चूहों में इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव, सटीक और कुशल तकनीक
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए स्थापित एक इंटरवेंशनल रेडियोलॉजी प्रक्रिया का वर्णन करता है ताकि खुली सर्जरी के जोखिम से बचा जा सके और अंधे परक्यूटेनियस इंजेक्शन की सटीकता में सुधार किया जा सके।
Abstract
माउस मॉडल में इंट्राथिमिक इंजेक्शन थाइमिक और प्रतिरक्षा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है, जिसमें आनुवंशिक और अधिग्रहित टी सेल विकार शामिल हैं। इसके लिए जीवित चूहों के थाइमस में अभिकर्मकों और / या कोशिकाओं के प्रत्यक्ष जमाव के तरीकों की आवश्यकता होती है। इंट्राथिमिक इंजेक्शन के पारंपरिक तरीकों में थोरैसिक सर्जरी या न्यूनतम इनवेसिव परक्यूटेनियस ब्लाइंड इंजेक्शन शामिल हैं, जिनमें से दोनों की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। अल्ट्रा-हाई फ्रीक्वेंसी अल्ट्रासाउंड इमेजिंग उपकरणों ने चूहों में छवि-निर्देशित पर्क्युटेनियस इंजेक्शन को संभव बना दिया है, जिससे परक्यूटेनियस इंजेक्शन दृष्टिकोण की इंजेक्शन सटीकता में काफी सुधार हुआ है और छोटे लक्ष्यों के इंजेक्शन को सक्षम किया गया है। हालांकि, छवि-निर्देशित इंजेक्शन एक एकीकृत रेल प्रणाली के उपयोग पर निर्भर करते हैं, जिससे यह एक कठोर और समय लेने वाली प्रक्रिया बन जाती है। चूहों में परक्यूटेनियस इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए एक अनूठी, सुरक्षित और कुशल विधि यहां प्रस्तुत की गई है, जो इंजेक्शन के लिए रेल प्रणाली पर निर्भरता को समाप्त करती है। तकनीक माउस थाइमस को गैर-आक्रामक रूप से चित्रित करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रो-अल्ट्रासाउंड इकाई का उपयोग करने पर निर्भर करती है। एक फ्री-हैंड तकनीक का उपयोग करके, एक रेडियोलॉजिस्ट सोनोग्राफिक मार्गदर्शन के तहत माउस थाइमस में सीधे सुई की नोक रख सकता है। इमेजिंग से पहले चूहों को साफ और एनेस्थेटाइज किया जाता है। अल्ट्रासाउंड-निर्देशित प्रक्रियाओं में निपुण एक अनुभवी रेडियोलॉजिस्ट के लिए, बताई गई तकनीक के लिए सीखने की अवधि काफी कम है, आमतौर पर एक सत्र के भीतर। इस विधि में चूहों के लिए कम रुग्णता और मृत्यु दर है और पर्क्यूटेनियस इंजेक्शन के लिए वर्तमान यांत्रिक रूप से सहायता प्राप्त तकनीकों की तुलना में बहुत तेज है। यह अन्वेषक को जानवर पर न्यूनतम तनाव के साथ किसी भी आकार के थाइमस (वृद्ध या इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों के थाइमस जैसे बहुत छोटे अंगों सहित) के सटीक और विश्वसनीय परक्यूटेनियस इंजेक्शन को कुशलतापूर्वक करने की अनुमति देता है। यह विधि वांछित होने पर व्यक्तिगत लोब के इंजेक्शन को सक्षम बनाती है और प्रक्रिया की समय-बचत प्रकृति के कारण बड़े पैमाने पर प्रयोगों की सुविधा प्रदान करती है।
Introduction
थाइमस की टी सेल के विकास और प्रतिरक्षा में एक आवश्यक भूमिका है। टी सेल की कमी, जो अन्य कारकों के बीच थाइमिक इनवोल्यूशन, आनुवंशिक विकार, संक्रमण और कैंसर उपचार के कारण हो सकती है, उच्च मृत्यु दर और रुग्णता 1,2 की ओर ले जाती है। माउस मॉडल बुनियादी और ट्रांसलेशनल इम्यूनोलॉजी अनुसंधान दोनों में अपरिहार्य हैं और दशकों से थाइमिक जीव विज्ञान और टी सेल विकास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, साथ ही थाइमिक डिसफंक्शन और टी सेल की कमी से पीड़ित लोगों के लिए उपचार विकसित करने के लिए 3,4,5।
थाइमिक जांच का एक केंद्रीय हिस्सा माउस मॉडल 6,7,8,9,10,11,12 में कोशिकाओं, जीन या प्रोटीन जैसे जैविक सामग्रियों का इंट्राथिमिक इंजेक्शन रहा है। पारंपरिक इंट्राथिमिक इंजेक्शन विधियां थोराकोटॉमी का उपयोग करती हैं, जिसके बाद प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के तहत इंट्राथिमिक इंजेक्शन या मीडियास्टिनम में “ब्लाइंड” परक्यूटेनियस इंजेक्शन द्वारा। सर्जिकल दृष्टिकोण दूसरों के बीच न्यूमोथोरैक्स जोखिम को काफी बढ़ाता है। इसके अलावा, इस सर्जरी के दौरान ऊंचा तनाव इम्यूनोसप्रेशन का परिणाम होता है, इस प्रकार संभावित रूप से इम्यूनोलॉजिकल डेटा13 से समझौता होता है। अनुभवी शोधकर्ता, कुछ अभ्यास के बाद, अंधे इंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन कर सकते हैं, लेकिन यह दृष्टिकोण कम सटीक है और इसलिए, प्रयोगात्मक विषयों को एक बड़े थाइमस के साथ युवा चूहों तक सीमित करता है।
अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन का उपयोग पारंपरिक इंट्राथिमिक इंजेक्शन दृष्टिकोण14 के लिए एक सटीक और न्यूनतम इनवेसिव विकल्प के रूप में पेश किया गया है। हालांकि, फ्री-हैंड तकनीक के बजाय एकीकृत रेल प्रणाली का उपयोग करते समय यह प्रक्रिया बहुत समय लेने वाली है। इंजेक्शन माउंट के साथ इंजेक्शन करने के लिए ट्रांसड्यूसर स्टैंड और माउंट, एक्स, वाई और जेड पोजिशनिंग सिस्टम जैसे विभिन्न अनुलग्नकों की मदद से ट्रांसड्यूसर के सावधानीपूर्वक इमेजिंग अनुकूलन और स्थिति की आवश्यकता होती है, साथ ही माइक्रो-मैनिपुलेशन नियंत्रण और रेल सिस्टम एक्सटेंशन के कुशल संचालन की आवश्यकता होती है। एक सरल वैकल्पिक तकनीक, अल्ट्रासाउंड-निर्देशित थाइमिक इंजेक्शन, यहां एक रेडियोलॉजिस्ट द्वारा फ्री-हैंड दृष्टिकोण15 का उपयोग करके प्रस्तुत किया गया है, जो उपरोक्त वर्णित विधियों के लिए एक तेज़ और सटीक न्यूनतम इनवेसिव विकल्प दोनों है। महत्वपूर्ण रूप से, वर्तमान दृष्टिकोण इंजेक्शन माउंट और एकीकृत रेल प्रणाली की आवश्यकता के बिना किसी भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम के साथ किया जा सकता है। यह विशेष रूप से चूहों की बड़ी संख्या के इंजेक्शन की आवश्यकता वाले अध्ययनों के लिए उपयोगी है, दोनों थाइमिक लोब के इंजेक्शन से जुड़े प्रयोगों के लिए, या वृद्ध, विकिरणित, या इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों12 में छोटे थाइमस के सटीक इंजेक्शन के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक अल्ट्रासाउंड-निर्देशित फ्री-हैंड इंजेक्शन एक कुशल और सड़न रोकनेवाला तरीके से थाइमस को अध्ययन सामग्री देने के लिए एक अत्यधिक सटीक तकनीक है। इंजेक्शन स्थल पर त्वचा की प्रारंभिक नसबंदी के बाद, बाँझ द?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस तकनीक पर अपने व्यावहारिक और व्यापक प्रारंभिक काम के लिए रेमंड एच थॉर्नटन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एनसीआई 1 आर 37सीए 250661-01 ए 1), चिल्ड्रन ल्यूकेमिया रिसर्च एसोसिएशन, हैकेनसैक मेरिडियन स्कूल ऑफ मेडिसिन और एचयूएमसी फाउंडेशन / डील किड्स कैंसर से अनुदान सहायता द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
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