Uma técnica minimamente invasiva, precisa e eficiente para injeção intratímica em camundongos
Summary
O presente protocolo descreve um procedimento de radiologia intervencionista estabelecido para injeção intratímica em camundongos para evitar o risco de cirurgia aberta e melhorar a precisão das injeções percutâneas cegas.
Abstract
A injeção intratímica em modelos de camundongos é uma técnica importante para o estudo da função tímica e imunológica, incluindo distúrbios genéticos e de células T adquiridas. Isso requer métodos para a deposição direta de reagentes e/ou células no timo de camundongos vivos. Os métodos tradicionais de injeção intratímica incluem cirurgia torácica ou injeções cegas percutâneas minimamente invasivas, ambas com limitações significativas. Os dispositivos de imagem de ultra-alta frequência tornaram possíveis injeções percutâneas guiadas por imagem em camundongos, melhorando muito a precisão da injeção da abordagem de injeção percutânea e permitindo a injeção de alvos menores. No entanto, as injeções guiadas por imagem dependem da utilização de um sistema ferroviário integrado, tornando este um procedimento rígido e demorado. Um método único, seguro e eficiente para injeções intratímicas percutâneas em camundongos é apresentado aqui, eliminando a dependência do sistema ferroviário para injeções. A técnica baseia-se no uso de uma unidade de micro-ultra-som de alta resolução para visualizar o timo do rato de forma não invasiva. Usando uma técnica de mão livre, um radiologista pode colocar uma ponta de agulha diretamente no timo do rato sob orientação ultrassonográfica. Os ratos são limpos e anestesiados antes da imagem. Para um radiologista experiente adepto de procedimentos guiados por ultrassom, o período de aprendizado para a técnica declarada é bastante curto, normalmente dentro de uma sessão. O método tem uma baixa taxa de morbidade e mortalidade para os camundongos e é muito mais rápido do que as técnicas atuais de injeção percutânea assistida mecanicamente. Ele permite que o investigador realize eficientemente injeções percutâneas precisas e confiáveis de timos de qualquer tamanho (incluindo órgãos muito pequenos, como o timo de camundongos idosos ou imunodeficientes) com o mínimo de estresse sobre o animal. Este método permite a injeção de lobos individuais, se desejado, e facilita experimentos em larga escala devido à natureza de economia de tempo do procedimento.
Introduction
O timo tem um papel essencial no desenvolvimento e imunidade das células T. A deficiência de células T, que pode ser causada por involução tímica, distúrbios genéticos, infecções e tratamentos contra o câncer, entre outros fatores, leva a alta mortalidade e morbidade 1,2. Os modelos de camundongos são indispensáveis tanto na pesquisa em imunologia básica quanto translacional e têm sido utilizados há décadas para estudar a biologia tímica e o desenvolvimento de células T, bem como para desenvolver tratamentos para aqueles que sofrem de disfunção tímica e deficiência de células T 3,4,5.
Uma parte central das investigações tímicas tem sido a injeção intratímica de materiais biológicos, como células, genes ou proteínas, em modelos de camundongos 6,7,8,9,10,11,12. Os métodos convencionais de injeção intratímica usam toracotomia seguida de injeção intratímica sob visualização direta ou por injeção percutânea “cega” no mediastino. A abordagem cirúrgica aumenta significativamente o risco de pneumotórax, entre outros. Além disso, o estresse elevado durante essa cirurgia resulta em imunossupressão, comprometendo potencialmente os dados imunológicos13. Pesquisadores experientes, após alguma prática, podem realizar a técnica de injeção cega, mas essa abordagem é menos precisa e, portanto, limita os sujeitos experimentais a camundongos jovens com um grande timo.
A utilização da orientação ultrassonográfica tem sido introduzida como uma alternativa precisa e minimamente invasiva às abordagens tradicionais de injeção intratímica14. No entanto, este procedimento é muito demorado ao usar o sistema ferroviário integrado em vez da técnica de mão livre. A realização de injeções com o suporte de injeção requer otimização de imagem cuidadosa e posicionamento do transdutor com a ajuda dos vários acessórios, como o suporte e a montagem do transdutor, o sistema de posicionamento X, Y e Z, bem como a operação proficiente dos controles de micromanipulação e extensões do sistema ferroviário. Uma técnica alternativa simples, a injeção tímica guiada por ultrassom, é apresentada aqui por um radiologista usando uma abordagem à mão livre15, que é uma alternativa minimamente invasiva rápida e precisa aos métodos descritos acima. É importante ressaltar que a abordagem atual pode ser realizada com qualquer sistema de imagem de ultrassom de alta resolução sem a necessidade de um suporte de injeção e um sistema de trilho integrado. É especialmente útil para estudos que requerem a injeção de um grande número de camundongos11, para experimentos envolvendo a injeção de ambos os lobos tímicos, ou para a injeção precisa de pequenos timos em camundongos idosos, irradiados ou imunocomprometidos12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma injeção à mão livre guiada por ultrassom é uma técnica altamente precisa para fornecer materiais de estudo ao timo de forma eficiente e asséptica. Após a esterilização inicial da pele no local da injeção, a esterilidade é mantida durante o procedimento devido ao uso de luvas estéreis, tampas estéreis de sonda de ultrassom e gel de ultrassom estéril. Em contraste com a abordagem percutânea cega10,17 ou contando com incisões cirúrgicas para visualização direta do timo<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Raymond H. Thornton por seu trabalho inicial perspicaz e abrangente sobre essa técnica. Este estudo foi financiado pelo apoio financeiro do Instituto Nacional do Câncer (NCI 1R37CA250661-01A1), da Children’s Leukemia Research Association, da Hackensack Meridian School of Medicine e da HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
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