Eine minimal-invasive, genaue und effiziente Technik zur intrathymischen Injektion bei Mäusen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein interventionelles radiologisches Verfahren, das für die intrathymische Injektion bei Mäusen eingerichtet wurde, um das Risiko einer offenen Operation zu vermeiden und die Genauigkeit blinder perkutaner Injektionen zu verbessern.
Abstract
Die intrathymische Injektion in Mausmodellen ist eine wichtige Technik zur Untersuchung der Thymus- und Immunfunktion, einschließlich genetischer und erworbener T-Zell-Störungen. Dies erfordert Methoden zur direkten Ablagerung von Reagenzien und/oder Zellen in den Thymus lebender Mäuse. Traditionelle Methoden der intrathymischen Injektion umfassen Thoraxchirurgie oder minimalinvasive perkutane Blindinjektionen, die beide erhebliche Einschränkungen aufweisen. Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebungsgeräte haben bildgeführte perkutane Injektionen bei Mäusen ermöglicht, wodurch die Injektionsgenauigkeit des perkutanen Injektionsansatzes erheblich verbessert und die Injektion kleinerer Ziele ermöglicht wurde. Bildgeführte Injektionen sind jedoch auf die Verwendung eines integrierten Schienensystems angewiesen, was dies zu einem starren und zeitaufwändigen Verfahren macht. Hier wird eine einzigartige, sichere und effiziente Methode für perkutane intrathymische Injektionen bei Mäusen vorgestellt, wodurch die Abhängigkeit vom Schienensystem für Injektionen entfällt. Die Technik beruht auf der Verwendung einer hochauflösenden Mikroultraschalleinheit, um den Mausthymus nichtinvasiv abzubilden. Mittels Freihandtechnik kann ein Radiologe unter sonographischer Anleitung eine Nadelspitze direkt in den Mausthymus einführen. Mäuse werden vor der Bildgebung gereinigt und betäubt. Für einen erfahrenen Radiologen, der sich mit ultraschallgeführten Verfahren auskennt, ist die Lernzeit für die angegebene Technik recht kurz, typischerweise innerhalb einer Sitzung. Die Methode hat eine niedrige Morbiditäts- und Mortalitätsrate für die Mäuse und ist viel schneller als aktuelle mechanisch unterstützte Techniken zur perkutanen Injektion. Es ermöglicht dem Forscher, präzise und zuverlässige perkutane Injektionen von Thymus jeder Größe (einschließlich sehr kleiner Organe wie dem Thymus von gealterten oder immundefizienten Mäusen) mit minimaler Belastung für das Tier effizient durchzuführen. Diese Methode ermöglicht auf Wunsch die Injektion einzelner Lappen und erleichtert aufgrund der Zeitersparnis des Verfahrens groß angelegte Experimente.
Introduction
Der Thymus spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung und Immunität von T-Zellen. T-Zell-Mangel, der unter anderem durch Thymusinvolution, genetische Störungen, Infektionen und Krebsbehandlungen verursacht werden kann, führt zu hoher Mortalität und Morbidität 1,2. Mausmodelle sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der translationalen Immunologieforschung unverzichtbar und werden seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Thymusbiologie und T-Zell-Entwicklung sowie zur Entwicklung von Therapien für Menschen mit Thymusdysfunktion und T-Zell-Mangel eingesetzt 3,4,5.
Ein zentraler Bestandteil der Thymusuntersuchungen war die intrathymische Injektion von biologischem Material wie Zellen, Genen oder Proteinen in Mausmodellen 6,7,8,9,10,11,12. Konventionelle intrathymische Injektionsmethoden verwenden Thorakotomie, gefolgt von intrathymischer Injektion unter direkter Visualisierung oder durch “blinde” perkutane Injektion in das Mediastinum. Der chirurgische Ansatz erhöht unter anderem das Pneumothorax-Risiko signifikant. Darüber hinaus führt der erhöhte Stress während dieser Operation zu einer Immunsuppression, wodurch möglicherweise immunologische Daten beeinträchtigtwerden 13. Erfahrene Forscher können nach einiger Übung die Blindinjektionstechnik durchführen, aber dieser Ansatz ist weniger genau und beschränkt daher Versuchspersonen auf junge Mäuse mit einem großen Thymus.
Die Verwendung der Ultraschallführung wurde als präzise und minimalinvasive Alternative zu herkömmlichen intrathymischen Injektionsansätzen eingeführt14. Dieses Verfahren ist jedoch sehr zeitaufwendig, wenn anstelle der Freihandtechnik das integrierte Schienensystem verwendet wird. Die Durchführung von Injektionen mit der Injektionshalterung erfordert eine sorgfältige Optimierung der Bildgebung und Positionierung des Wandlers mit Hilfe der verschiedenen Befestigungen wie dem Wandlerständer und der Halterung, dem X-, Y- und Z-Positioniersystem sowie eine kompetente Bedienung der Mikromanipulationssteuerungen und Schienensystemerweiterungen. Eine einfache alternative Technik, die ultraschallgesteuerte Thymusinjektion, wird hier von einem Radiologen unter Verwendung eines Freihandansatzes15 vorgestellt, der sowohl eine schnelle als auch genaue minimalinvasive Alternative zu den oben beschriebenen Methoden darstellt. Wichtig ist, dass der aktuelle Ansatz mit jedem hochauflösenden Ultraschall-Bildgebungssystem durchgeführt werden kann, ohne dass eine Injektionshalterung und ein integriertes Schienensystem erforderlich sind. Es ist besonders nützlich für Studien, die die Injektion einer großen Anzahl von Mäusenerfordern 11, für Experimente, bei denen beide Thymuslappen injiziert werden, oder für die genaue Injektion kleiner Thymusen in ältere, bestrahlte oder immungeschwächte Mäuse12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine ultraschallgeführte Freihandinjektion ist eine hochgenaue Technik, um Studienmaterialien effizient und aseptisch an den Thymus zu liefern. Nach der ersten Sterilisation der Haut an der Injektionsstelle bleibt die Sterilität während des Verfahrens durch die Verwendung von sterilen Handschuhen, sterilen Ultraschallsondenabdeckungen und sterilem Ultraschallgel erhalten. Im Gegensatz zum blinden perkutanen Ansatz 10,17 oder dem Einsatz chirurgischer Schnitte zur direkten Visualisierung des Thymus18,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Raymond H. Thornton für seine aufschlussreichen und umfassenden frühen Arbeiten zu dieser Technik. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), der Children’s Leukemia Research Association, der Hackensack Meridian School of Medicine und der HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer finanziert.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
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