Una tecnica minimamente invasiva, accurata ed efficiente per l'iniezione intratimica nei topi
Summary
Il presente protocollo descrive una procedura di radiologia interventistica stabilita per l’iniezione intratimica nei topi per evitare il rischio di chirurgia aperta e migliorare l’accuratezza delle iniezioni percutanee cieche.
Abstract
L’iniezione intratimica in modelli murini è una tecnica importante per lo studio della funzione timica e immunitaria, comprese le malattie genetiche e acquisite delle cellule T. Ciò richiede metodi per la deposizione diretta di reagenti e / o cellule nel timo di topi vivi. I metodi tradizionali di iniezione intratimica includono la chirurgia toracica o iniezioni mini-invasive percutanee in cieco, entrambe con limitazioni significative. I dispositivi di imaging ad ultrasuoni ad altissima frequenza hanno reso possibili iniezioni percutanee guidate da immagini nei topi, migliorando notevolmente l’accuratezza dell’iniezione dell’approccio di iniezione percutanea e consentendo l’iniezione di bersagli più piccoli. Tuttavia, le iniezioni guidate da immagini si basano sull’utilizzo di un sistema ferroviario integrato, rendendo questa procedura rigida e dispendiosa in termini di tempo. Qui viene presentato un metodo unico, sicuro ed efficiente per le iniezioni intratimiche percutanee nei topi, eliminando la dipendenza dal sistema binario per le iniezioni. La tecnica si basa sull’utilizzo di un’unità micro-ecografica ad alta risoluzione per visualizzare il timo del topo in modo non invasivo. Utilizzando una tecnica a mano libera, un radiologo può posizionare una punta dell’ago direttamente nel timo del topo sotto guida ecografica. I topi vengono puliti e anestetizzati prima dell’imaging. Per un radiologo esperto esperto in procedure ecoguidate, il periodo di apprendimento per la tecnica dichiarata è piuttosto breve, in genere all’interno di una sessione. Il metodo ha un basso tasso di morbilità e mortalità per i topi ed è molto più veloce delle attuali tecniche assistite meccanicamente per l’iniezione percutanea. Consente allo sperimentatore di eseguire in modo efficiente iniezioni percutanee precise e affidabili di timo di qualsiasi dimensione (compresi organi molto piccoli come il timo di topi anziani o immunodeficienti) con uno stress minimo sull’animale. Questo metodo consente l’iniezione di singoli lobi se lo si desidera e facilita esperimenti su larga scala grazie alla natura che consente di risparmiare tempo della procedura.
Introduction
Il timo ha un ruolo essenziale nello sviluppo e nell’immunità delle cellule T. La carenza di cellule T, che può essere causata da involuzione timica, malattie genetiche, infezioni e trattamenti contro il cancro, tra gli altri fattori, porta ad un’elevata mortalità e morbilità 1,2. I modelli murini sono indispensabili nella ricerca immunologica sia di base che traslazionale e sono stati utilizzati per decenni per studiare la biologia timica e lo sviluppo delle cellule T, nonché per sviluppare trattamenti per coloro che soffrono di disfunzione timica e deficit di cellule T 3,4,5.
Una parte centrale delle indagini timiche è stata l’iniezione intratimica di materiali biologici come cellule, geni o proteine nei modelli murini 6,7,8,9,10,11,12. I metodi convenzionali di iniezione intratimica utilizzano toracotomia seguita da iniezione intratimica sotto visualizzazione diretta o da iniezione percutanea “cieca” nel mediastino. L’approccio chirurgico aumenta significativamente il rischio di pneumotorace, tra gli altri. Inoltre, l’elevato stress durante questo intervento chirurgico provoca immunosoppressione, compromettendo così potenzialmente i dati immunologici13. I ricercatori esperti, dopo un po ‘di pratica, possono eseguire la tecnica di iniezione cieca, ma questo approccio è meno accurato e quindi limita i soggetti sperimentali ai topi giovani con un grande timo.
L’utilizzo della guida ecografica è stato introdotto come alternativa precisa e minimamente invasiva ai tradizionali approcci di iniezione intratimica14. Tuttavia, questa procedura richiede molto tempo quando si utilizza il sistema ferroviario integrato anziché la tecnica a mano libera. L’esecuzione delle iniezioni con il supporto di iniezione richiede un’attenta ottimizzazione delle immagini e il posizionamento del trasduttore con l’aiuto dei vari accessori come il supporto e il supporto del trasduttore, il sistema di posizionamento X, Y e Z, nonché un funzionamento efficiente dei controlli di micromanipolazione e delle estensioni del sistema ferroviario. Una semplice tecnica alternativa, l’iniezione timica ecoguidata, viene qui presentata eseguita da un radiologo utilizzando un approccio a mano libera15, che è un’alternativa minimamente invasiva rapida e accurata ai metodi sopra descritti. È importante sottolineare che l’approccio attuale può essere eseguito con qualsiasi sistema di imaging a ultrasuoni ad alta risoluzione senza bisogno di un supporto di iniezione e di un sistema di guida integrato. È particolarmente utile per gli studi che richiedono l’iniezione di un gran numero di topi11, per esperimenti che coinvolgono l’iniezione di entrambi i lobi timici o per l’iniezione accurata di piccoli timo in topi anziani, irradiati o immunocompromessi12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un’iniezione a mano libera guidata da ultrasuoni è una tecnica altamente accurata per fornire materiali di studio al timo in modo efficiente e asettico. Dopo la sterilizzazione iniziale della pelle nel sito di iniezione, la sterilità viene mantenuta durante la procedura grazie all’uso di guanti sterili, coperture sterili per sonde ad ultrasuoni e gel per ultrasuoni sterili. In contrasto con l’approccio percutaneo cieco 10,17 o affidandosi a incisioni chirurgiche per la visualizzazione diretta del timo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Raymond H. Thornton per il suo lavoro iniziale perspicace e completo su questa tecnica. Questo studio è stato finanziato dal sostegno del National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), della Children’s Leukemia Research Association, della Hackensack Meridian School of Medicine e della HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
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