تقنية طفيفة التوغل ودقيقة وفعالة للحقن داخل الزعتر في الفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء الأشعة التداخلية الذي تم إنشاؤه للحقن داخل الغدة الصعترية في الفئران لتجنب خطر الجراحة المفتوحة وتحسين دقة الحقن الأعمى عن طريق الجلد.
Abstract
يعد الحقن داخل الثعترية في نماذج الفئران تقنية مهمة لدراسة وظيفة الغدة الصعترية والمناعة ، بما في ذلك اضطرابات الخلايا التائية الوراثية والمكتسبة. وهذا يتطلب طرقا للترسب المباشر للكواشف و / أو الخلايا في الغدة الصعترية للفئران الحية. تشمل الطرق التقليدية للحقن داخل الغدة الصعترية جراحة الصدر أو الحقن الأعمى عن طريق الجلد طفيف التوغل ، وكلاهما له قيود كبيرة. جعلت أجهزة التصوير بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد الحقن عن طريق الجلد الموجهة بالصور ممكنة في الفئران ، مما أدى إلى تحسين دقة الحقن بشكل كبير لنهج الحقن عن طريق الجلد وتمكين حقن أهداف أصغر. ومع ذلك ، تعتمد الحقن الموجهة بالصور على استخدام نظام سكة حديد متكامل ، مما يجعل هذا الإجراء صارما ويستغرق وقتا طويلا. يتم تقديم طريقة فريدة وآمنة وفعالة للحقن داخل الغدة الصعترية عن طريق الجلد في الفئران هنا ، مما يلغي الاعتماد على نظام السكك الحديدية للحقن. تعتمد هذه التقنية على استخدام وحدة الموجات فوق الصوتية الدقيقة عالية الدقة لتصوير الغدة الصعترية للفأر بشكل غير جراحي. باستخدام تقنية اليد الحرة ، يمكن لأخصائي الأشعة وضع طرف إبرة مباشرة في الغدة الصعترية للفأر تحت توجيه التصوير بالموجات فوق الصوتية. يتم تنظيف الفئران وتخديرها قبل التصوير. بالنسبة لأخصائي الأشعة المتمرس الماهر في الإجراءات الموجهة بالموجات فوق الصوتية ، فإن فترة التعلم للتقنية المذكورة قصيرة جدا ، عادة في غضون جلسة واحدة. هذه الطريقة لديها معدل مراضة ووفيات منخفض للفئران وهي أسرع بكثير من التقنيات الحالية بمساعدة ميكانيكية للحقن عن طريق الجلد. يسمح للمحقق بإجراء حقن دقيقة وموثوقة عن طريق الجلد بكفاءة من الغدة الصعترية من أي حجم (بما في ذلك الأعضاء الصغيرة جدا مثل الغدة الصعترية للفئران المسنة أو التي تعاني من نقص المناعة) مع الحد الأدنى من الضغط على الحيوان. تتيح هذه الطريقة حقن الفصوص الفردية إذا رغبت في ذلك وتسهل التجارب واسعة النطاق بسبب طبيعة الإجراء الموفرة للوقت.
Introduction
تلعب الغدة الصعترية دورا أساسيا في نمو الخلايا التائية والمناعة. يؤدي نقص الخلايا التائية ، الذي يمكن أن يحدث بسبب ارتداد الغدة الصعترية ، والاضطرابات الوراثية ، والالتهابات ، وعلاجات السرطان ، من بين عوامل أخرى ، إلى ارتفاع معدل الوفيات والمراضة 1,2. لا غنى عن نماذج الفئران في كل من أبحاث المناعة الأساسية والانتقالية وقد استخدمت لعقود لدراسة بيولوجيا الغدة الصعترية وتطور الخلايا التائية ، وكذلك لتطوير علاجات لأولئك الذين يعانون من ضعف الغدة الصعترية ونقص الخلايا التائية3،4،5.
كان الجزء المركزي من تحقيقات الغدة الصعترية هو الحقن داخل الغدة الصعترية للمواد البيولوجية مثل الخلايا أو الجينات أو البروتينات في نماذج الفئران6،7،8،9،10،11،12. تستخدم طرق الحقن التقليدية داخل الغدة الصعترية بضع الصدر متبوعا بالحقن داخل الثعترية تحت التصور المباشر أو عن طريق الحقن “الأعمى” عن طريق الجلد في المنصف. النهج الجراحي يزيد بشكل كبير من خطر استرواح الصدر، من بين أمور أخرى. علاوة على ذلك ، يؤدي الإجهاد المرتفع أثناء هذه الجراحة إلى كبت المناعة ، مما قد يضر بالبيانات المناعية13. يمكن للباحثين ذوي الخبرة ، بعد بعض الممارسة ، إجراء تقنية الحقن الأعمى ، ولكن هذا النهج أقل دقة ، وبالتالي ، يقصر الموضوعات التجريبية على الفئران الشابة ذات الغدة الصعترية الكبيرة.
تم تقديم استخدام إرشادات الموجات فوق الصوتية كبديل دقيق وطفيف التوغل لنهج الحقن التقليدي داخل الثعترية14. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء يستغرق وقتا طويلا للغاية عند استخدام نظام السكك الحديدية المتكامل بدلا من تقنية اليد الحرة. يتطلب إجراء الحقن باستخدام حامل الحقن تحسينا دقيقا للتصوير وتحديد موضع محول الطاقة بمساعدة الملحقات المختلفة مثل حامل وحامل محول الطاقة ، ونظام تحديد المواقع X و Y و Z ، بالإضافة إلى التشغيل المتقن لأدوات التحكم في التلاعب الدقيق وتمديدات نظام السكك الحديدية. يتم تقديم تقنية بديلة بسيطة ، حقن الغدة الصعترية الموجهة بالموجات فوق الصوتية ، هنا من قبل أخصائي الأشعة باستخدام نهج اليد الحرة15 ، وهو بديل سريع ودقيق طفيف التوغل للطرق الموصوفة أعلاه. الأهم من ذلك ، يمكن تنفيذ النهج الحالي مع أي نظام تصوير بالموجات فوق الصوتية عالي الدقة دون الحاجة إلى حامل حقن ونظام سكة حديد متكامل. إنه مفيد بشكل خاص للدراسات التي تتطلب حقن أعداد كبيرة من الفئران11 ، أو للتجارب التي تنطوي على حقن كل من فصوص الغدة الصعترية ، أو للحقن الدقيق للزعترات الصغيرة في الفئران المسنة أو المشععة أو التي تعاني من نقص المناعة12.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحقن اليدوي الموجه بالموجات فوق الصوتية هو تقنية دقيقة للغاية لتوصيل مواد الدراسة إلى الغدة الصعترية بطريقة فعالة ومعقمة. بعد التعقيم الأولي للجلد في موقع الحقن ، يتم الحفاظ على العقم أثناء الإجراء بسبب استخدام قفازات معقمة وأغطية مسبار الموجات فوق الصوتية المعقمة وهلام الموجات فوق ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ريموند ثورنتون على عمله المبكر الثاقب والشامل في هذه التقنية. تم تمويل هذه الدراسة من خلال دعم المنح من المعهد الوطني للسرطان (NCI 1R37CA250661-01A1) ، وجمعية أبحاث سرطان الدم للأطفال ، وكلية هاكنساك ميريديان للطب ، ومؤسسة HUMC / معالجة سرطان الأطفال.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O’Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
