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Biology

ऑटोफैगी से संबंधित 4 बी सिस्टीन पेप्टिडेस के अवरोधकों के लिए सेल-आधारित दवा स्क्रीनिंग

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65464
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2Department of Human Medicine, Medical School Berlin

Summary

यहां, हम अर्ध-स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रारूप में ल्यूसिफेरस-आधारित रिपोर्टर परख के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

बढ़ते सबूतों से पता चला है कि उच्च ऑटोफैजिक फ्लक्स ट्यूमर की प्रगति और कैंसर चिकित्सा प्रतिरोध से संबंधित है। व्यक्तिगत ऑटोफैगी प्रोटीन का परीक्षण करना इस मार्ग को लक्षित करने वाली चिकित्सीय रणनीतियों के लिए एक शर्त है। ऑटोफैगी प्रोटीज एटीजी 4 बी का निषेध समग्र अस्तित्व को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, यह सुझाव देते हुए कि एटीजी 4 बी कैंसर चिकित्सा के लिए एक संभावित दवा लक्ष्य हो सकता है। हमारी प्रयोगशाला ने कोशिकाओं में एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए एक चयनात्मक ल्यूसिफेरस-आधारित परख विकसित की है। इस परख के लिए, एटीजी 4 बी, एलसी 3 बी के सब्सट्रेट को सी-टर्मिनस पर समुद्री कोपपॉड गॉसिया प्रिंसेस (ग्लूक) से एक स्रावित ल्यूसिफेरस के साथ टैग किया गया है। यह रिपोर्टर एक्टिन साइटोस्केलेटन से जुड़ा हुआ है, इस प्रकार इसे अशुद्ध होने पर कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में रखता है। एटीजी 4 बी-मध्यस्थता दरार के परिणामस्वरूप गैर-पारंपरिक स्राव द्वारा ग्लूक की रिहाई होती है, जिसे तब सेलुलर एटीजी 4 बी गतिविधि के सहसंबंध के रूप में सेल कल्चर से सुपरनैटेंट की कटाई करके निगरानी की जा सकती है। यह पेपर स्वचालित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए इस ल्यूसिफेरस-आधारित परख के अनुकूलन को प्रस्तुत करता है। हम सेलुलर एटीजी 4 बी गतिविधि के अनुकरणीय उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो और अनुकूलन का वर्णन करते हैं।

Introduction

ऑटोफैगी एक संरक्षित चयापचय प्रक्रिया है जो कोशिकाओं को इंट्रासेल्युलर होमियोस्टैसिस रखने और लाइसोसोम 1,2,3 के माध्यम से वृद्ध, दोषपूर्ण या अनावश्यक सेलुलर सामग्री को कम करके तनाव का जवाब देने की अनुमति देती है। कुछ पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के तहत, यह प्रक्रिया पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की कमी के लिए एक महत्वपूर्ण सेलुलर प्रतिक्रिया के रूप में कार्य करती है, जिसके परिणामस्वरूप पुनर्नवीनीकरण पोषक तत्व और लिपिड होते हैं, जिससे कोशिकाओं को उनकी चयापचय आवश्यकताओं 2,3,4 के अनुकूल होने की अनुमति मिलती है। ऑटोफैगी को कई बीमारियों से संबंधित सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया के रूप में भी पहचाना गया है, जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार, रोगज़नक़ संक्रमण और विभिन्न प्रकार के कैंसर। कैंसर में ऑटोफैगी का कार्य जटिल है और ट्यूमर के प्रकार, चरण और स्थिति पर निर्भर है। यह क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के ऑटोफैजिक क्षरण के माध्यम से ट्यूमरजेनिसिस को दबा सकता है, लेकिन तनावपूर्ण स्थितियों, जैसे हाइपोक्सिया, पोषक तत्वों की कमी और साइटोटोक्सिक क्षति 2,4,5,6 के दौरान सेल अस्तित्व में सुधार करके उन्नत ट्यूमर के अस्तित्व को भी बढ़ावा दे सकता है।

कई अध्ययनों से पता चला है कि ऑटोफैगी निषेध एक एंटीकैंसर रणनीति के रूप में लाभ प्रदान करता है। इस प्रकार, महत्वपूर्ण चरणों का निषेध, जैसे कि ऑटोफैगोसोम गठन या लाइसोसोम के साथ इसका संलयन, कैंसर नियंत्रण 2,4,5,6 के लिए एक प्रभावी तरीका हो सकता है। बढ़ते सबूतों से पता चला है कि एटीजी 4 बी कुछ रोग स्थितियों में शामिल है, और इसने संभावित एंटीकैंसर लक्ष्य 2,3,4 के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। उदाहरण के लिए, यह देखा गया कि कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं और मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (एचईआर 2) -पॉजिटिव स्तन कैंसर कोशिकाओं में आसन्न सामान्य कोशिकाओं 2,4 की तुलना में काफी अधिक एटीजी 4 बी अभिव्यक्ति स्तर थे। प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं में, एटीजी 4 बी के निषेध के परिणामस्वरूप कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी7 के लिए एक सेल लाइन-विशिष्ट संवेदनशीलता हुई। हाल ही में, मजबूत सबूत सामने आए हैं कि अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) विशेष रूप से एटीजी 4 बी निषेध के लिए कमजोर है। उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में, यह दिखाया गया था कि एटीजी 4 बी फ़ंक्शन का आंतरायिक नुकसान पीडीएसी ट्यूमर के विकास को कम करता है और अस्तित्व को बढ़ाता है 3,4। कुल मिलाकर, एटीजी 4 बी कुछ कैंसर प्रकारों में अत्यधिक अतिरंजित है, ट्यूमर की प्रगति से संबंधित है, और कैंसर चिकित्सा प्रतिरोध 2,4,8 से जुड़ा हुआ है।

स्तनधारियों में एटीजी 4 सिस्टीन प्रोटीज में चार परिवार के सदस्य होते हैं, एटीजी 4 ए-एटीजी 4 डी। ये प्रोटीन 9,10,11 प्रोटीन के एलसी 3 / जीएबीएआरएपी (एटीजी 8) परिवार की ओर कुछ लक्ष्य चयनात्मकता प्रदर्शित करते हैं और उनके अतिरिक्त कार्य हो सकते हैं जो उनकी प्रोटीज गतिविधि12,13 से जुड़े नहीं हैं। इसके अलावा, एटीजी 4 एक नए प्रकार के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन को विनियमित करने में कार्य करता है, प्रोटीन11,12 का एटीजी 8-नाइलेशन। जबकि एटीजी 4 बी और इसके मुख्य सब्सट्रेट एलसी 3 बी का सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है, एक तस्वीर उभर रही है जो ऑटोफैजिक और गैर-ऑटोफैजिक प्रक्रियाओं के विनियमन में प्रत्येक उप-परिवार के सदस्य के लिए एक जटिल भूमिका का सुझाव देती है। यह पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के एक जटिल नेटवर्क द्वारा पुष्टि की जाती है जो फॉस्फोराइलेशन, एसिटिलीकरण, ग्लाइकोसिलेशन और नाइट्रोसिलेशन9,10,11,12,13 के माध्यम से एटीजी 4 बी गतिविधि को नियंत्रित करते हैं।

कई ज्ञात एटीजी 4 बी अवरोधक 2,4,14,15 प्रकाशित किए गए हैं। हालांकि ये अनुसंधान उपकरण के रूप में उपयुक्त हैं, उनकी फार्माकोडायनामिक प्रोफाइल, चयनात्मकता, या शक्ति ने अभी तक उन्हें प्रीक्लिनिकल उम्मीदवारों 4,16 के रूप में विकास से रोक दिया है। कुल मिलाकर, अधिक शक्तिशाली और चयनात्मक यौगिकों की पहचान करने की तत्काल आवश्यकता है। अक्सर, यौगिक प्रोटीन फ़ंक्शन के अच्छे जैव रासायनिक अवरोधक होते हैं, फिर भी सेल-आधारित परख में उनकी प्रभावकारिता खराब होती है। एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए कई परख हैं, जिनमें जैव रासायनिक तरीके और सेल-आधारित परख4 शामिल हैं। हमने पहले कोशिकाओं 8,17 में एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए एक सरल, ल्यूमिनेसेंस-आधारित, उच्च-थ्रूपुट परख विकसित की है। यह परख गॉसिया प्रिंसेस (ग्लूक) से एक ल्यूसिफेरस प्रोटीन का उपयोग करती है जो बाह्य वातावरण में स्थिर और सक्रिय है और एटीजी 4 बी प्रोटियोलिटिक गतिविधि18,19 के जवाब में कोशिकाओं से अपरिहार्य रूप से जारी किया जा सकता है।

इस रिपोर्टर निर्माण में, डीएनजीएलयूसी कोशिकाओं के एक्टिन साइटोस्केलेटन से जुड़ा हुआ है। β-एक्टिन एंकर और डीएनग्लूक के बीच एक प्रोटीज-विशिष्ट लिंकर पेश किया जा सकता है, जिससे स्राव लिंकर के दरार पर निर्भर हो जाता है। हमने एलसी 3 बी दरार17,18,19 की निगरानी करने में सक्षम होने के लिए β-एक्टिन और डीएनएलयूसी के बीच एलसी 3 बी के पूर्ण लंबाई वाले ओपन रीडिंग फ्रेम का उपयोग किया। यद्यपि डीएनजीएलयूसी के स्राव तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है, यह एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए विशिष्ट है, समग्र ऑटोफैगी पर निर्भर नहीं करता है क्योंकि यह एटीजी 5 नॉकआउट कोशिकाओं में होता है, और गैर-पारंपरिक तंत्र द्वारा मध्यस्थता की जाती है जिसे शास्त्रीय सिग्नल पेप्टाइड 4,18,19 की आवश्यकता नहीं होती है। हमने इस रिपोर्टर का उपयोग सफलतापूर्वक छोटे अणुओं और सीआरएनए पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए किया है, और एटीजी 4 बी गतिविधि के नए नियामकों की पहचान की है, जैसे कि एकेटी प्रोटीन किनेसेस8। यह पेपर अर्ध-स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रारूप में इस ल्यूसिफेरस रिपोर्टर के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

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Protocol

नोट: परख प्रक्रिया चित्रा 1 में उल्लिखित है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. रेट्रोवायरस उत्पादन

नोट: ActinLC3dNGLUC को एन्कोडिंग करने वाला प्लास्मिड pMOWS-ActinLC3dNGLUC20 है। उच्च-टिटर वायरस उत्पादन (आदर्श रूप से पी 20 से कम) के लिए कोशिकाओं की कम-मार्ग संख्या का उपयोग करें।

  1. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में कल्चर HEK293T कोशिकाओं को एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक किया जाता है, जिसमें 5% सीओ2 का वातावरण होता है जब तक कि वे अभिकर्मक के लिए बीज बोने से पहले 80% -90% कंफ्लुएंट न हों।
  2. अभिकर्मक से एक दिन पहले, कोशिकाओं को पूर्ण विकास माध्यम के 2 एमएल / कुएं में 1 × 10 6 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर6-वेल प्लेट में बीज दें। प्लेट को रात भर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के वातावरण के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: लिपोसोमल-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करते समय निर्माता के निर्देशों का पालन करें। यह प्रोटोकॉल एक गैर-लिपोसोमल-आधारित अभिकर्मक के उपयोग का वर्णन करता है। अभिकर्मक शुरू करने से पहले, डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक, डीएनए और मीडिया को कमरे के तापमान (~ 15 मिनट) के बराबर करने की अनुमति दें।
  3. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सीरम मुक्त माध्यम के 200 μL जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब में, प्लास्मिड की निम्नलिखित मात्रा जोड़ें: 1,000 एनजी पीएमओडब्ल्यूएस-एक्टिनएलसी 3 डीएनएलजीयूसी; गैगपोल के 900 एनजी; वीएसवी-जी के 100 एनजी।
    नोट: यहां सूचीबद्ध प्लास्मिड की मात्रा और मीडिया की मात्रा 12-वेल प्लेट के लिए है। यदि एक अलग प्लेट प्रकार का उपयोग कर रहे हैं, तो ट्रांसफर प्लास्मिड के 5 एनजी / μ L, पैकिंग प्लास्मिड के 4.5 ng / μL और लिफाफा प्लास्मिड के 0.5 ng / μL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए मीडिया वॉल्यूम और प्लास्मिड मात्रा को समायोजित करें। किसी भी पैकिंग प्लास्मिड का उपयोग करें जिसमें गैग- और पोल-व्यक्त जीन होते हैं, और कोई भी लिफाफा प्लास्मिड जिसमें वीएसवी-जी व्यक्त जीन होता है।
  4. भंवर 30 सेकंड के लिए डीएनए अभिकर्मक शीशी है। अभिकर्मक अभिकर्मक के पिपेट 4 μL सीधे पतला डीएनए युक्त माध्यम में। ट्यूब को धीरे से घुमाकर धीरे से मिलाएं।
    नोट: युक्तियों के साथ प्लास्टिक ट्यूबों की दीवारों को स्पर्श न करें। ऊपर और नीचे या भंवर में पाइप न करें।
  5. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
  6. प्रतिक्रिया को इंजेक्ट करते समय, 6-वेल प्लेट से पुराने माध्यम को हटा दें और इसे ताजा सीरम-मुक्त मीडिया के 2 एमएल / वेल के साथ बदल दें।
  7. प्रत्येक अभिकर्मक परिसर को ड्रॉपवाइज तरीके से प्रत्येक कुएं में जोड़ें।
  8. पूरे कुएं की सतह पर भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं या घुमाएं।
  9. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 5% सीओ2 के वातावरण के साथ एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  10. 24 घंटे के बाद, पुराने माध्यम को ताजा पूर्ण माध्यम (2 एमएल / वेल) से बदलें और कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए 5% सीओ2 के वातावरण के साथ ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में वापस लौटाएं।
  11. 72 घंटे के बाद, सतह पर तैरनेवाला को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में काट लें और मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए 4,000 × ग्राम पर 4,000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। आगे शुद्धिकरण के लिए, 0.20 μm फ़िल्टर के माध्यम से सुपरनैटेंट को पारित करने के लिए एक बड़ी 60 mL सिरिंज का उपयोग करें। तुरंत 300 μL के एकल-उपयोग एलिकोट तैयार करें और -80 °C पर स्टोर करें।
    नोट: अधिकतम उत्पाद गतिविधि बनाए रखने के लिए फ्रीज-पिघलना चक्र से बचें।

2. रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन

  1. कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने से एक दिन पहले, लक्ष्य कोशिकाओं को मध्यम घनत्व (PANC1 पर 1 × 105 कोशिकाओं / कुएं) पर 10% FBS और 1% P / S के साथ पूरक 12-वेल प्लेट में 10% FBS और 1% P / S के साथ पूरक करें।
    नोट: सबसे अच्छा सेल घनत्व पहले से स्थापित किया जाना चाहिए, क्योंकि विभिन्न सेल प्रकारों में अलग-अलग लगाव क्षमताएं होती हैं। आदर्श रूप से, 40% -50% कंफ्लुएंसी प्राप्त करने के लिए सेल घनत्व का उपयोग करें।
  2. जमे हुए रेट्रोवायरस एलिकोट को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दें और प्रत्येक उपयोग से पहले बर्फ पर पिघलें।
    नोट: अप्रयुक्त एलिकोट को फिर से फ्रीज न करें।
  3. एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 8 μg / mL की अंतिम एकाग्रता पर वायरल सुपरनैटेंट और पॉलीब्रेन का मिश्रण तैयार करें।
    नोट: बाद के वॉल्यूम 12-वेल प्लेट के पारगमन पर लागू होते हैं जिसमें 500 μL / अच्छी तरह से अंतिम मात्रा होती है। पॉलीब्रेन की उपस्थिति में वायरल कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का परीक्षण करके अंतिम वायरल सुपरनैटेंट वॉल्यूम का अनुमान लगाया जा सकता है। ट्रांसजीन के वांछित अभिव्यक्ति स्तर और उपयोग किए गए पोत के आकार के आधार पर उच्च या निम्न कमजोर पड़ने का उपयोग किया जा सकता है।
  4. 12-वेल प्लेट से पुराने माध्यम को निकालें और प्रत्येक कुएं में 500 μL मिश्रण जोड़ें। 5% सीओ2 के वातावरण के साथ एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर वायरल सुपरनैटेंट के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: चयन के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए पूर्ण माध्यम (कोई वायरल सुपरनैटेंट नहीं) के साथ दो कुएं रखें।
  5. वायरस युक्त माध्यम को ताजा पूर्ण विकास माध्यम (1 एमएल / वेल) के साथ बदलें। कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के वातावरण के साथ ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में वापस रखें।

3. पूल जनसंख्या चयन और रखरखाव

  1. विकास माध्यम को चयन माध्यम से बदलें (1 μg / mL puromycin की अंतिम एकाग्रता के साथ पूर्ण विकास माध्यम)। कोशिकाओं के विकास की निगरानी करें और हर 2-3 दिनों में चयन मीडिया बदलें। संगम पर, 6-वेल डिश में विस्तार करें, और फिर 10 सेमी व्यास ऊतक संस्कृति पकवान में।
  2. कोशिकाओं को चयन माध्यम में कम से कम तब तक रखें जब तक कि नियंत्रण (असंक्रमित) कोशिकाओं को पूरी तरह से मरने में समय लगता है।
    नोट: सफल परिणामों के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रयोगात्मक परियोजना शुरू करने से पहले प्यूरोमाइसिन की इष्टतम सांद्रता निर्धारित की जाए। इसके लिए, 3 से 10 दिनों के बीच अपरिवर्तित कोशिकाओं को मारने के लिए आवश्यक न्यूनतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक प्यूरोमाइसिन किल वक्र उत्पन्न करें।
  3. एक बार जब कोशिकाएं चयन माध्यम में बढ़ रही हैं, तो पूर्ण विकास मीडिया पर कोशिकाओं का विस्तार करें और प्रयोगात्मक परियोजना के लिए स्टॉक एलिकोट को फ्रीज करें।
    नोट: मार्ग संख्या रिकॉर्ड करें और पांच से अधिक मार्ग संख्या वाले जमे हुए स्टॉक से पूल की गई आबादी के साथ काम करने से बचें। परख करने से पहले माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए नियमित रूप से जांच करें। आदर्श रूप से, ल्यूसिफेरस के अधिकतम संकेत प्राप्त करने के लिए प्रत्येक परख से पहले एक ताजा सेल बैच का उपयोग करें।
  4. चयन माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखें और परख से एक दिन पहले वांछित घनत्व तक पहुंचने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को बीज दें।

4. यौगिक जोड़

नोट: सेलेकेम छोटे अणु पुस्तकालय में लगभग 4,000 यौगिक होते हैं जो डिमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 10 एमएम की स्टॉक एकाग्रता पर पचास 96-वेल प्लेटों में आठ पंक्तियों और 10 स्तंभों में व्यवस्थित होते हैं।

  1. एक स्रोत प्लेट के उपयुक्त कुएं में 30 μL यौगिक का एलिकोट जो नैनोस्केल ध्वनिक तरल डिस्पेंसर के साथ संगत है। 384-अच्छी तरह से पॉलीप्रोपाइलीन प्लेट (384 पीपी प्लेट) का उपयोग करें। इन प्लेटों को सील करके -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करके रखें।
    नोट: यहां वर्णित स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रति दिन कुल 10 परख प्लेटों के लिए है; 10 μM की एक निश्चित एकाग्रता का उपयोग 24 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के साथ अंतिम परख एकाग्रता के रूप में किया गया था।
  2. कमरे के तापमान पर यौगिक पुस्तकालय प्लेटों को पिघलाएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्लेट पूरी तरह से पिघल गई है और कमरे के तापमान के बराबर है। प्लेट में एक तापमान ढाल तरल हैंडलिंग को प्रभावित कर सकता है।
  3. नैनोस्केल ध्वनिक तरल डिस्पेंसर का उपयोग करके 384-वेल परख प्लेट में 50 एनएल /
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्रोग्राम में चयनित स्रोत और गंतव्य प्लेटें इस चरण के लिए उपयोग किए गए लोगों से मेल खाती हैं।
  4. स्प्रेडशीट पर एक डिस्पेंसिंग प्रोग्राम बनाएँ.
  5. सॉफ़्टवेयर खोलें.
  6. कोई नया प्रोटोकॉल खोलें. प्रोटोकॉल टैब से, निम्न विकल्पों का चयन करें: नमूना प्लेट प्रारूप, 384PP; नमूना प्लेट प्रकार, 384PP_DMSO2; और गंतव्य प्लेट प्रकार, सेलकैरियर -384 अल्ट्रा पीएन (चित्रा 2 ए)।
  7. चयन सूची के अंतर्गत, डिस्पेंसिंग प्रोग्राम (चित्रा 2सी) वाली स्प्रेडशीट आयात करने के लिए आयात विकल्प (चित्रा 2बी) का चयन करें।
  8. प्रोटोकॉल चलाएँ विकल्प (चित्रा 2D) का चयन करें, सत्यापित करें कि प्रदर्शित जानकारी सही है, और चलाएँ क्लिक करें.
  9. रन स्टेटस (चित्रा 2 ई) नामक नई विंडो पर, स्टार्ट पर क्लिक करें और प्रॉम्प्ट विंडो (चित्रा 2 एफ, जी) पर प्रदर्शित चरणों का पालन करें।

5. सेल सीडिंग

  1. सेल कल्चर फ्लास्क या सेल कल्चर पेट्री डिश से कोशिकाओं को ट्रिप्सिन करें और एफबीएस युक्त मीडिया को जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
  2. सेल निलंबन को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 390 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, धीरे से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और पूर्ण विकास मीडिया के 10 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. सेल गिनती करें।
  4. पूर्ण संस्कृति मीडिया के 230 एमएल में 4.6 × 107 कोशिकाओं के साथ सेल निलंबन तैयार करें।
    नोट: यह मात्रा और सेल घनत्व 10x 384-अच्छी परख प्लेटों के लिए है और दो 384-वेल प्लेटों की मृत मात्रा है।
  5. खंड 4 में तैयार 384-वेल परख प्लेट के प्रत्येक कुएं में 50 μL सेल निलंबन वितरित करें।
    नोट: सेल सीडिंग या तो मैन्युअल रूप से या बल्क डिस्पेंसर का उपयोग करके किया जा सकता है।
  6. 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के वातावरण के साथ एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

6. सेलुलर सुपरनैटेंट की कटाई

नोट: यहां इस्तेमाल किया जाने वाला तरल हैंडलिंग रोबोट प्लेटफॉर्म 96-टिप्स के लिए मल्टीचैनल आर्म के साथ तरल हैंडलिंग करता है। यदि कोई तरल-हैंडलिंग स्वचालन उपलब्ध नहीं है, तो प्रोटोकॉल को मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके कम-थ्रूपुट प्रारूप में अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. चित्रा 3 में दिखाए गए अनुसार प्रयोगशाला स्वचालन वर्कस्टेशन के डेक को कॉन्फ़िगर करें।
  2. डिस्पोजेबल 96-टिप स्टैक को स्थिति पी 1 (चित्रा 3 ए) पर रखें।
    नोट: प्रत्येक 96-टिप स्टैक आठ डिस्पोजेबल रैक से बना है। 96-युक्तियों के लिए मल्टीचैनल आर्म का उपयोग करते समय, 384-वेल प्लेट को चार क्वाड्रंट में विभाजित किया जाता है। इस प्रकार, प्रत्येक टिप स्टैक दो परख प्लेटों से सुपरनैटेंट को दो खाली, ठोस-काले, 384-वेल प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त है। दो प्लेटों के प्रत्येक रन के बाद पूरे टिप स्टैक को बदलने की आवश्यकता होती है।
  3. परख प्लेटों को पी 2 और पी 4 (चित्रा 3 ए) पदों पर रखें।
  4. खाली, ठोस-काले, 384-वेल प्लेटों को पी 3 और पी 5 पदों पर रखें (चित्रा 3 ए)।
    नोट: इस लचीला और सक्षम रोबोट मंच इस परख के लिए अनुकूलित किया गया है और एक विशेष कार्यक्रम लिखा गया था (चित्रा 3 बी)।
  5. स्थिति P1 से युक्तियाँ प्राप्त करें।
  6. स्थिति P2 पर प्लेट से सतह पर तैरनेवाला के 10 μL को एस्पिरेट करें और स्थिति P3 पर खाली, ठोस-काली प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: युक्तियों को कुएं के अंदर एक उचित गहराई पर तैनात किया जाना चाहिए ताकि कुएं के तल पर सेल मोनोलेयर को परेशान किए बिना सुपरनैटेंट को एस्पिरेट किया जा सके।
  7. स्थिति पी 6 (चित्रा 3 ए) पर कचरे में युक्तियां छोड़ दें।
  8. स्थिति P2 पर प्लेट के शेष कुओं के लिए चरण 6.5-6.7 दोहराएँ, और फिर सतह पर तैरनेवाला को स्थिति P4 से स्थिति P5 में स्थानांतरित करने के लिए समान चरणों को दोहराएं।
    नोट: सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करना सुनिश्चित करें और संबंधित कुओं को खाली, ठोस-काली प्लेट (चित्रा 3 सी, डी) में वितरित करें। चूंकि स्रावित DNGLUC सेल कल्चर माध्यम में बहुत स्थिर है, प्लेटों को सील किया जा सकता है और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों तक रखा जा सकता है।

7. ल्यूसिफेरस परख

नोट: रिपोर्टर में उपयोग किया जाने वाला डीएनजीएलयूसी तेजी से सिग्नल क्षय के साथ फ्लैश कैनेटीक्स प्रदर्शित करता है। सब्सट्रेट (कोलेंटेरज़िन) जोड़ने के बाद ल्यूमिनेसेंस के तेजी से क्षय के कारण, प्लेट रीडर को सुपरनैटेंट में ल्यूमिनेसेंस सिग्नल को मापने के लिए सेट किया जाना चाहिए; सब्सट्रेट को एक कुएं में इंजेक्ट करें और कुछ सेकंड के बाद इसे अच्छी तरह से पढ़ें। इस कारण से, एक प्लेट रीडर का उपयोग करें जो ल्यूमिनेसेंस की निगरानी करने में सक्षम है और सब्सट्रेट इंजेक्टर से लैस है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि इंजेक्शन और पढ़ने के चरणों के बीच का समय सभी नमूनों के लिए समान होगा। प्लेट रीडर पर उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स चित्रा 4 में पाई जा सकती हैं।

  1. अम्लीय मेथनॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान के रूप में देशी कोलेंटेरज़िन तैयार करें (3 एम एचसीएल के 10 μL से 1 एमएल मेथनॉल)।
    नोट: प्रयोगशाला में मेथनॉल की हैंडलिंग के बारे में स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा मार्गदर्शन का पालन करें और त्वचा के संपर्क से बचें। परख शुरू करने से पहले ताजा काम करने वाले सब्सट्रेट समाधान तैयार करें।
  2. इंजेक्टर पंप को प्रारंभ करें (चित्रा 5 ए)।
  3. विआयनीकृत पानी के साथ टयूबिंग को कुल्ला करें (चित्रा 5 बी-डी)।
  4. मेथनॉल के साथ ट्यूबिंग को धो लें।
  5. ट्यूबिंग को धोते समय, सब्सट्रेट 1: 100 को पतला करके काम करने वाले सब्सट्रेट समाधान तैयार करें (एक 384-वेल प्लेट के लिए, सब्सट्रेट स्टॉक समाधान से 220 μL को 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन [पीबीएस] के 21.8 मिलीलीटर में जोड़ें)।
  6. सब्सट्रेट वर्किंग सॉल्यूशन (चित्रा 5 बी-डी) के साथ ट्यूबिंग को कुल्ला करें।
  7. प्लेट को रीडर में लोड करें और चित्रा 4 में वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करके माप शुरू करें।
  8. सभी परख प्लेटों के लिए चरण 7.6-7.7 दोहराएं।
  9. एक बार सभी परख प्लेटों के साथ समाप्त होने के बाद, मेथनॉल के साथ टयूबिंग को कुल्ला करें।
  10. टयूबिंग को विआयनीकृत पानी से धो लें।
    नोट: इस चरण के अंत में, कच्चे ल्यूसिफेरस मान प्राप्त किए जाते हैं जो सेलुलर एटीजी 4 बी गतिविधि के सापेक्ष होते हैं। सेल संख्याओं के सामान्यीकरण के लिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक कुएं में सेल संख्या की गणना करके अगले चरण आवश्यक हैं।

8. सेल निर्धारण और धुंधलापन

नोट: यह चरण एक मल्टीचैनल पिपेट की सहायता से या थोक डिस्पेंसर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से किया जा सकता है।

  1. 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (1x पीबीएस में) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
    नोट: प्रयोगशाला में पैराफॉर्मलडिहाइड की हैंडलिंग के बारे में स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा मार्गदर्शन का पालन करें और त्वचा के संपर्क से बचें। यदि संभव हो तो इस चरण को सुरक्षा हुड में करें।
  2. 1x PBS के साथ तीन बार धोएं।
  3. 15 मिनट के लिए 1x PBS में Hoechst 33342 पतला 1: 5,000 के साथ नाभिक को दाग दें।
  4. 1x PBS के साथ तीन बार धोएं।

9. छवि अधिग्रहण

नोट: एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि अधिग्रहण करें। कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए छवि अधिग्रहण के विकल्प के रूप में, इंट्रासेल्युलर ल्यूसिफेरस गतिविधि भी निर्धारित की जा सकती है। इस संबंध में फायदे और नुकसान हैं कि क्या कोई सेल संख्या या इंट्रासेल्युलर ल्यूसिफेरस गतिविधि को सामान्य करता है, जिसकी चर्चा नीचे की गई है। हम पाते हैं कि सेल संख्या निर्धारित करना कम आक्रामक है और इंट्रासेल्युलर ल्यूसिफेरस मूल्यों को निर्धारित करने की तुलना में कम परिवर्तनशीलता का परिणाम है।

  1. माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च करें (चित्रा 6)।
  2. सेटअप टैब में, सही पूर्वनिर्धारित प्लेट प्रकार चुनें. यदि प्लेट प्रकार पूर्व निर्धारित नहीं है, तो प्लेट आयाम मैन्युअल रूप से दर्ज करें।
  3. इजेक्ट और लोड विकल्प पर क्लिक करके प्लेट को माइक्रोस्कोप में लोड करें।
  4. फिर, 20x Air (संख्यात्मक अपर्चर [NA]: 0.4) उद्देश्य चुनें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि उद्देश्य कॉलर सही मूल्य पर सेट है, जिससे विभिन्न प्लेट प्रकारों के साथ उचित फ़ोकस की अनुमति मिलती है।
  5. चैनल चयन के अंतर्गत, Hoechst 33342 चुनें.
    नोट: समय, शक्ति और ऊंचाई के लिए चैनल सेटिंग्स को उपयोग किए गए प्लेट प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया जाना है।
  6. लेआउट परिभाषित करें पर, प्लेट से सभी कुओं और कुएं से चार फ़ील्ड का चयन करें.
  7. ऑनलाइन जॉब्स पर, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में डेटा स्थानांतरित करने के लिए संबंधित फ़ोल्डर का चयन करें।

10. छवि विश्लेषण

नोट: किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग अधिग्रहित छवियों से सेल नाभिक को विभाजित और गिनने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम एक विशिष्ट ऑनलाइन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के चरणों का वर्णन करते हैं जो कई स्वचालित माइक्रोस्कोप फ़ाइलों के लिए संगत है।

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
  2. छवि विभाजन (चित्रा 7 ए) शुरू करने के लिए छवि विश्लेषण टैब पर जाएं।
  3. इनपुट छवि टैब में, एक नया बिल्डिंग ब्लॉक (चित्रा 7 ए) जोड़ने के लिए + चिह्न पर क्लिक करें।
  4. सूची से, नाभिक खोजें विकल्प (चित्रा 7 ए) का चयन करें और चैनल विकल्प (चित्रा 7 बी) के रूप में होचस्ट 33342 का चयन करें।
  5. छवि पर खंडित वस्तुओं का नेत्रहीन निरीक्षण करें और सबसे सटीक विभाजन विधि का चयन करें।
    नोट: इस प्रयोग के लिए, हमने विधि सी (चित्रा 7 सी) का उपयोग किया। प्रत्येक विधि विकल्प में उपश्रेणियाँ होती हैं जिन्हें सर्वोत्तम विभाजन प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
  6. फिर, परिणाम परिभाषित करें टैब (चित्रा 7 सी) पर क्लिक करें और विधि विकल्प के रूप में मानक आउटपुट का चयन करें।
  7. उपश्रेणी से, नाभिक-वस्तुओं की संख्या और ऑब्जेक्ट गिनती (चित्रा 7 सी) का चयन करें।
  8. विश्लेषण को डिस्क पर सहेजें या डेटाबेस में विश्लेषण सहेजें विकल्प का उपयोग करके विश्लेषण पाइपलाइन सहेजें ।
  9. बैच विश्लेषण टैब के अंतर्गत, ट्री से विश्लेषण किए जाने वाले डेटा का चयन करें.
  10. विधि के अंतर्गत, चरण 10.8 में सहेजी गई विश्लेषण पाइपलाइन का चयन करें।
    नोट: संदर्भित सॉफ़्टवेयर के बाहर से एक स्क्रिप्ट फ़ाइल अपलोड करना या डेटाबेस में सहेजे गए मौजूदा विश्लेषण को अपलोड करना भी संभव है।
  11. विश्लेषण शुरू करने के लिए रन विश्लेषण पर क्लिक करें (चित्रा 7 डी)। इस वर्कफ़्लो के अंत में, दो डेटासेट उत्पन्न होते हैं: सुपरनैटेंट से कच्चे ल्यूसिफेरस मान और प्रत्येक कुएं में सेल नंबर। प्रति सेल ल्यूसिफेरस मान को सामान्य करने के लिए दोनों का उपयोग करें।

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Representative Results

पिछले प्रकाशन8 में, हमने सफलतापूर्वक छोटे अणु और सीआरएनए पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए इस परख का उपयोग किया और एटीजी 4 बी के नए नियामकों की पहचान की। यहां, हम अर्ध-स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रारूप में इस ल्यूसिफेरस रिपोर्टर के प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणामों का वर्णन करते हैं। चित्रा 8 सेल नाभिक और ल्यूमिनेसेंस दोनों के लिए कच्चे डेटा विश्लेषण का एक उदाहरण दिखाता है। ल्यूमिनेसेंस माप का एक विशिष्ट परिणाम चित्रा 8 ए में दर्शाया गया है। डीएमएसओ से बेसल ल्यूमिनेसेंस सिग्नल कॉलम 1 में देखा जा सकता है, और कॉलम 24 में एटीजी 4 बी अवरोधक एफएमके 9 ए के 10 μM की उपस्थिति में। एक ही प्लेट से नाभिक गणना परिणाम चित्रा 8 बी में देखा जा सकता है। एटीजी 4 बी गतिविधि और सेल अस्तित्व का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए प्रत्येक यौगिक के लिए कच्चे मूल्यों को तटस्थ नियंत्रण माध्य मूल्यों के लिए सामान्यीकृत किया गया था (चित्रा 9 ए, बी)। जैसा कि अपेक्षित था, अधिकांश यौगिकों का एटीजी 4 बी गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जैसा कि नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ - कॉलम 1) से बेसल ल्यूमिनेसेंस के करीब मूल्यों से संकेत मिलता है। जेड 'कारक, जो उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक गुणवत्ता सूचकांक है, की गणना समीकरण (1) का उपयोग करके की गई थी:

Z ' = 1 - (3 × Equation 1) (1)

जहां एसटीडीपीओ सकारात्मक नियंत्रण (एफएमके 9 ए) का मानक विचलन है, एसटीडीनेग नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ) का मानक विचलन है, एवीजीपीओ सकारात्मक नियंत्रण का औसत है, और एवीजीनेग नकारात्मक नियंत्रण का औसत है।

हिट का चयन करने के लिए, हमने एटीजी 4 बी अवरोधकों की पहचान के लिए कट-ऑफ मान के रूप में उपयोग किए जाने वाले अनुपात की गणना करने के लिए सामान्यीकृत मूल्यों का उपयोग किया। अनुपात की गणना प्रत्येक यौगिक की एटीजी 4 बी गतिविधि को इसकी सेल व्यवहार्यता से विभाजित करके की गई थी। हमने माना कि अनुपात >1 ने संभावित एटीजी 4 बी सक्रियकर्ताओं का संकेत दिया और अनुपात <1 ने संभावित एटीजी 4 बी अवरोधकों (चित्रा 9 सी) का संकेत दिया। हमने सकारात्मक नियंत्रण एफएमके 9 ए के समान अनुपात मूल्यों वाले सभी यौगिकों का चयन किया और उन यौगिकों को बाहर रखा जो साइटोटोक्सिक थे।

इस स्क्रीन में, हमने उनकी गतिविधि और विषाक्तता की पुष्टि और मूल्यांकन करने के लिए 53 एटीजी 4 बी इनहिबिटर चुने। यौगिकों को 10 सांद्रता में 100 μM से 195 nM तक के दोहरे कमजोर पड़ने के रूप में परीक्षण किया गया था। एकाग्रता प्रतिक्रिया तरीके से इलाज की गई कोशिकाओं ने मात्रात्मक डेटा को फिट करने और ईसी50 मानों की गणना करने में सक्षम बनाया। इनहिबिटर की सापेक्ष विषाक्तता को सेल व्यवहार्यता डेटा द्वारा निर्धारित किया गया था। एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चला कि यह दृष्टिकोण एटीजी 4 बी मॉड्यूलेटर की पहचान को सक्षम बनाता है।

Figure 1
चित्रा 1: परख वर्कफ़्लो। प्रयोग स्थिर सेल लाइन पीढ़ी और एक उच्च-थ्रूपुट परख वर्कफ़्लो के लिए समयरेखा का विवरण देता है, जो स्थिर सेल लाइन पीढ़ी, यौगिक स्क्रीनिंग, ल्यूसिफेरस के माप, छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण से शुरू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: तरल हैंडलर सेटअप के लिए चरण-दर-चरण निर्देश । (ए) प्रोटोकॉल टैब सेटिंग्स। (1) नमूना प्लेट प्रारूप और प्रकार का चयन करें। (2) गंतव्य प्लेट प्रकार का चयन करें। (बी) सूची चुनें टैब। (1) स्प्रेडशीट आयात करने के लिए आयात विकल्प का उपयोग करें। (सी) आयात सूची प्रॉम्प्ट विंडो। (1) आयात करने के लिए पैरामीटर का चयन करें। (2) निष्कर्ष निकालने के लिए आयात करें पर क्लिक करें. (डी) चल रहे प्रोटोकॉल। (1) रन आइकन पर क्लिक करें। (2) रन विकल्प प्रदर्शित करने वाली त्वरित विंडो और प्रोटोकॉल रन शुरू करने के लिए। (e) स्थिति टैब चलाएँ . (1) प्रोटोकॉल प्रारंभ करें. (एफ) स्रोत प्लेट लोड करने के लिए शीघ्र विंडो। (जी) गंतव्य प्लेट लोड करने के लिए शीघ्र विंडो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: तरल हैंडलिंग रोबोट का विन्यास। (ए) टेकन डेक का विन्यास। (P1) 50 μL डिस्पोजेबल टिप स्टैक के लिए स्थिति। (P2, P4) परख प्लेट के लिए स्थिति। (P3, P5) खाली, ठोस-काले, 384-अच्छी प्लेटों के लिए स्थिति। (P6) प्रयुक्त युक्तियों के निपटान के लिए स्थिति। (बी) परख स्क्रिप्ट का स्क्रीनशॉट। (सी) मैक 96 एस्पिरेट विवरण का स्क्रीनशॉट। (1) आकांक्षा तरल वर्ग का चयन करें। (2) आकांक्षा के लिए वॉल्यूम टाइप करें। (3) आकांक्षा के लिए अच्छी स्थिति का चयन करें। (डी) मैक 96 वितरण विवरण का स्क्रीनशॉट। (1) वितरण तरल वर्ग का चयन करें। (2) वितरण के लिए मात्रा टाइप करें। (3) वितरण के लिए एक ही कुएं की स्थिति का चयन करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ल्यूमिनेसेंस प्लेट रीडर सेटिंग्स का स्क्रीनशॉट । (ए) माप सेटिंग्स टैब। (1) एपर्चर का चयन करें। (2) दूरी, समय और सुधार कारक का चयन करें। (बी) प्रोटोकॉल सामान्य सेटिंग्स। (1) प्लेट प्रकार का चयन करें। (2) माप मोड का चयन करें। (3) परख प्लेटों की संख्या का चयन करें। (सी) माप सेटिंग्स का वितरण। (1) माप का चयन करें। (2) माप समय निर्धारित करें। (3) पंप, वितरण गति और मात्रा का चयन करें। (4) वितरण क्रम और प्लेट पुनरावृत्ति को परिभाषित करें। (डी) अच्छी तरह से चयन टैब। (1) माप के लिए कुओं का चयन करें। (2) माप प्रोटोकॉल शुरू करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ल्यूमिनेसेंस प्लेट रीडर के डिस्पेंसर नियंत्रण का स्क्रीनशॉट । (ए) प्रारंभिक टैब। (1) पंप का चयन करें। (2) पंप शुरू करें। (बी) कुल्ला प्रोटोकॉल विकल्प। (1) कुल्ला विकल्प का चयन करें। (2) सेटिंग्स पर जाने के लिए आगे क्लिक करें। (सी) कुल्ला टैब सेटिंग्स विकल्प। (1) पंप का चयन करें। (2) टिप माउंट का चयन करें। (3) अगले टैब पर जाने के लिए आगे क्लिक करें। (डी) कुल्ला शुरू करने के लिए टैब। (1) कुल्ला प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: स्वचालित उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट। छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स का विवरण। (1) सेटअप टैब. (2) प्लेट प्रकार का चयन करें. (3) माइक्रोस्कोप में प्लेट लोड करने के लिए इजेक्ट का चयन करें। (4) उद्देश्य का चयन करें। (5) चैनल जोड़ें। (6) कोलंबस सॉफ्टवेयर में डेटा स्थानांतरित करने के लिए फ़ोल्डर का चयन करें। (7) कुओं का चयन करें। (8) फ़ील्ड का चयन करें। (9) छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए रन प्रयोग टैब पर क्लिक करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: ऑनलाइन सॉफ्टवेयर पर छवि विश्लेषण। (ए) छवि विश्लेषण टैब। (1) बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ने के लिए + पर क्लिक करें। (2) नाभिक खोजें विकल्प का चयन करें। (बी) नाभिक सेटिंग्स का पता लगाएं । (1) चैनल का चयन करें। (2) विभाजन विधि का चयन करें। (सी) परिणाम टैब परिभाषित करें । (1) मानक आउटपुट का चयन करें। (2) परिणाम के रूप में प्रदर्शित किए जाने वाले विकल्प का चयन करें। (डी) छवि विश्लेषण। (1) बैच विश्लेषण टैब। (2) माप का चयन करें। (3) विश्लेषण विधि का चयन करें। (4) छवि विश्लेषण शुरू करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: लूसिफेरस माप और नाभिक गणना से प्रतिनिधि छवियां । (ए) संख्याओं और रंगों द्वारा दर्शाए गए 384-वेल परख प्लेट से ल्यूसिफेरस सापेक्ष तीव्रता मान। (बी) छवि विश्लेषण परिणाम। (1) वस्तुओं की नाभिक संख्या का हीटमैप। (2) प्रत्येक कुएं के लिए परिणाम प्रदर्शित करने वाली तालिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: डेटा सामान्यीकरण के बाद प्रतिनिधि परिणाम। (ए) डेटा सामान्यीकरण के बाद प्रतिनिधि एटीजी 4 बी गतिविधि प्रतिशत का मतलब एक ही प्लेट के भीतर नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ) कुओं से एटीजी 4 बी गतिविधि है। सक्रियकर्ताओं को लाल रंग में और अवरोधकों को नीले रंग में दिखाया जाता है, जिसमें सफेद गतिविधि में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दर्शाता है। नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ) कॉलम 1 में पाया जाता है और सकारात्मक नियंत्रण (एफएमके 9 ए) कॉलम 24 में पाया जाता है। (बी) डेटा सामान्यीकरण के बाद प्रतिनिधि सेल व्यवहार्यता प्रतिशत का मतलब एक ही प्लेट के भीतर नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ) कुओं से सेल संख्या है। प्रसार हरे रंग में और विषाक्तता लाल रंग में दिखाया गया है, पीले रंग के साथ सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दर्शाता है। नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ) कॉलम 1 में पाया जाता है और सकारात्मक नियंत्रण (एफएमके 9 ए) कॉलम 24 में पाया जाता है। (सी) अनुपात मूल्य के अनुसार यौगिकों का वितरण। प्रत्येक बिंदु एक यौगिक का प्रतिनिधित्व करता है। अनुपात की गणना सेल व्यवहार्यता द्वारा एटीजी 4 बी गतिविधि को विभाजित करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एटीजी 4 बी अवरोधकों की पहचान के लिए एक सेल-आधारित रिपोर्टर-जीन परख का वर्णन करता है। प्राथमिक हिट की पहचान β-एक्टिन और डीएनएलयूसी के बीच एलसी 3 बी के पूर्ण लंबाई वाले ओपन रीडिंग फ्रेम को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के उपचार पर ल्यूसिफेरस गतिविधि पर आधारित है। इस परख के कुछ फायदे यह हैं कि यह संवेदनशील, अत्यधिक मात्रात्मक और गैर-संवेदनशील है, क्योंकि यह कोशिकाओं को लाइज किए बिना डीएनजीएलयूसी का पता लगा सकता है। यह पेपर एक स्थिर सेल लाइन और एक प्राथमिक स्क्रीनिंग उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं।

सबसे पहले, यहां वर्णित प्रोटोकॉल ने पैनसी 1 सेल लाइन का उपयोग किया, जो एक उच्च अभिकर्मक प्रभावकारिता और उच्च प्रसार क्षमता प्रस्तुत करता है। यह स्क्रीनिंग विधि अन्य सेल लाइनों का उपयोग करके की जा सकती है, लेकिन पारगमन प्रभावकारिता एक सेल लाइन से दूसरे में भिन्न हो सकती है। दूसरा, किसी को पांच से अधिक मार्ग संख्या वाले जमे हुए स्टॉक से स्थिर सेल आबादी के साथ काम करने से बचना चाहिए, क्योंकि समय के साथ रिपोर्टर के अभिव्यक्ति स्तर में कमी आ सकती है। तीसरा, विभिन्न प्रयोगों के भीतर ल्यूसिफेरस के अधिकतम और सुसंगत संकेत प्राप्त करने के लिए प्रत्येक परख से पहले एक ताजा सेल बैच का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। चौथा, कोशिकाओं को सीडिंग करते समय, या तो मैन्युअल रूप से या थोक डिस्पेंसर का उपयोग करके, सेल निलंबन को पूरे प्लेट में एक सजातीय सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए लगातार हिलाने की आवश्यकता होती है। पांचवां, कुएं से सतह पर तैरनेवाला की कटाई करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि कुएं के तल पर सेल मोनोलेयर को परेशान किए बिना सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करने के लिए कुओं के अंदर उचित गहराई पर युक्तियां तैनात की जाएं। अंत में, परख के दिन सब्सट्रेट वर्किंग समाधान तैयार किया जाना चाहिए। Coelenterazine बहुत प्रकाश-संवेदनशील है और ऑक्सीकरण के अधीन है, और तैयारी के बाद तेजी से सब्सट्रेट क्षय की कुछ रिपोर्टें हैं।

एटीजी 4 बी निषेध या सक्रियण के परिणाम की जांच करने के लिए कई सेल-आधारित परख उपलब्ध हैं, लेकिन एटीजी 4 बी की सेलुलर गतिविधि की जांच सीमितहै। यह विधि गैर-संवेदनशील, अत्यधिक संवेदनशील, मजबूत और सीधे एटीजी 4 बी गतिविधि पर निर्भर है, क्योंकि इसकी गतिविधि के परिणामस्वरूप डीएनएलयूसी की रिहाई होती है। वर्णित प्रोटोकॉल सरल है और 10x 384-वेल प्लेटों को स्क्रीन करने के लिए केवल थोड़े समय की आवश्यकता होती है। विधि का एक और लाभ यह है कि इसका उपयोग विवो में एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए किया जा सकता है, क्योंकि डीएनजीएलयूसी अत्यधिक स्थिर है और इसे सीरम से पूर्व विवो मापा जा सकता है।

यद्यपि हमने इस रिपोर्टर का उपयोग सफलतापूर्वक छोटे अणु और सीआरएनए पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए किया है और एटीजी 4 बी गतिविधि के नए नियामकों की पहचान की है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में विचार करने के लिए कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, वर्णित सेल-आधारित परख एक रिपोर्टर रीडआउट पर निर्भर करती है जो अप्रत्यक्ष रूप से एटीजी 4 बी गतिविधि में परिवर्तन को दर्शाती है, जिससे एटीजी 4 बी गतिविधि के अवरोधकों और सक्रियकर्ताओं दोनों का पता लगाने में सक्षम होता है। इसलिए, हिट को आगे के मूल्यांकन से गुजरना चाहिए ताकि उनकी विशिष्टता और गतिविधि मान्य हो। इसके अलावा, कोशिकाओं में एलसी 3 के स्थानिक वितरण या अन्य ऑटोफैगी से संबंधित प्रोटीन को विनियमित करने के लिए अवरोधकों का उनकी क्षमता में और मूल्यांकन किया जाना चाहिए। दूसरा, हालांकि इस परख को आसानी से इसके सरल हैंडलिंग और डेटा विश्लेषण के कारण छोटे पैमाने पर परख में संशोधित किया जा सकता है, लेकिन इसे सब्सट्रेट जोड़ और बाद में ल्यूमिनेसेंस माप के लिए स्वचालन की डिग्री की आवश्यकता होती है। तीसरा, क्योंकि डीएनजीएलयूसी रिलीज के तंत्र को आणविक स्तर पर खराब समझा जाता है, स्राव मार्ग के तत्वों के साथ हस्तक्षेप करने वाले यौगिक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। अंत में, सेल व्यवहार्यता को इंट्रासेल्युलर ल्यूसिफेरस गतिविधि द्वारा भी निर्धारित किया जा सकता है। यद्यपि हम पाते हैं कि सेल संख्या का निर्धारण कम आक्रामक है और इंट्रासेल्युलर ल्यूसिफेरस मूल्यों को निर्धारित करने की तुलना में कम परिवर्तनशीलता का परिणाम है, सेल संख्या निर्धारित करना छोटे शोध प्रयोगशालाओं के लिए उनके उपयोग को सीमित करता है क्योंकि वे इमेजिंग उपकरण, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर और डेटा भंडारण के संदर्भ में कठिनाइयों को प्रस्तुत करते हैं। कुल मिलाकर, विकसित सेल-आधारित रिपोर्टर-जीन परख एटीजी 4 बी अवरोधकों की पहचान को सक्षम बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल द्वारा एमआरसी-यूसीएल यूनिवर्सिटी यूनिट ग्रांट रेफ MC_U12266B, एमआरसी डिमेंशिया प्लेटफॉर्म ग्रांट यूके एमआर / M02492X/1, अग्नाशय ी कैंसर यूके (अनुदान संदर्भ 2018RIF_15), और यूसीएल चिकित्सीय त्वरण सहायता योजना के लिए कोर फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था, जो अवधारणा 2020 यूसीएल एमसी / पीसी / 19054 में एमआरसी विश्वास से वित्त पोषण द्वारा समर्थित था। एक्टिनएलसी 3 डीएनजीएलयूसी (पीएमओडब्ल्यूएस-एक्टिनएलसी 3 डीएनजीएलयूसी) को एन्कोडिंग करने वाला प्लास्मिड डॉ रॉबिन केटलर (मानव चिकित्सा विभाग, मेडिकल स्कूल बर्लिन) से प्राप्त किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) Tecan 30038609 Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo BioTek bulk dispenser
Coelenterazine Santa Cruz Biotechnology sc-205904 substrate
Columbus Image analysis software Perkin Elmer Version 2.9.1 image analysis software
DPBS (1x) Gibco 14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile Beckman Coulter 001-14555 384PP plate
EnVision II Perkin Elmer luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL Selleckchem L3600 Selleckchem
FMK9A MedChemExpress HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates Greiner Bio-One 781076 solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software Perkin Elmer Version 5.1 imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water ThermoFisher H3570 Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software Labcyte/Beckman Coulter nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System Perkin Elmer automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids Perkin Elmer 6057300 CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent Merck TR-1003-G polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals ThermoFisher J61278.ME Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot Tecan liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche Merck 6366244001 DNA transfection reagent

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References

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जीव विज्ञान अंक 196
ऑटोफैगी से संबंधित 4 बी सिस्टीन पेप्टिडेस के अवरोधकों के लिए सेल-आधारित दवा स्क्रीनिंग
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Pilger, D. R. B., Luft, C.,… More

Pilger, D. R. B., Luft, C., Ketteler, R. Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase. J. Vis. Exp. (196), e65464, doi:10.3791/65464 (2023).

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