Une technique mini-invasive, précise et efficace pour l’injection intrathymique chez la souris
Summary
Le présent protocole décrit une procédure de radiologie interventionnelle établie pour l’injection intrathymique chez la souris afin d’éviter le risque de chirurgie ouverte et d’améliorer la précision des injections percutanées à l’aveugle.
Abstract
L’injection intrathymique dans des modèles murins est une technique importante pour étudier la fonction thymique et immunitaire, y compris les troubles génétiques et les troubles des lymphocytes T acquis. Cela nécessite des méthodes pour le dépôt direct de réactifs et / ou de cellules dans le thymus de souris vivantes. Les méthodes traditionnelles d’injection intrathymique comprennent la chirurgie thoracique ou les injections percutanées à l’aveugle mini-invasives, qui ont toutes deux des limites importantes. Les appareils d’imagerie par ultrasons à ultra-haute fréquence ont rendu possibles les injections percutanées guidées par l’image chez la souris, améliorant considérablement la précision d’injection de l’approche d’injection percutanée et permettant l’injection de cibles plus petites. Cependant, les injections guidées par l’image reposent sur l’utilisation d’un système ferroviaire intégré, ce qui en fait une procédure rigide et longue. Une méthode unique, sûre et efficace pour les injections intrathymiques percutanées chez la souris est présentée ici, éliminant ainsi la dépendance au système de rail pour les injections. La technique repose sur l’utilisation d’une unité de micro-échographie à haute résolution pour imager le thymus de la souris de manière non invasive. En utilisant une technique à main levée, un radiologue peut placer une pointe d’aiguille directement dans le thymus de la souris sous guidage échographique. Les souris sont nettoyées et anesthésiées avant l’imagerie. Pour un radiologue expérimenté adepte des procédures guidées par ultrasons, la période d’apprentissage de la technique énoncée est assez courte, généralement en une séance. La méthode a un faible taux de morbidité et de mortalité pour les souris et est beaucoup plus rapide que les techniques assistées mécaniques actuelles pour l’injection percutanée. Il permet à l’investigateur d’effectuer efficacement des injections percutanées précises et fiables de thymus de toute taille (y compris de très petits organes tels que le thymus de souris âgées ou immunodéficientes) avec un stress minimal sur l’animal. Cette méthode permet l’injection de lobes individuels si désiré et facilite les expériences à grande échelle en raison de la nature rapide de la procédure.
Introduction
Le thymus joue un rôle essentiel dans le développement et l’immunité des lymphocytes T. La carence en lymphocytes T, qui peut être causée par l’involution thymique, les troubles génétiques, les infections et les traitements contre le cancer, entre autres facteurs, entraîne une mortalité et une morbidité élevées 1,2. Les modèles murins sont indispensables dans la recherche en immunologie fondamentale et translationnelle et sont utilisés depuis des décennies pour étudier la biologie thymique et le développement des lymphocytes T, ainsi que pour développer des traitements pour les personnes souffrant de dysfonction thymique et de déficit en lymphocytes T 3,4,5.
Une partie centrale des recherches thymiques a été l’injection intrathymique de matériel biologique tel que des cellules, des gènes ou des protéines dans les modèles murins 6,7,8,9,10,11,12. Les méthodes conventionnelles d’injection intrathymique utilisent la thoracotomie suivie d’une injection intrathymique sous visualisation directe ou d’une injection percutanée « aveugle » dans le médiastin. L’approche chirurgicale augmente considérablement le risque de pneumothorax, entre autres. De plus, le stress élevé pendant cette chirurgie entraîne une immunosuppression, compromettant ainsi potentiellement les données immunologiques13. Des chercheurs expérimentés, après un peu de pratique, peuvent effectuer la technique d’injection à l’aveugle, mais cette approche est moins précise et limite donc les sujets expérimentaux aux jeunes souris avec un gros thymus.
L’utilisation du guidage échographique a été introduite comme une alternative précise et peu invasive aux approches traditionnelles d’injection intrathymique14. Cependant, cette procédure prend beaucoup de temps lors de l’utilisation du système ferroviaire intégré au lieu de la technique à main levée. L’exécution d’injections avec le support d’injection nécessite une optimisation minutieuse de l’imagerie et le positionnement du transducteur à l’aide des différents accessoires tels que le support et le support du transducteur, le système de positionnement X, Y et Z, ainsi qu’un fonctionnement efficace des commandes de micro-manipulation et des extensions du système de rail. Une technique alternative simple, l’injection thymique guidée par ultrasons, est présentée ici par un radiologue utilisant une approche à main levée15, qui est à la fois une alternative mini-invasive rapide et précise aux méthodes décrites ci-dessus. Il est important de noter que l’approche actuelle peut être réalisée avec n’importe quel système d’imagerie par ultrasons haute résolution sans avoir besoin d’un support d’injection et d’un système de rail intégré. Il est particulièrement utile pour les études nécessitant l’injection d’un grand nombre de souris11, pour les expériences impliquant l’injection des deux lobes thymiques ou pour l’injection précise de petits thymus chez des souris âgées, irradiées ou immunodéprimées12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une injection à main levée guidée par ultrasons est une technique très précise pour administrer du matériel d’étude au thymus de manière efficace et aseptique. Après la stérilisation initiale de la peau au site d’injection, la stérilité est maintenue pendant la procédure grâce à l’utilisation de gants stériles, de couvercles de sonde à ultrasons stériles et de gel à ultrasons stérile. Contrairement à l’approche percutanée aveugle 10,17 ou au recours à des incisions chirurgicales pour la vis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Raymond H. Thornton pour ses premiers travaux perspicaces et complets sur cette technique. Cette étude a été financée par des subventions du National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), de la Children’s Leukemia Research Association, de la Hackensack Meridian School of Medicine et de la HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
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