마우스에서 흉강내 주사를 위한 최소 침습적이고 정확하며 효율적인 기술
Summary
본 프로토콜은 개복 수술의 위험을 피하고 맹검 경피 주사의 정확도를 향상시키기 위해 마우스에서 흉선 내 주사를 위해 확립 된 중재 적 방사선 절차를 설명합니다.
Abstract
마우스 모델에서 흉선내 주사는 유전 및 후천성 T 세포 장애를 포함한 흉선 및 면역 기능을 연구하는 중요한 기술입니다. 이를 위해서는 시약 및/또는 세포를 살아있는 마우스의 흉선에 직접 침착시키는 방법이 필요합니다. 흉강 내 주사의 전통적인 방법에는 흉부 수술 또는 최소 침습 경피적 맹검 주사가 포함되며 둘 다 상당한 한계가 있습니다. 초고주파 초음파 영상 장치는 마우스에서 이미지 유도 경피 주사를 가능하게 하여 경피적 주사 접근 방식의 주입 정확도를 크게 향상시키고 더 작은 표적의 주입을 가능하게 합니다. 그러나 이미지 유도 주입은 통합 레일 시스템의 활용에 의존하므로 엄격하고 시간이 많이 소요되는 절차입니다. 마우스에서 경피적 흉선 내 주사를 위한 독특하고 안전하며 효율적인 방법이 여기에 제시되어 주사를 위한 레일 시스템에 대한 의존도를 제거합니다. 이 기술은 고해상도 마이크로 초음파 장치를 사용하여 마우스 흉선을 비 침습적으로 이미지화하는 데 의존합니다. 자유형 기술을 사용하여 방사선 전문의는 초음파 안내에 따라 바늘 끝을 마우스 흉선에 직접 놓을 수 있습니다. 마우스는 이미징 전에 세척되고 마취됩니다. 초음파 유도 절차에 능숙한 숙련된 방사선 전문의의 경우 명시된 기술에 대한 학습 기간은 일반적으로 한 세션 내에서 매우 짧습니다. 이 방법은 마우스에 대한 이환율과 사망률이 낮고 경피 주사를위한 현재의 기계적 보조 기술보다 훨씬 빠릅니다. 이를 통해 조사자는 동물에 대한 스트레스를 최소화하면서 모든 크기의 흉선 (노화 또는 면역 결핍 마우스의 흉선과 같은 매우 작은 기관 포함)의 정확하고 신뢰할 수있는 경피 주사를 효율적으로 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 원하는 경우 개별 로브를 주입할 수 있으며 절차의 시간 절약 특성으로 인해 대규모 실험을 용이하게 합니다.
Introduction
흉선은 T 세포 발달과 면역에 필수적인 역할을합니다. 흉선 침범, 유전 질환, 감염 및 암 치료로 인해 발생할 수 있는 T 세포 결핍은 높은 사망률과 이환율을 유발합니다1,2. 마우스 모델은 기초 및 중개 면역학 연구 모두에서 없어서는 안될 필수 요소이며 흉선 생물학 및 T 세포 발달을 연구하고 흉선 기능 장애 및 T 세포 결핍으로 고통받는 사람들을위한 치료법을 개발하는 데 수십 년 동안 사용되어 왔습니다 3,4,5.
흉선 조사 의 중심 부분은 마우스 모델 6,7,8,9,10,11,12 에서 세포, 유전자 또는 단백질과 같은 생물학적 물질의 흉선 내 주입이었습니다. 기존의 흉강 내 주사 방법은 개흉술 후 직접 시각화 또는 종격동으로의 “맹검” 경피 주사를 사용하는 흉강내 주사를 사용합니다. 외과적 접근은 무엇보다도 기흉 위험을 크게 증가시킵니다. 더욱이, 이 수술 중 상승된 스트레스는 면역억제를 초래하여 잠재적으로 면역학적 데이터를 손상시킬 수 있다13. 숙련 된 연구자들은 약간의 연습을 한 후에 블라인드 주사 기술을 수행 할 수 있지만이 접근법은 정확도가 떨어지므로 실험 대상을 큰 흉선을 가진 어린 마우스로 제한합니다.
초음파 유도의 활용은 전통적인 흉강 내 주사 접근법14에 대한 정확하고 최소 침습적 대안으로 도입되었습니다. 그러나이 절차는 자유형 기술 대신 통합 레일 시스템을 사용할 때 매우 시간이 많이 걸립니다. 주입 마운트로 주입을 수행하려면 변환기 스탠드 및 마운트, X, Y 및 Z 위치 지정 시스템과 같은 다양한 부착물을 사용하여 변환기를 신중하게 이미징하고 위치를 지정해야 하며 미세 조작 제어 장치 및 레일 시스템 확장의 능숙한 작동이 필요합니다. 간단한 대체 기술인 초음파 유도 흉선 주사가 자유형 접근법(15)을 사용하여 방사선 전문의에 의해 수행되며, 이는 상술한 방법에 대한 신속하고 정확한 최소 침습적 대안이다. 중요한 것은 현재의 접근 방식은 주입 마운트 및 통합 레일 시스템 없이 모든 고해상도 초음파 이미징 시스템으로 수행할 수 있다는 것입니다. 이는 많은 수의 마우스(11)의 주사를 필요로 하는 연구, 양쪽 흉선엽의 주사를 포함하는 실험, 또는 노화, 방사선 조사 또는 면역이 저하된 마우스(12)에서 작은 흉선의 정확한 주사에 특히 유용하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초음파 유도 자유 손 주사는 효율적이고 무균 방식으로 흉선에 연구 자료를 전달하는 매우 정확한 기술입니다. 주사 부위에서 피부의 초기 멸균 후, 멸균 장갑, 멸균 초음파 프로브 커버 및 멸균 초음파 젤의 사용으로 인해 절차 중에 멸균이 유지됩니다. 맹검 경피적 접근법 10,17 또는 마우스의 흉선 내 주사에 일반적으로 사용되는 방법 인 흉선18,19의 직접 시각화를위한 외과 적 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 기술에 대한 통찰력 있고 포괄적 인 초기 작업에 대해 Raymond H. Thornton에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 암 연구소 (NCI 1R37CA250661-01A1), 어린이 백혈병 연구 협회, Hackensack Meridian School of Medicine 및 HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer의 보조금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
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