Een minimaal invasieve, nauwkeurige en efficiënte techniek voor intrathymische injectie bij muizen
Summary
Het huidige protocol beschrijft een interventionele radiologieprocedure die is vastgesteld voor intrathymische injectie bij muizen om het risico van open chirurgie te vermijden en de nauwkeurigheid van blinde percutane injecties te verbeteren.
Abstract
Intrathymische injectie in muismodellen is een belangrijke techniek voor het bestuderen van thymus- en immuunfunctie, inclusief genetische en verworven T-celaandoeningen. Dit vereist methoden voor de directe afzetting van reagentia en/of cellen in de thymus van levende muizen. Traditionele methoden van intrathymische injectie omvatten thoracale chirurgie of minimaal invasieve percutane blinde injecties, die beide aanzienlijke beperkingen hebben. Ultra-hoogfrequente ultrasone beeldvormingsapparaten hebben beeldgeleide percutane injecties mogelijk gemaakt bij muizen, waardoor de injectienauwkeurigheid van de percutane injectiebenadering aanzienlijk is verbeterd en de injectie van kleinere doelen mogelijk is geworden. Beeldgeleide injecties zijn echter afhankelijk van het gebruik van een geïntegreerd railsysteem, waardoor dit een rigide en tijdrovende procedure is. Een unieke, veilige en efficiënte methode voor percutane intrathymische injecties bij muizen wordt hier gepresenteerd, waardoor de afhankelijkheid van het railsysteem voor injecties wordt geëlimineerd. De techniek is gebaseerd op het gebruik van een micro-echografie-eenheid met hoge resolutie om de thymus van de muis niet-invasief in beeld te brengen. Met behulp van een techniek met de vrije hand kan een radioloog onder echografische begeleiding een naaldpunt rechtstreeks in de thymus van de muis plaatsen. Muizen worden gereinigd en verdoofd voordat ze in beeld worden gebracht. Voor een ervaren radioloog die bedreven is in echogeleide procedures, is de leerperiode voor de vermelde techniek vrij kort, meestal binnen één sessie. De methode heeft een lage morbiditeit en mortaliteit voor de muizen en is veel sneller dan de huidige mechanisch ondersteunde technieken voor percutane injectie. Het stelt de onderzoeker in staat om efficiënt nauwkeurige en betrouwbare percutane injecties van thymuses van elke grootte uit te voeren (inclusief zeer kleine organen zoals de thymus van verouderde of immunodeficiënte muizen) met minimale stress voor het dier. Deze methode maakt de injectie van individuele lobben indien gewenst mogelijk en vergemakkelijkt grootschalige experimenten vanwege het tijdbesparende karakter van de procedure.
Introduction
De thymus heeft een essentiële rol in de ontwikkeling en immuniteit van T-cellen. T-celdeficiëntie, die kan worden veroorzaakt door thymusinvolutie, genetische aandoeningen, infecties en kankerbehandelingen, leidt onder andere tot hoge mortaliteit en morbiditeit 1,2. Muismodellen zijn onmisbaar in zowel fundamenteel als translationeel immunologisch onderzoek en worden al tientallen jaren gebruikt om thymusbiologie en T-celontwikkeling te bestuderen, evenals om behandelingen te ontwikkelen voor mensen die lijden aan thymusdisfunctie en T-celdeficiëntie 3,4,5.
Een centraal onderdeel van thymusonderzoek is de intrathymische injectie van biologische materialen zoals cellen, genen of eiwitten in muismodellen 6,7,8,9,10,11,12. Conventionele intrathymische injectiemethoden gebruiken thoracotomie gevolgd door intrathymische injectie onder directe visualisatie of door “blinde” percutane injectie in het mediastinum. De chirurgische aanpak verhoogt onder andere het pneumothoraxrisico aanzienlijk. Bovendien resulteert de verhoogde stress tijdens deze operatie in immunosuppressie, waardoor immunologische gegevens mogelijk in gevaar komen13. Ervaren onderzoekers kunnen, na enige oefening, de blinde injectietechniek uitvoeren, maar deze aanpak is minder nauwkeurig en beperkt daarom experimentele proefpersonen tot jonge muizen met een grote thymus.
Het gebruik van ultrasone begeleiding is geïntroduceerd als een nauwkeurig en minimaal invasief alternatief voor traditionele intrathymische injectiebenaderingen14. Deze procedure is echter zeer tijdrovend bij het gebruik van het geïntegreerde railsysteem in plaats van de techniek met de vrije hand. Het uitvoeren van injecties met de injectiebevestiging vereist zorgvuldige beeldvormingsoptimalisatie en positionering van de transducer met behulp van de verschillende hulpstukken, zoals de transducerstandaard en -houder, het X-, Y- en Z-positioneringssysteem, evenals een bekwame bediening van de micromanipulatieregelaars en railsysteemuitbreidingen. Een eenvoudige alternatieve techniek, echogeleide thymusinjectie, wordt hier gepresenteerd door een radioloog met behulp van een benadering uit de vrije hand15, wat zowel een snel als nauwkeurig minimaal invasief alternatief is voor de hierboven beschreven methoden. Belangrijk is dat de huidige aanpak kan worden uitgevoerd met elk ultrasoon beeldvormingssysteem met hoge resolutie zonder dat een injectiebevestiging en een geïntegreerd railsysteem nodig zijn. Het is vooral nuttig voor studies die de injectie van grote aantallen muizenvereisen 11, voor experimenten met de injectie van beide thymuslobben, of voor de nauwkeurige injectie van kleine thymus bij verouderde, bestraalde of immuungecompromitteerde muizen12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een echogeleide injectie met vrije hand is een zeer nauwkeurige techniek om studiemateriaal op een efficiënte en aseptische manier aan de thymus te leveren. Na de initiële sterilisatie van de huid op de injectieplaats, wordt de steriliteit tijdens de procedure gehandhaafd als gevolg van het gebruik van steriele handschoenen, steriele ultrasone sondehoezen en steriele ultrasone gel. In tegenstelling tot de blinde percutane benadering 10,17 of vertrouwen op chiru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Raymond H. Thornton bedanken voor zijn inzichtelijke en uitgebreide vroege werk aan deze techniek. Deze studie werd gefinancierd door subsidiesteun van het National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), de Children’s Leukemia Research Association, de Hackensack Meridian School of Medicine en de HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O’Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
