности для мышей и намного быстрее, чем современные методы механической помощи для чрескожной инъекции. Это позволяет исследователю эффективно выполнять точные и надежные чрескожные инъекции тимуса любого размера (включая очень маленькие органы, такие как тимус пожилых или иммунодефицитных мышей) с минимальной нагрузкой на животное. Этот метод позволяет при желании вводить отдельные доли и облегчает крупномасштабные эксперименты благодаря экономящему времени характеру процедуры.
Introduction
Тимус играет важную роль в развитии Т-клеток и иммунитета. Дефицит Т-клеток, который может быть вызван инволюцией тимуса, генетическими нарушениями, инфекциями и лечением рака, среди других факторов, приводит к высокой смертности и заболеваемости 1,2. Мышиные модели незаменимы как в фундаментальных, так и в трансляционных иммунологических исследованиях и используются в течение десятилетий для изучения биологии тимуса и развития Т-клеток, а также для разработки методов лечения для тех, кто страдает от дисфункции тимуса и дефицита Т-клеток 3,4,5.
Центральной частью исследований тимуса была внутритиремическая инъекция биологических материалов, таких как клетки, гены или белки в мышиных моделях 6,7,8,9,10,11,12. Обычные методы интратимических инъекций используют торакотомию с последующей внутриутимической инъекцией под прямой визуализацией или «слепой» чрескожной инъекцией в средостение. Хирургический подход значительно увеличивает риск пневмоторакса, среди прочих. Кроме того, повышенный стресс во время этой операции приводит к иммуносупрессии, что потенциально ставит под угрозу иммунологические данные13. Опытные исследователи, после некоторой практики, могут выполнить технику слепой инъекции, но такой подход менее точен и, следовательно, ограничивает подопытных молодыми мышами с большим тимусом.
Использование ультразвукового наведения было введено в качестве точной и минимально инвазивной альтернативы традиционным интратермическим инъекционным подходам14. Однако эта процедура очень трудоемка при использовании интегрированной рельсовой системы вместо техники свободной руки. Выполнение инъекций с помощью инжекторного крепления требует тщательной оптимизации изображения и позиционирования датчика с помощью различных приспособлений, таких как стойка и крепление преобразователя, система позиционирования X, Y и Z, а также умелое управление микроманипуляторами и расширения рельсовой системы. Здесь представлена простая альтернативная методика, ультразвуковая инъекция тимуса, выполняемая рентгенологом с использованием подхода15 от руки, который является одновременно быстрой и точной минимально инвазивной альтернативой вышеописанным методам. Важно отметить, что нынешний подход может быть выполнен с любой системой ультразвуковой визуализации высокого разрешения без необходимости установки для инъекций и интегрированной рельсовой системы. Он особенно полезен для исследований, требующих инъекции большого числа мышей11, для экспериментов, включающих инъекцию обеих долей тимуса, или для точной инъекции небольших тимусов у пожилых, облученных или иммунокомпрометированных мышей12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ультразвуковая инъекция в свободную руку является высокоточным методом доставки учебных материалов к тимусу эффективным и асептическим способом. После первоначальной стерилизации кожи в месте инъекции стерильность сохраняется во время процедуры благодаря использованию стерильных…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Раймонда Х. Торнтона за его проницательную и всестороннюю раннюю работу над этой техникой. Это исследование финансировалось грантовой поддержкой Национального института рака (NCI 1R37CA250661-01A1), Ассоциации исследований лейкемии у детей, Медицинской школы Hackensack Meridian и Фонда HUMC / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O’Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
