Summary
Dans ce protocole, la méthode de purification par affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et la méthode d’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT) ont été optimisées pour l’interrogation par appariement du transcriptome ovarien et de l’épigénome spécifiques à la cellule à l’aide du modèle murin NuTRAP croisé vers une lignée de souris Cyp17a1-Cre.
Abstract
L’évaluation des changements épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type cellulaire est essentielle pour comprendre le vieillissement ovarien. À cette fin, l’optimisation de la méthode de purification par affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et l’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT) ont été réalisées pour l’interrogation ultérieure par appariement du transcriptome ovarien et de l’épigénome spécifiques à la cellule à l’aide d’un nouveau modèle murin NuTRAP transgénique. L’expression de l’allèle NuTRAP est sous le contrôle d’une cassette STOP floxed et peut être ciblée sur des types spécifiques de cellules ovariennes à l’aide de lignées Cre spécifiques au promoteur. Étant donné que des études récentes ont impliqué les cellules stromales ovariennes dans la conduite des phénotypes de vieillissement prématuré, le système d’expression NuTRAP a ciblé les cellules stromales à l’aide d’un pilote Cyp17a1-Cre. L’induction de la construction NuTRAP était spécifique aux fibroblastes stromaux ovariens, et suffisamment d’ADN et d’ARN pour les études de séquençage ont été obtenus à partir d’un seul ovaire. Le modèle NuTRAP et les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour étudier n’importe quel type de cellule ovarienne avec une lignée Cre disponible.
Introduction
Les ovaires sont des acteurs majeurs du vieillissement somatique1, avec des contributions distinctes de populations cellulaires spécifiques. L’hétérogénéité cellulaire de l’ovaire rend difficile l’interprétation des résultats moléculaires des tests en vrac sur des ovaires entiers. Comprendre le rôle de populations cellulaires spécifiques dans le vieillissement ovarien est essentiel pour identifier les facteurs moléculaires responsables du déclin de la fertilité et de la santé chez les femmes âgées. Traditionnellement, l’évaluation multi-omique de types spécifiques de cellules ovariennes était réalisée par des techniques telles que la microdissection laser2, les approches unicellulaires3 ou le tri cellulaire4. Cependant, la microdissection peut être coûteuse et difficile à réaliser, et le tri cellulaire peut modifier les profils phénotypiquescellulaires 5.
Une nouvelle approche pour évaluer les profils épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type de cellules ovariennes utilise le modèle murin NuTRAP (Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purity). Le modèle NuTRAP permet d’isoler des acides nucléiques spécifiques au type cellulaire sans avoir besoin de trier les cellules en utilisant les méthodes de purification par affinité : purification d’affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT)6. L’expression de l’allèle NuTRAP est sous le contrôle d’une cassette STOP floxed et peut être ciblée sur des types spécifiques de cellules ovariennes à l’aide de lignées Cre spécifiques au promoteur. En croisant la souris NuTRAP avec une lignée Cre spécifique au type cellulaire, le retrait de la cassette STOP provoque le marquage eGFP du complexe ribosomique et le marquage biotine/mCherry du noyau d’une manière Cre-dépendante6. Les techniques TRAP et INTACT peuvent ensuite être utilisées pour isoler l’ARNm et l’ADN nucléaire du type cellulaire d’intérêt et procéder à des analyses transcriptomiques et épigénomiques.
Le modèle NuTRAP a été utilisé dans différents tissus, tels que le tissu adipeux6, le tissu cérébral 7,8,9 et la rétine10, pour révéler des changements épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type cellulaire qui peuvent ne pas être détectés dans l’homogénat de tissu entier. Les avantages de l’approche NuTRAP par rapport aux techniques traditionnelles de tri cellulaire comprennent : 1) la prévention des artefacts d’activation ex vivo 8, 2) le besoin réduit d’équipement spécialisé (c.-à-d. trieurs de cellules) et 3) l’augmentation du débit et la diminution du coût des analyses spécifiques au type de cellule. En outre, la capacité d’isoler l’ADN et l’ARN spécifiques au type cellulaire d’une seule souris permet des analyses appariées qui augmentent la puissance statistique. Étant donné que des études récentes ont impliqué les cellules stromales ovariennes dans la conduite prématurée des phénotypes de vieillissement 11,12,13, nous avons ciblé le système d’expression NuTRAP sur les cellules stromales et thèques à l’aide d’un pilote Cyp17a1-Cre. Ici, nous démontrons que l’induction de la construction NuTRAP est spécifique aux cellules stromales ovariennes et thèques, et que suffisamment d’ADN et d’ARN pour les études de séquençage sont obtenus à partir d’un seul ovaire. Le modèle NuTRAP et les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour étudier n’importe quel type de cellule ovarienne avec n’importe quelle lignée Cre disponible.
Pour la génération d’une lignée de souris NuTRAP ovarienne spécifique au type cellulaire, l’allèle NuTRAP (Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purity) a un codon STOP floxed qui contrôle l’expression de BirA, du peptide de reconnaissance de la biotine ligase (BLRP) marqué mCherry/mRANGAP1 et eGFP/L10a. Lorsqu’elle est croisée avec une lignée Cre spécifique au type cellulaire, l’expression de la cassette NuTRAP marque la protéine nucléaire mRANGAP1 avec de la biotine/mCherry et la protéine ribosomique L10a avec eGFP d’une manière Cre-dépendante. Cela permet d’isoler les noyaux et les ARNm de types cellulaires spécifiques sans avoir besoin de tri cellulaire. Le flox/flox NuTRAP peut être jumelé à un Cre spécifique au type cellulaire pertinent pour les types de cellules ovariennes pour évaluer cela.
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Protocol
Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Les souris mères ont été achetées au Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et élevées et logées dans des conditions SPF dans un environnement de barrière HEPA sur un cycle lumière/obscurité de 14 h / 10 h (lumières allumées à 6h00) à l’OMRF.
NOTE: Dans cette démonstration, nous utilisons un Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) mâle jumelé à une femelle NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). La descendance Cyp17-NuTRAP souhaitée (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) exprimera l’allèle NuTRAP sous le contrôle du promoteur Cyp17a1 dans les cellules stromales ovariennes. Pour cette préparation manuscrite, nous avons utilisé des souris Cyp17-NuTRAP femelles âgées de 4 mois (n = 4). L’ADN a été extrait d’échantillons de poinçons d’oreille de souris pour le génotypage afin de confirmer l’hérédité des transgènes Cyp17iCre et NuTRAP et pour la détection par PCR de 1) Cre générique, 2) Cyp17iCre et 3) NuTRAP floxed en utilisant les amorces énumérées dans le tableau des matériaux, comme décrit précédemment 7,8.
1. Dissection ovarienne de souris
- Effectuer l’euthanasie des souris conformément aux directives de soins aux animaux et à l’approbation de l’établissement, suivie d’un prélèvement ovarien.
- Disséquer les ovaires pour enlever tout tissu adipeux ou partie des oviductes qui pourraient être attachés au tissu ovarien avant de placer les ovaires dans des tubes avec tampon. Passez immédiatement aux techniques TRAP ou INTACT.
REMARQUE : Ce protocole n’a pas été optimisé pour une utilisation avec des tissus congelés. L’utilisation d’un ovaire de la même souris pour chaque technique est recommandée pour les analyses statistiques futures.
2. Isolement des noyaux de types spécifiques de cellules ovariennes
- Préparation du tampon
- Tampon d’épuration nucléaire (NPB) : Pour préparer 100 mL de NPB, combiner 2 mL de 1 M HEPES (concentration finale : 20 mM HEPES), 0,8 mL de 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL de 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL de 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL de 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), et 92,2 mL d’eau exempte de nucléases. Complétez avec 1x inhibiteur de protéase le jour de l’isolement des noyaux.
REMARQUE: NPB peut être préparé sans l’inhibiteur de la protéase à l’avance et dure jusqu’à 3 semaines à 4 ° C. - Tampon de lyse des noyaux (complet): Compléter le tampon de lyse des noyaux avec 1x inhibiteur de protéase le jour de l’isolement des noyaux.
- Tampon d’épuration nucléaire (NPB) : Pour préparer 100 mL de NPB, combiner 2 mL de 1 M HEPES (concentration finale : 20 mM HEPES), 0,8 mL de 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL de 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL de 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL de 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), et 92,2 mL d’eau exempte de nucléases. Complétez avec 1x inhibiteur de protéase le jour de l’isolement des noyaux.
- Création de la suspension de noyaux
REMARQUE : Les échantillons doivent être conservés sur la glace en tout temps, sauf indication contraire.- Prélever un ovaire d’une souris Cyp17-NuTRAP (ou d’un autre Cre-NuTRAP pertinent) dans 500 μL de tampon de lyse des noyaux (complet). Hachez l’ovaire en huit parties dans le tampon à l’aide de micro-ciseaux à ouverture automatique.
- Utilisez des embouts de pipette de grand calibre pour transférer l’ovaire émincé et 500 μL de tampon de lyse dans un homogénéisateur Dounce en verre sur glace. Homogénéiser l’ovaire 10x-20x avec le pilon lâche A. Ajouter 400 μL de tampon de lyse à l’homogénéisateur Dounce, en lavant le pilon A.
- Homogénéiser l’ovaire avec le pilon serré B 10x-20x. Ajouter 1 000 μL de tampon de lyse en lavant le pilon B. Transférer l’homogénat (1,9 mL) dans un tube à fond rond de 2 mL.
- Centrifuger à 200 x g pendant 1,5 min à 4 °C pour éliminer les tissus et les vaisseaux sanguins non dissociés14. Le surnageant contient les noyaux; jeter la pastille de tissu non dissocié.
- Après pré-mouillage d’une crépine cellulaire de 30 μm avec 100 μL de tampon de lyse, filtrer le surnageant à travers la crépine cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Ensuite, transférer le mélange contenant des noyaux dans un tube à fond rond de 2 mL.
- Centrifuger l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. La pastille contient des noyaux.
- Resuspendre la pastille nucléaire dans 250 μL de tampon de lyse glacée en tourbillonnant brièvement à vitesse modérée à élevée. Porter le volume à 1,75 mL en ajoutant 1,5 mL de tampon de lyse. Mélanger délicatement et reposer la suspension nucléaire sur la glace pendant 5 min.
- Enduire les noyaux par centrifugation à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille nucléaire. Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de tampon de stockage glacé et vortex brièvement pour remettre complètement en suspension la pastille nucléaire.
- Réserver 10 % de la pastille remise en suspension (20 μL) comme échantillon de noyaux d’entrée pour les analyses en aval.
- Prenez la pastille de noyaux en suspension et portez le volume à 2,0 mL avec de la NPB glacée. Procéder à l’isolement des noyaux marqués à l’aide de la méthode de purification basée sur l’affinité INTACT.
- Isolement de noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT)
- Vortex les billes de streptavidine dans le flacon pendant 30 s à vitesse moyenne pour s’assurer qu’elles sont complètement remises en suspension. Ajouter 30 μL de billes en suspension pour chaque échantillon dans un tube à fond rond de 2 mL (les billes pour un maximum de 10 échantillons peuvent être lavées dans un seul tube), ajouter 1 mL de NPB et bien remettre en suspension par pipetage.
- Placez le tube sur le support magnétique pendant 1 min pour séparer les perles. Jetez le surnageant et retirez le tube de l’aimant. Remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans 1 mL de NPB.
- Répétez l’étape de lavage pour un total de trois lavages. Après le lavage final, remettre les billes en suspension dans le volume initial de NPB (30 μL par échantillon).
- Ajouter 30 μL des billes lavées à la suspension nucléaire de 2 mL à l’étape 2.2.10. Bien remettre en suspension le mélange bille-noyaux en pipetant et en retournant doucement le tube.
- Placez les tubes sur un mélangeur rotatif dans une chambre froide ou un réfrigérateur pendant 30 min à basse vitesse. Incuber les échantillons d’entrée sans billes dans les mêmes conditions.
- Placez les tubes avec la suspension nucléaire et les perles sur l’aimant et séparez les noyaux biotinylés liés aux billes de streptavidine (fraction positive) de la fraction négative des noyaux. Laissez les perles se séparer sur l’aimant pendant 3 min.
- Retirer le surnageant, passer la fraction négative dans un tube frais de 2,0 ml et réserver sur de la glace. Pour chaque tube à fraction positive, retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension le contenu dans 1 mL de NPB.
- Placez le tube sur l’aimant pendant 1 min et jetez le surnageant. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension le mélange bille et noyaux lavés dans 1 mL de NPB.
- Répétez l’étape 2.3.8 pour un total de trois lavages. Après trois lavages, remettre en suspension le mélange corde-noyaux de fraction positive dans 30 μL de NPB.
- Pour chaque tube à fraction négative, centrifuger la suspension nucléaire de l’étape 2.3.7 à 500 x g pendant 7 min à 4 °C. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Resuspendre la pastille de noyaux de fraction négative dans 30 μL de NPB.
- Conservez les noyaux de l’entrée (étape 2.2.9), de la fraction négative (étape 2.3.10) et de la fraction positive (étape 2.3.9) dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’isolement de l’ADN nucléaire ou de l’ARN.
REMARQUE : Les noyaux ne doivent pas être congelés pour les protocoles exigeant des noyaux intacts en entrée (c.-à-d. dosage de la chromatine accessible à la transposase, immunoprécipitation de la chromatine).
3. Isolement de l’ARNm à partir de types spécifiques de cellules ovariennes
- Préparation des tampons
- Base tampon TRAP : Préparer 100 mL de base tampon TRAP en combinant 78,8 mL d’eau exempte de RNase, 5 mL de 1 M de Tris-HCl (concentration finale : 50 mM de Tris [pH 7,5]), 5 mL de 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 mL de 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) et 10 mL de NP-40 à 10 % (1 % NP-40). Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
- Base tampon à haute teneur en sel : Préparer 100 mL de base tampon à haute teneur en sel en combinant 68,8 mL d’eau exempte de RNase, 5 mL de 1 M de Tris-HCl (concentration finale : 50 mM de Tris [pH 7,5]), 15 mL de 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 mL de 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) et 10 mL de NP-40 à 10 % (1 % NP-40). Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
- Tampon d’homogénéisation TRAP (complet) : Préparer 1,5 mL par échantillon le jour du prélèvement de tissu. Préparer 10 mL de tampon d’homogénéisation TRAP en combinant 10 mL de base tampon TRAP (à partir de l’étape 3.1.1) avec 10 μL de cycloheximide à 100 mg/mL (concentration finale : 100 μg/mL de cycloheximide), 10 mg d’héparine de sodium (1 mg/mL d’héparine sodique), 20 μL de DTT 0,5 M (1 mM de DTT), 50 μL d’inhibiteur de la RNase 40 U/μL (inhibiteur de la RNase 200 U/mL), 200 μL de spermidine 0,1 M (2 mM de spermidine) et un comprimé d’inhibiteur de protéase sans EDTA (1x).
- Tampon de lavage à faible teneur en sel (complet) : Faire 1,5 mL par échantillon le jour du prélèvement de tissu. Pour obtenir 10 mL de tampon de lavage à faible teneur en sel, combiner 10 mL de base tampon TRAP (à partir de l’étape 3.1.1) avec 10 μL de cycloheximide à 100 mg/mL (100 μg/mL de cycloheximide) et 20 μL de DTT 0,5 M (1 mM de DTT).
- Tampon de lavage au sel élevé (complet) : Faire 1,5 mL par échantillon le deuxième jour d’isolement TRAP. Pour obtenir 10 mL de tampon de lavage à haute teneur en sel, combiner 10 mL de base tampon à haute teneur en sel (à partir de l’étape 3.1.2) avec 10 μL de cycloheximide à 100 mg/mL et 20 μL de DTT 0,5 M.
- Réalisation de la purification de l’affinité des ribosomes de traduction (TRAP)
- Prélever l’autre ovaire d’une souris Cyp17-NuTRAP (ou d’un autre Cre-NuTRAP pertinent) et le placer dans un tube sans RNase de 1,5 mL contenant 100 μL de tampon d’homogénéisation TRAP glacé (à partir de l’étape 3.1.3). Hachez l’ovaire en huit parties dans le tampon à l’aide de micro-ciseaux à ouverture automatique.
- Utilisez des embouts de grand calibre pour transférer l’ovaire et 100 μL de tampon d’homogénéisation dans un homogénéisateur Dounce en verre. Homogénéiser 10x-20x avec le pilon lâche A. Ajouter 400 μL de tampon d’homogénéisation TRAP, en lavant le pilon A.
- Transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de 2 mL. Lavez l’homogénéisateur Dounce avec un tampon d’homogénéisation TRAP supplémentaire de 1 mL et transférez le volume lavé dans le tube à fond rond de 2 mL.
- Centrifuger l’homogénat à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant autorisé dans un nouveau tube à fond rond de 2 mL. Jetez la pastille.
- Transférer 100 μL de l’homogénat dégagé dans un nouveau tube à fond rond de 2 mL et réserver comme entrée sur de la glace.
- Incuber le reste de l’homogénat éliminé (à partir de l’étape 3.2.4) avec un anticorps anti-GFP (5 μg/mL) pendant 1 h à 4 °C en tournant bout à bout. Incuber l’échantillon d’entrée dans les mêmes conditions.
- Au cours des 15 dernières minutes de l’incubation, laver les billes magnétiques de protéine G dans le tampon de lavage à faible teneur en sel en suivant les étapes suivantes (3.2.8-3.2.11).
- Vortex le flacon de billes magnétiques de protéine G pendant 30 s pour le remettre complètement en suspension. Transférer 50 μL de billes magnétiques de protéine G pour chaque échantillon (jusqu’à 10 échantillons peuvent être lavés dans un tube) dans un tube à fond rond de 2 mL.
- Ajouter 500 μL de tampon de lavage à faible teneur en sel aux billes et pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube dans un support magnétique pendant 1 min pour recueillir les perles contre le côté du tube. Retirez et jetez le surnageant.
- Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 1 ml de tampon de lavage à faible teneur en sel dans le tube. Pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube dans un support magnétique pendant 1 min pour recueillir les perles contre le côté du tube. Retirez et jetez le surnageant.
- Répétez l’étape 3.2.10 pour un total de trois lavages. Après le lavage final, retirez le tube de la grille magnétique et remettez les billes en suspension dans le volume initial du tampon de lavage à faible teneur en sel (50 μL par échantillon).
- Transférer les billes lavées en suspension (50 μL) dans l’échantillon d’antigène/mélange d’anticorps et incuber à 4 °C pendant une nuit tout en tournant dans un mélangeur bout à bout. Incuber les échantillons d’entrée en tournant bout à bout à 4 °C pendant la nuit pour maintenir des conditions équivalentes.
- Après l’incubation de nuit, retirez les tubes du rotateur et séparez les billes magnétiques avec les ribosomes / ARN cibles (fraction positive) du surnageant (fraction négative) à l’aide du support magnétique pendant 2,5-3 minutes. Aspirer la fraction négative, la placer dans un nouveau tube à fond rond de 2 ml et la mettre de côté sur de la glace pendant le traitement de la fraction positive.
- Ajouter 500 μL de tampon de lavage à haute teneur en sel (à partir de l’étape 3.1.5) dans le tube avec la fraction positive et pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube sur un support magnétique maintenu sur de la glace pendant 1 min pour séparer les perles. Jetez le surnageant et retirez le tube de l’aimant.
- Répétez l’étape 3.2.14 pour un total de trois lavages. Après le lavage final, remettre les billes en suspension dans 350 μL de tampon de lyse de l’ARN complété par 3,5 μL de 2-mercaptoéthanol (BME). Incuber les tubes à température ambiante tout en mélangeant pendant 10 min à 900 tr/min dans un agitateur numérique.
- Séparer les billes de la solution qui contient maintenant les ribosomes/ARN cibles avec un support magnétique pendant 1 min à température ambiante. Recueillir la fraction positive éluée (surnageant) dans un tube frais de 1,5 mL et ajouter 350 μL d’éthanol à 100 %. Inversez pour mélanger. Procéder à l’isolement de l’ARN.
- Facultatif : Pour isoler l’ARN de l’échantillon d’entrée (étape 3.2.5) et de la fraction négative (étape 3.2.13), transférer 100 μL de l’échantillon d’entrée et des fractions négatives dans des tubes frais de 1,5 mL. Ajouter 350 μL de tampon de lyse de l’ARN complété par 3,5 μL de BME à chaque échantillon. Inversez pour mélanger. Ajouter 250 μL d’éthanol à 100 % dans chaque tube et retourner pour mélanger. Procéder à l’isolement de l’ARN.
- Isolement de l’ARN
- Transférer 700 μL de la fraction positive et, éventuellement, de la fraction d’entrée et/ou négative à une colonne de spin d’ARN. Suivez les instructions du fabricant pour isoler l’ARN de la colonne de spin.
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Representative Results
Un schéma des protocoles TRAP et INTACT est illustré à la figure 1. Ici, la spécificité du modèle murin Cyp17-NuTRAP aux cellules stromales ovariennes / thèques est démontrée par imagerie immunofluorescente et RNA-Seq à partir d’ARN isolé par TRAP. Tout d’abord, l’imagerie par immunofluorescence du signal eGFP dans l’ovaire et la localisation du signal eGFP vers les cellules thèques et stromales ont été réalisées. Brièvement, des sections de 5 μm ont été déparaffinisées avec un gradient de xylène et d’éthanol. Pour une meilleure signalisation eGFP, la protéine eGFP a été colorée à l’aide d’anticorps primaire anti-GFP de chèvre et d’anticorps secondaire anti-chèvre Alexa 488 âne, et les noyaux ont été colorés avec DAPI15. Les images ont été prises au microscope à fluorescence à un grossissement de 20x (figure 2A). Ensuite, TRAP a été réalisé sur les ovaires de souris Cyp17-NuTRAP âgées de 4 mois pour isoler spécifiquement l’ARN lié aux ribosomes des cellules thèques / stromales. L’ARN isolé par TRAP (fraction positive) et l’ARN des tissus entiers (entrée) ont été utilisés pour construire des bibliothèques de séquençage d’ARN brin à séquencer sur un séquenceur de nouvelle génération. Le rognage, l’alignement et la normalisation de l’ARN-Seq (DESeq2) ont été effectués, comme décrit précédemment 7,8. L’analyse en composantes principales (ACP) a montré une forte séparation de l’entrée et de la fraction positive dans la première composante, suggérant des profils transcriptomiques distincts (Figure 2B). Il y avait 2 009 gènes exprimés différentiellement entre les fractions d’entrée et positives, comme on le voit dans le diagramme du volcan (test t apparié, correction des tests multiples de Benjamini-Hochberg FDR < 0,05, changement de pli >2; Figure 2C). Parmi les gènes exprimés différentiellement, on a pu observer l’enrichissement des marqueurs des cellules stromales et thèques (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) et la déplétion des ovocytes (Gdf9, Oosp1, Ooep), de la granulosa (Amhr2, Serpine2, Eml5), des cellules immunitaires (C1qa, C1qb, Fcerg1) et des cellules musculaires lisses (Mfap5)16 (Figure 2D).
Figure 1 : Isolement de noyaux et d’ARNm spécifiques au type cellulaire à partir du modèle Cyp17-NuTRAP à l’aide des méthodes INTACT et TRAP. (A) La génération de la lignée Cyp17-NuTRAP est obtenue en croisant unefemelle flox/flox NuTRAP avec un mâle Cyp17iCre+/+. (B) Schéma des méthodologies TRAP et INTACT pour isoler les noyaux et les polysomes des cellules stromales/thèques de la souris Cyp17-NuTRAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Validation du modèle murin Cyp17-NuTRAP. (A) L’immunofluorescence a été réalisée sur les ovaires paraffinisés de souris flox/WT Cyp17-Cre+/−NuTRAPet flox/WT Cyp17-Cre−/−NuTRAP. La protéine eGFP a été colorée à l’aide d’anticorps primaire anti-GFP de chèvre et d’anticorps secondaire anti-chèvre Alexa 488 âne, et les noyaux ont été colorés avec du DAPI. Les images ont été prises sur un microscope à fluorescence avec un grossissement de 20x. (B-D) L’ARN d’entrée et de fraction positive TRAP a été isolé à partir d’ovaires de souris flox/WT duflox/WT Cyp17-Cre+/−NuTRAP (n = 4), utilisés pour préparer des bibliothèques ARN-Seq brins, comme précédemmentfait 7, et séquencés de manière appariée. Le rognage, l’alignement et la normalisation de l’ARN-Seq (DESeq2) ont été effectués, comme précédemmentfait 7,8. (B) L’analyse en composantes principales (ACP) de tous les gènes exprimés a montré une séparation de l’entrée TRAP et des fractions positives dans la première composante (51,4% de variance expliquée). (C) Diagramme volcanique des gènes exprimés différentiellement entre les fractions d’entrée et positives (test t apparié, correction des tests multiples de Benjamini-Hochberg FDR < 0,05, changement de pli >2). (D) La comparaison de la fraction positive TRAP à l’entrée (log2[changement de pli ([fraction ositive/Input)]) a montré un enrichissement global des gènes marqueurs stromal/thèques et l’épuisement des gènes marqueurs ovocytaires, granulosa, immunitaires et des cellules musculaires lisses (SMC) dans la fraction positive TRAP (test t apparié à rapport, correction des tests multiples de Benjamini-Hochberg FDR < 0,10, n = 4). Les barres représentent la moyenne log2[changement de pli (fraction positive/entrée)] ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le modèle murin NuTRAP6 est une puissante approche de marquage transgénique pour l’interrogation par appariement du transcriptome et de l’épigénome à partir de types cellulaires spécifiques qui peuvent être adaptés à n’importe quel type de cellule avec un pilote Cre disponible. Ici, nous démontrons la spécificité du modèle murin Cyp17-NuTRAP dans le ciblage des cellules ovariennes thèques et stromales. Le modèle Cyp17-NuTRAP peut être utilisé pour élucider davantage les mécanismes épigénétiques spécifiques aux cellules thèques et stromales impliqués dans le vieillissement ovarien, le cancer et la maladie.
Lors de la sélection d’un pilote Cre, il est recommandé de valider la spécificité cellulaire de l’expression NuTRAP médiée par Cre en utilisant plusieurs approches orthogonales. Le Cyp17a1-Cre est exprimé de manière constitutive. Le modèle NuTRAP peut également être croisé avec des lignées Cre inductibles pour éviter l’expression transitoire de gènes dans les cellules non cibles au cours du développement. Étant donné que la plupart des cellules ovariennes sont très sensibles aux fluctuations hormonales, la stadification du cycle œstral devrait également être envisagée17.
L’approche NuTRAP présente de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles de tri cellulaire. Premièrement, les techniques de tri cellulaire reposent sur la création de suspensions unicellulaires, ce qui peut provoquer l’induction d’artefacts d’activation ex vivo 8. De plus, le tri cellulaire repose sur des marqueurs de surface cellulaire, qui peuvent changer avec l’âge ou l’état pathologique, ce qui remet en question l’équivalence réelle des populations de cellules comparées entre deux groupes expérimentaux. Le marquage des marqueurs de surface cellulaire repose également sur l’identification d’anticorps fiables pour l’immunomarquage18.
Au cours de la dernière décennie, il y a eu une expansion des techniques transcriptomiquesunicellulaires / noyaux 19,20,21,22,23 et épigénomiques24,25,26 pour explorer l’hétérogénéité des populations cellulaires. Bien que ces approches aient conduit à une meilleure appréciation de l’hétérogénéité cellulaire, elles souffrent souvent d’un manque de sensibilité et de couverture génomique, ce qui peut limiter la profondeur des analyses. Par exemple, les techniques de transcriptomique unicellulaire (scRNA) ne détectent que ~1 000-5 000 gènes par cellule27, alors que la technique NuTRAP utilisée dans cette étude a détecté 14 980 gènes. De plus, plusieurs techniques d’ARNc reposent sur le marquage 3' ou 5' 20,21,22,28,29,30, ce qui ne permet pas l’analyse d’isoformes d’ARN spécifiques disponibles à l’aide de la méthodologie TRAP-seq.
Alors que la transcriptomique unicellulaire est devenue monnaie courante en biologie moléculaire (revue dans Aldridge et Teichmann31), le domaine épigénétique a pris du retard. La plupart des techniques épigénomiques unicellulaires reposent sur le dépôt de cellules FACS ou sur des techniques microfluidiques suivies d’une préparation de bibliothèque à partir de cellules individuelles. En tant que tel, le débit des techniques épigénomiques unicellulaires est généralement inférieur à celui des méthodes d’encapsulation de gouttelettes couramment utilisées pour le RNA-Seq32 unicellulaire. L’ajout récent d’un test monocellulaire (sc) ou mononucléi (sn) pour la chromatine transposable-accessible (ATAC-Seq) à la famille génomique 10x de solutions unicellulaires représente la première méthode à base de gouttelettes permettant l’interrogation d’un paramètre épigénomique (accessibilité de la chromatine) à une résolution unicellulaire. Les techniques de multiplexage, telles que CoBATCH-Seq24 pour les modifications d’histones, ont considérablement augmenté le débit, mais pas au niveau des approches basées sur les gouttelettes. Le séquençage méthylique des noyaux simples (snmC-Seq) a été réalisé en utilisant le tri des noyaux activés par fluorescence dans des puits individuels et la préparation de la bibliothèque BS-Seq25,26. Cependant, la conversion sévère du bisulfate conduit à une couverture éparse à l’échelle du génome, ce qui nécessite un regroupement génomique important lors de l’analyse des données (~ 100 kb) et entraîne la perte du contexte génomique nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques solides. Le modèle murin NuTRAP permet l’analyse sensible de l’épigénome et du transcriptome de types cellulaires spécifiques.
En ce qui concerne la procédure TRAP, il y a quelques considérations pour assurer un isolement réussi. Tout d’abord, l’ovaire doit être coupé avant l’homogénéisation afin de rompre la membrane externe et de permettre une dissociation complète. L’ovaire est un tissu fibreux, en particulier chez les souris âgées, ce qui rend difficile l’homogénéisation complète. Cependant, lors de l’optimisation de ce protocole, une homogénéisation agressive au cours du protocole TRAP a entraîné une contamination des isolats d’ARN, avec des bandes d’ADN visibles présentées par électrophorèse capillaire. Pour résoudre ce problème, 2 mM de spermidine ont été inclus dans le tampon d’homogénéisation TRAP afin de stabiliser la membrane nucléaire33. De plus, nous n’avons homogénéisé les échantillons TRAP qu’avec le pilon A lâche pour éviter la perturbation de la membrane nucléaire. Il est important de vérifier les échantillons d’ARN sur un bioanalyseur ou une TapeStation après l’isolement pour s’assurer d’un numéro d’intégrité de l’ARN >7 avant de procéder aux applications de séquençage.
Pour la procédure INTACT, l’ovaire doit également être coupé avant l’homogénéisation. De plus, nous avons constaté qu’une rotation courte et à basse vitesse (200 x g pendant 1,5 min) après homogénéisation est efficace pour éliminer les tissus et les vaisseaux sanguins non dissociés, comme cela a été fait précédemment 7,14. Si l’ARN nucléaire est un paramètre souhaité, un inhibiteur de la RNase doit être inclus dans les tampons INTACT. Le RNA-Seq nucléaire ou RT-qPCR peut être utilisé pour tester la spécificité cellulaire des isolements INTACT. Les billes de streptavidine ont une affinité incroyablement élevée pour la biotine, ce qui rend difficile la séparation des billes des noyaux de biotine+ suivant le protocole INTACT, et cela devrait être pris en compte lors de la planification des applications en aval. En plus d’isoler les noyaux spécifiques au type cellulaire des modèles NuTRAP à l’aide d’INTACT, les noyaux peuvent également être triés en fonction de l’expression eGFP pour les applications en aval. La procédure INTACT pour isoler les noyaux peut être utilisée pour évaluer plusieurs paramètres, y compris la transcriptomique nucléaire, l’épigénomique et la protéomique.
Les techniques susmentionnées sont d’excellents outils pour les évaluations du vieillissement ovarien. Le vieillissement ovarien est une préoccupation non seulement du point de vue de la reproduction, mais aussi du point de vue de la durée de la santé. La ménopause, qui est l’arrêt de la fonction ovarienne, est associée à l’accélération des horloges biologiques34, et la ménopause précoce est associée à une durée de vie plus courte et à un risque accru de maladies chez les femmes35,36. On sait que le vieillissement des ovocytes est directement lié à un déclin de la condition physique ovarienne. Cependant, d’autres types de cellules joueraient également un rôle dans le déclin de la durée de vie ovarienne et une augmentation de la sénescence ovarienne et de l’inflammation37. Il est essentiel de mieux comprendre quelles cellules sont impliquées dans ce processus et comment le ralentir. Même s’il existe des différences indéniables entre la dynamique ovarienne humaine et la dynamique ovarienne murine, les modèles murins restent des outils importants pour étudier la biologie ovarienne. Dans ce contexte, les modèles Cre-NuTRAP peuvent être des outils utiles pour identifier les cibles de type cellulaire les plus efficaces pour tenter de ralentir le vieillissement ovarien et la ménopause.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), de la Fondation BrightFocus (M2020207) et de la Presbyterian Health Foundation. Ce travail a également été soutenu en partie par le prix MERIT I01BX003906 et un prix du Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 des États-Unis (É.-U.) Ministère des Anciens Combattants, Service de recherche et de développement en laboratoire biomédical. Les auteurs aimeraient également remercier le Clinical Genomics Center (OMRF) et l’Imaging Core Facility (OMRF) pour leur aide et leur utilisation des instruments.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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