Summary
Ici, nous présentons un protocole pour décrire la métagénomique des amplicons afin de déterminer la communauté bactérienne des raisins Traminette, des raisins en fermentation et du vin final.
Abstract
Les progrès de la technologie de séquençage et l’accès relativement facile à l’utilisation d’outils bioinformatiques pour profiler les structures des communautés microbiennes ont facilité une meilleure compréhension des microbes cultivables et non cultivables dans le raisin et le vin. Au cours de la fermentation industrielle, les microbes, connus et inconnus, sont souvent responsables du développement et de la mauvaise saveur des produits. Par conséquent, le profilage des bactéries du raisin au vin peut permettre de comprendre facilement la dynamique microbienne in situ . Dans cette étude, les bactéries du moût de raisin Traminette en fermentation et le vin final ont été soumis à une extraction d’ADN qui a donné 15 ng/μL à 87 ng/μL. L’amplicon 16S de la région hypervariable de la région V4 a été séquencé, des bactéries relativement abondantes constituées des phylums Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota et suivies par Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcocto et Acidobacteriota. Une analyse du diagramme de Venn des unités taxonomiques opérationnelles uniques (OTU) partagées a révélé que 15 embranchements de bactéries étaient communs au moût de raisin, à l’étape de fermentation et au vin final. Des embranchements qui n’avaient pas été signalés auparavant ont été détectés à l’aide du séquençage d’amplicon 16S, ainsi que des genres tels que Enterobacteriaceae et Lactobacillaceae. La variation de l’utilisation des nutriments organiques dans le vin et son impact sur les bactéries ont été testés ; Cuve Traminette R contenant Fermaid O et Traminette L stimulée avec Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversité alpha à l’aide du test de Kruskal-Wallis a déterminé le degré de planéité. La diversité bêta indiquait un changement dans les bactéries au stade de la fermentation pour les deux traitements, et les bactéries du vin finales étaient similaires. L’étude a confirmé que le séquençage d’amplicon 16S peut être utilisé pour surveiller les changements bactériens pendant la production de vin afin de soutenir la qualité et une meilleure utilisation des bactéries du raisin pendant la production de vin.
Introduction
Le raisin Traminette se caractérise par une production de vin de qualité supérieure, en plus d’un rendement appréciable et d’une résistance partielle à plusieurs infections fongiques 1,2,3. La fermentation naturelle du raisin repose sur les micro-organismes associés, l’environnement de production du vin et les cuves de fermentation 4,5. Souvent, de nombreux établissements vinicoles s’appuient sur des levures sauvages et des bactéries pour la fermentation, la production d’alcool, les esters, le développement des arômes et des saveurs6.
L’objectif de cette étude est d’examiner la composition bactérienne des raisins et de surveiller leur dynamique pendant la fermentation. Cependant, l’utilisation moderne de ferments lactiques tels que Saccharomyces cerevisiae pour la fermentation primaire, où l’alcool est produit, est commune à différents styles de vin7. De plus, la fermentation secondaire, où l’acide malique est décarboxylé par Oenococcus oeni en acide lactique, améliore le profil organoleptique et gustatif du vin et réduit l’acidité du vin 8,9. Avec les progrès récents dans l’utilisation de méthodes indépendantes de la culture, il est maintenant possible de déterminer différents microbes associés au raisin de cuve et aux espèces qui sont transférés au moût et participent à la fermentation à différents moments jusqu’au produit final10.
Les rôles et la dynamique des bactéries sauvages de différents raisins transférés au moût pendant la fermentation du vin sont mal compris. La taxonomie de bon nombre de ces bactéries n’est même pas connue, ou leurs propriétés phénotypiques ne sont pas caractérisées. Cela rend leur application en coculture encore peu utilisée. Cependant, une analyse microbiologique basée sur des cultures a été utilisée pour déterminer la population bactérienne associée au raisin et au vin10. Il est bien connu que le placage de culture sélective est fastidieux, sujet à la contamination, a une faible reproductibilité et le rendement peut être douteux ; il manque également des espèces bactériennes dont les besoins de croissance sont inconnus. Des études antérieures indiquent que les méthodologies basées sur le gène de l’ARNr 16S indépendantes de la culture offrent une approche plus fiable et plus rentable pour caractériser les communautés microbiennes complexes11. Par exemple, le séquençage des régions hypervariables du gène de l’ARNr 16S a été utilisé avec succès pour étudier les bactéries dans les feuilles de vigne, les baies et le vin 12,13,14. Des études ont montré que l’utilisation du métabarcodage de l’ARNr 16S ou du séquençage métagénomique entier convient aux études du microbiome15. Des informations émergentes sur le lien possible entre la diversité bactérienne et leurs attributs métaboliques pendant la production de vin, ce qui pourrait aider à déterminer les propriétés œnologiques et le terroir16.
La nécessité de maximiser les avantages des outils métagénomiques utilisant le séquençage de nouvelle génération (NGS) pour étudier l’écologie microbienne du raisin et du vin a été soulignée16,17. De plus, l’utilisation de méthodes indépendantes de la culture basées sur le séquençage à haut débit pour profiler la diversité microbienne de l’écosystème alimentaire et de fermentation est devenue très pertinente et précieuse pour de nombreux laboratoires et est recommandée pour un usage industriel18,19. Il offre un avantage de détection et de profilage taxonomique des populations microbiennes actuelles et de la contribution des microbes environnementaux, de leur abondance relative et de leur diversité alpha et bêta20. Le séquençage de la région variable de la région 16S est devenu un gène de choix important et a été utilisé lors de différentes études écologiques microbiennes.
Alors que de nombreuses études se concentrent sur les champignons, en particulier les levures, pendant la fermentation du vin21, cette étude a rapporté le séquençage d’amplicon 16S et les outils bioinformatiques utilisés pour étudier les bactéries pendant la fermentation des raisins Traminette pour la production de vin.
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Protocol
1. Production de vin expérimentale
- Obtenez des raisins Traminnette du vin Dynamis Estate à Jonesville, vignoble de Caroline du Nord, égrappez et écrasez pour libérer le moût dans deux fermenteurs ouverts séparés de 600 L et laissez sur les peaux pendant environ 4 jours avec les couvercles.
- Défoncez les bouchons une fois par jour pour garder la peau humide et limiter la production d’acides volatils (VA).
NOTE : L’idée est qu’une grande partie des précurseurs aromatiques (monoterpènes) sont situés dans les peaux et laissent le jus en contact avec la peau pour augmenter le potentiel aromatique du vin. - Au bout de 4 jours, lancer Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Cette levure a été sélectionnée car elle est un fermenteur puissant et est associée à la mise en valeur du caractère variétal du vin à partir des raisins.
- Dans une cuve, Traminette R, ajoutez 20 g/hL de Fermaid O lorsque le brix est à 17,7 et 20 g/hL de Fermaid O et 12,5 g/hL de Fermaid K à 13,1 g/hL pour obtenir une sécurité de fermentation, tandis que dans l’autre cuve Traminette L, ajoutez 40 g/hL de Stimula Sauvignon blanc lorsque le brix est à 17,1. Ajoutez également 20 g/hL de Fermaid O lorsque le brix est à 13,4 pour renforcer le caractère variétal du vin.
- Prélever des échantillons en double de moût (jour 1), de levure ajoutée (jour 4), de moût fermenté (jour 15) et de vin fini (jour 30) et conserver à -20 °C avant l’extraction de l’ADN et l’analyse métagénomique.
2. Extraction d’ADN pour la métagénomique
- Conserver tous les échantillons en double obtenus ci-dessus sur de la glace jusqu’à la première centrifugation.
- Transvaser 20 mL de l’échantillon fermenté dans un tube stérile à bouchon à vis de 50 mL.
- Ajouter 10 mL d’eau froide et homogénéiser (vortex). Centrifuger pendant 1 min à 800 x g à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL.
REMARQUE : Cette étape éliminera les solides de l’échantillon. - Répétez l’étape 2.3 deux fois et regroupez les surnageants dans le même tube.
- Centrifuger le surnageant à 3 000 x g à 4 °C pendant 20 min pour granuler les cellules. Jetez le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS, transférer dans un tube à bouchon à vis de 2 mL et centrifuger à 14 000 x g pendant 2 min. Effectuez deux autres lavages à l’aide de PBS.
- À cette étape, congelez les granulés à -20°C ou suivez l’étape 2.8. Il est important que tous les échantillons soient traités de la même manière.
- Ajouter 978 μL de tampon de phosphate de sodium. Préparez le tampon de phosphate de sodium, ajoutez 3,1 g de NaH2PO4· H2O et 10,9 g de Na2HPO4 (anhydre) à H2O distillé pour obtenir un volume de 1 L et ajuster le pH à 7,4.
- Ajouter 122 μL de tampon d’ADN (kit de spin d’ADN) et vortex.
- Laissez reposer au réfrigérateur (4 °C) pendant 45 min-1 h. Vortex les échantillons toutes les 15 min. Cette étape peut être laissée toute la nuit (o/n) ou jusqu’à ce qu’elle soit prête à continuer à utiliser le kit de spin DNA.
- Transférez 1 mL d’échantillon dans un tube de solution de lyse 1 (trousse de centrifugation de l’ADN) et serrez le capuchon (écrivez le numéro de l’échantillon sur le côté du tube et non sur le bouchon ; les réactifs de la trousse enlèveront tout ce qui est écrit sur le bouchon).
- Homogénéiser l’échantillon dans un broyeur à billes (6,5 m/s, CY : 24 x 2) pendant 60 s trois fois. Si le broyeur à billes a l’appareil pour mettre de la glace, mettez 50 g de glace carbonique sous les tubes. Sinon, conserver les échantillons sur de la glace humide pendant 5 minutes entre chaque étape d’homogénéisation.
- Tubes E de matrice de lyse centrifugeuse (kit de spin ADN) pendant 1 min à 16800 x g (ou vitesse maximale).
- Transférez le surnageant dans un microtube propre. Par la suite, ajouter 250 μL de réactif de solution de précipitation des protéines (PPS) (kit de spin ADN) et mélanger en secouant le tube à la main 10 fois.
- Centrifuger pendant 5 min à 16800 x g pour granuler le précipité.
- Transférer le surnageant dans un tube stérile de 15 ml. Ajouter 1 mL de suspension de matrice de liaison (kit de spin ADN) au surnageant.
REMARQUE : Remettre en suspension la suspension de la matrice de liaison avant utilisation jusqu’à ce qu’elle soit homogène. - Retournez les tubes à la main pendant 2 min, puis laissez reposer les tubes dans une grille pendant 3 min (pour permettre la décantation de la matrice de silice).
- Retirer délicatement 1 mL de surnageant. Remettre la matrice en suspension dans le surnageant restant.
- Transférer 600 μL du mélange dans un tube filtrant à centrifugation (kit de centrifugation DNA) et centrifuger pendant 1 min à 14500 x g.
- Ajouter le reste du mélange et centrifuger.
- Décanter le flux et ajouter 500 μL de solution de lavage (kit d’essorage DNA) dans le tube filtrant et centrifuger pendant 1 min à 14500 x g (assurez-vous d’ajouter de l’EtOH à la solution de lavage ; voir le manuel du produit). Décanter le passage et répéter le lavage deux fois de plus (3 lavages au total).
- Décanter le flux et centrifuger pendant 2 minutes supplémentaires à 14 500 x g pour sécher la matrice de la solution de lavage résiduelle.
- Retirez le filtre d’essorage et placez-le dans un tube de récupération frais (kit d’essorage DNA). Faites sécher le filtre à l’air libre pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Réchauffez l’eau sans DNAse (kit d’essorage DNA) à 55 °C pendant 5 min. Ajoutez 50 μL d’eau exempte d’ADN et remuez doucement la matrice sur la membrane filtrante avec une pointe de pipette pour une élution efficace de l’ADN. Laisser reposer les échantillons à RT pendant 1 min, puis centrifuger pendant 1 min à 14500 x g pour éluer l’ADN.
- Placez les échantillons sur de la glace. Chargez le mélange d’échantillons (2 μL d’échantillon + 2 μL d’eau + 1 μL de tampon de chargement) dans un gel. Mesurez la concentration d’ADN.
- Conservez les échantillons à -20 °C.
- Utilisez un spectrophotomètre pour quantifier l’ADN extrait.
REMARQUE : Un volume d’ADN de 1 μL a été déposé et quantifié, et la qualité de l’ADN a été notée à un rapport A260/A280.
3. Électrophorèse de l’ADN
- Préparer un gel d’agarose à 1 % dans un tampon 0,5 Tris/Borate/EDTA (TBE) (20 mL pour un mini gel, 70-100 mL pour un gel moyen). Peser l’agarose + tampon, faire bouillir au micro-ondes pour faire fondre l’agarose, peser à nouveau et ajouter dH2O au poids d’origine. Refroidir la solution d’agarose à 55-60 °C et verser dans le gélifiant avec peigne. Laissez le gel se solidifier.
- Ajouter 1 μL de tampon de chargement de gel 10x à l’échantillon (10 μL) et charger sur le gel à côté d’un marqueur de poids moléculaire. Passez du négatif (noir) au positif (rouge) à 100-115 V (gros gel) ou 90 V (mini gel) jusqu’à ce que le colorant bleu soit près du fond.
- Teinturer le gel pendant 30 minutes dans 1 μL/mL de bromure d’éthidium ou de SYBR vert (gants et lunettes en nitrile nécessaires), rincer à l’eau et visualiser sous une source de lumière ultraviolette (UV). Parmi les échantillons en double, sélectionnez le rendement le plus élevé pour un traitement ultérieur.
4. Séquençage à haut débit
- Amplifier la région hypervariable V4 du gène de l’ARNr 16S à l’aide d’amorces spécifiques 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') et 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Régler les conditions de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à 94 °C pendant 2 min, 30 cycles de 94 °C pendant 20 s, 58 °C pendant 20 s, 65 °C pendant 1 min et 65 °C pendant 10 min (extension finale).
- Réalisez des réactions PCR avec un master mix PCR haute fidélité (Table of Materials).
- Générez des banques avec un kit de préparation de banques d’ADN, puis séquencez en utilisant le séquençage par paires sur une plateforme de séquençage.
REMARQUE : Ici, les banques générées avec le kit de préparation de banques d’ADN NEBNext Ultra II ont été séquencées à l’aide d’un séquençage Illumina apparié (2 × 250 pb) sur la plate-forme novaseq6000. - Suivez les étapes de séquençage :
- Étape 1 : Cisaillez l’ADN avec une enzyme, généralement par une méthode qui sélectionne pour une taille générale.
- Ajouter 3,5 μL de tampon de séquençage et 1,5 μL de mélange enzymatique à 25 μL d’ADN (environ 1 μg), mélanger 10 fois avec une pipette et tourner rapidement.
- Placer dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : préchauffer le couvercle à 75 °C, (1) 30 min pour 20 °C (2) 30 min pour 65 °C (3) maintenir à 4 °C.
- Étape 2 : Ajouter des adaptateurs par ligature
- Ajoutez 15 μL de mélange maître de ligature, 1,25 μL d’adaptateur, 0,5 μL d’activateur de ligature et 30 μL de mélange d’ADN de préparation finale avec une pipette.
- Incuber à 20 °C pendant 15 min dans un thermocycleur, puis ajouter 1,5 μL d’enzyme réactif d’excision spécifique à l’uracile (USER) au mélange de ligature pour obtenir un total de 48,26 μL. Incuber 37 °C pendant 15 min.
- Ajouter 43,5 μL de billes magnétiques à l’ADN de ligature de l’adaptateur, mélanger 20 fois avec une pipette et incuber pendant 5 min à RT. Séparer les billes avec un support magnétique, puis incuber pendant 5 à 10 minutes et jeter le surnageant.
- Lavez le granulé avec 100 μL d’éthanol à 80 %, séchez-le pendant 30 s et lavez-le à nouveau. Éluer les billes et les granulés dans 8,5 μL de 10 mM de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLCH 20, mélanger avec une pipette et incuber à RT pendant 2 min.
- Incuber dans le rack magnétique et prélever 7,5 μL d’ADN élué en tant que surnageant. Placez l’élu dans un nouveau tube et effectuez une étape de PCR.
- Tout d’abord, ajoutez 12,5 μL de mélange maître, 2,5 μL d’amorce d’index i7 et 2,5 μL d’amorce PCR universelle/amorce i5 à 7,5 μL d’ADN ligaturé par adaptateur pour obtenir 25 μL de mélange réactionnel PCR. Utilisez les conditions PCR suivantes : préchauffez le couvercle à 103 °C. 98 °C pendant 30 s, 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 75 s, 65 °C pendant 5 min et maintenez à 4 °C après 10 cycles.
- Nettoyez l’ADN amplifié de 25 μL. Ajouter 22,5 μL de billes magnétiques et mélanger 20 fois. Incuber à RT pendant 5 min et retirer 50 μL de surnageant. Lavez les billes avec 100 μL d’éthanol à 80 % et retirez tout l’éthanol en séchant doucement les billes pendant 30 s.
- Remettre les billes brun foncé en suspension dans 16 μL d’eau, mélanger 20 fois avec une pipette et placer dans le support magnétique pendant 30 à 60 s. Transférez 15 μL dans un nouveau tube.
- Déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre. Mélanger 90 μL de tampon + 1 μL de colorant + 2 μL d’échantillon de banque d’ADN et lire la concentration. Diluez l’ADN à 2 nM, chargez 27-30 μL dans la cellule d’écoulement et placez-le dans le séquenceur.
- Étape 3 : Séquencez les adaptateurs, hybridez les banques générées ci-dessus à la matrice de la cellule d’écoulement à motifs et capturez l’ADN selon les instructions du fabricant. Utilisez-le comme modèle pour la deuxième synthèse.
- Ensuite, amplifiez le deuxième brin en un groupe clonal. Linéarisez le cluster et bloquez les sites actifs. Ajouter une amorce de séquençage pour fournir un site de séquençage par synthèse dans la séquence selon le protocole du fabricant.
REMARQUE : Chimiquement, les nucléotides modifiés se lient au brin matrice d’ADN en utilisant une complémentarité naturelle. Chaque nucléotide a une étiquette fluorescente et une terminaison réversible qui bloque l’inclusion de la base suivante. Par conséquent, la présence d’un signal fluorescent indique quel nucléotide est inséré et la terminaison est clivée pour que la base suivante se lie.
- Ensuite, amplifiez le deuxième brin en un groupe clonal. Linéarisez le cluster et bloquez les sites actifs. Ajouter une amorce de séquençage pour fournir un site de séquençage par synthèse dans la séquence selon le protocole du fabricant.
- Étape 4 : Amplifier le brin à liaison unique pour obtenir des groupes de séquences qui sont séquencées en tandem par synthèse.
REMARQUE : Les clusters donnent un signal plus lumineux qu’un seul brin grâce à un balayage bidirectionnel et à une chimie de séquençage à deux canaux. Le logiciel de séquençage transfère automatiquement les fichiers d’appel de base (*.cbcl) vers l’emplacement spécifié du dossier de sortie pour l’analyse des données.
- Étape 1 : Cisaillez l’ADN avec une enzyme, généralement par une méthode qui sélectionne pour une taille générale.
5. Bioinformatique
- Générez les données de séquence sous forme de fichiers FASTQ. Analysez pour inclure les parties suivantes.
- Partie I :
- Enregistrez les fichiers FASTQ obtenus à partir du séquenceur, cliquez pour ouvrir un fichier de feuille de calcul et créez des fichiers de mappage/métadonnées.
- Ouvrez le site Web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), téléchargez les fichiers FASTQ, lisez QC, filtrage et découpage dans QIIME222. Dépôt des séquences brutes sous forme d’archive de lecture de séquence (SRA) et de GenBank dans NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
- Partie II : Allez sur le site Web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), effectuez les lectures d’extrémités appariées démultiplexées, la substitution de filtres et les erreurs de chimère, et fusionnez à l’aide de DADA223. Utilisez le classificateur naïf bayésien entraîné sur la base de données Silva version 132 99% OTU pour effectuer une affectation taxonomique bactérienne à 97% de similarité24.
- Partie III : Ouvrez le site Web de MicrobiomeDB, cliquez pour télécharger des fichiers et générer des courbes OTU alpha-diversité, bêta-diversité, abondance relative et raréfaction (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Partie IV : Ouvrez une feuille de calcul et transférez des données pour créer des cartes thermiques, des diagrammes de Venn et une taille d’effet d’analyse discriminante linéaire (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Partie I :
6. Analyse statistique
- Ouvrez QIIME222 et déterminez les différences significatives de diversité alpha entre les groupes à l’aide du script alpha-group-significat. Celui-ci effectuera également le test de Kruskal-Wallis.
- Déterminez les différences de diversité bêta entre les groupes à l’aide de PERMANOVA, y compris un test par paires25.
- Obtenez les différences significatives dans la structure de la communauté bactérienne entre les groupes à l’aide de MicrobiomeDB. Une valeur p ≤0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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Representative Results
La quantité et la qualité de l’ADN extrait du moût de raisin, du vin en fermentation et du vin final ont d’abord été déterminées ; la valeur de la quantité varie de 15 à 87 ng/μL (tableau 1).
Séquençage et bioinformatique
Le séquenceur à haut débit Illumina a généré un fichier FASTQ qui a été importé dans le Nephele et visualisé sur la plate-forme QIIME 226. Tout d’abord, le logiciel FastQC a été utilisé pour vérifier la qualité de la séquence. Ensuite, il a été coupé aux extrémités 5' et 3' pour éliminer les nucléotides de mauvaise qualité, débruité, fusionné et appauvri des séquences chimériques avant de se regrouper en UTO (définition opérationnelle pour une espèce) à l’aide du débruiteur DADA223. Ils ont été cartographiés sur des taxons bactériens à l’aide de la base de données SILVA v138.1. Les séquences ont été regroupées en OTU sur la base d’une similarité de séquence nucléotidique de 99 %. La figure 1 montre les courbes de raréfaction DADA2 pour les UTO ; il a atteint un plateau. Cela indique que suffisamment de séquences ont été couvertes pour indiquer la majorité de la diversité microbienne. L’analyse répétée des séquences n’a pas généré de différence significative.
La carte thermique basée sur l’abondance relative des bactéries à différents régimes du moût de raisin au vin est illustrée à la figure 2. Les embranchements les plus dominants indiqués en rouge sont les Protéobactéries, les Actinobacteriota, les Firmicutes, les Bacteroidota, les Fusobacteriota et, suivis des Verrucomicrobiote, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota et Acidobacteriota. Les bactéries les moins abondantes étaient indiquées en bleu. Beaucoup de ces groupes étaient présents dans les moûts, lorsque la levure était ajoutée mais absente pendant la fermentation, en particulier Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota et Elusimicrobiota. L’abondance relative a également été déterminée au niveau du genre, et les résultats ont indiqué des genres importants tels que les Enterobacteriaceae et les Lactobacillaceae, comme le montre la figure 3. Une analyse du diagramme de Venn de l’OTU unique partagée a révélé que 15 bactéries étaient présentes du moût de raisin de cuve au vin final (Figure 4). Les résultats du séquençage de l’amplicon basé sur la région variable V4 ont également indiqué la diversité alpha dans les deux Traminette R et L. La figure 4 montre la régularité des espèces comme marque de distribution, qui est différente entre les deux traitements nutritionnels. Les données ont montré que le changement de diversité dans le Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O était inférieur à 1 à 13,4 brix, et que la régularité se rapproche de zéro car les abondances relatives varient. Les données ont également été analysées pour la diversité bêta ; La figure 5 montre la différence entre les deux Traminette R et L de fermentation ; Les bactéries étaient similaires aux stades du moût et de la levure. Il y a eu un changement dans les bactéries au stade de la fermentation pour les deux traitements, et cela semble similaire dans le vin final (Figure 6).
Figure 1 : Graphiques de raréfaction des UTO observées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Carte thermique de l’abondance relative. La carte thermique de l’abondance relative aux niveaux de phylum R et L n’était pas significativement différente (p ≤0,05). La barre de légende indique le score clé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Abondance relative des dix principaux taxons. L’abondance relative au niveau du genre des dix principaux taxons classés par milieu avec le test de la somme des rangs de Wilcoxon (p ≤0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Diagramme de Venn. Les bactéries uniques et partagées entre le moût, la levure ajoutée, la fermentation et le vin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Diversité alpha de Traminette R et Traminette L. Diversité alpha de l’indice H de Shannon des deux Fermaid O et Stimula Sauvignon blanc et Fermaid O nutritionnels (Dunn > 0,05) basée sur l’analyse du test de Kruskal-Wallis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Analyse en composantes principales. Analyse en composantes principales des données d’ARNr 16S de la diversité bêta basée sur Bray-Curtis des deux Fermaid O nutritionnels et Stimula Sauvignon Blanc et Fermaid O à différents stades de la production de vin. Le cercle bleu représente un groupe d’étapes d’ajout de moût et de levure. Le cercle rouge indique le vin final et le cercle noir est l’étape de fermentation dans les deux traitements. Les axes 1 et 2 sont des variantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Date d’échantillonnage | Échantillon | A260/A280 | Concentration ng/μL Traminette R | A260/A280 | Concentration ng/μL Traminette L |
| 8/30/21 | Raisin | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | Devoir | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | Se reposer | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | Levure ajoutée | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | Fermentation | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | Fermentation | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | Vin final | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
Tableau 1 : La quantité et la qualité de l’ADN extrait du moût de raisin, du vin en fermentation et du vin final.
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Discussion
Le protocole de métagénomique commence par l’échantillonnage du moût de raisin, et lorsque la levure a été ajoutée au moût, le vin en fermentation et les échantillons de vin finaux. Cela a été suivi par une extraction d’ADN dupliqué qui a été extraite avec succès de ces échantillons. Les quantités obtenues variaient en concentration de 15 ng/μL à 87 ng/μL. Cela montre que le protocole d’extraction de l’ADN est efficace pour les études métagénomiques du vin. Bien que la qualité de l’ADN chez A260/A280 varie, cela peut être attribué à différents paramètres qui peuvent affecter l’extraction, tels que la concentration d’alcool et d’autres métabolites de fermentation qui se sont développés pendant et après la fermentation, ainsi que d’autres matières végétales organiques qui peuvent inhiber l’extraction du génome. Des études antérieures ont rapporté une observation similaire sur le matériel végétal métagénomique27. Cependant, l’ADN extrait dans le protocole décrit a atteint une quantité suffisante pour l’étape suivante de l’analyse. Le code-barres PCR nécessaire aux études métagénomiques, en particulier à l’aide de la plateforme de séquençage Illumina, nécessite que la quantité minimale d’ADN soit fixée à 1 ng/L. La région V4 a été séquencée, et la détermination de la diversité bactérienne nécessite l’utilisation du séquençage du gène de l’ARNr 16S ; ce gène a des régions variables différentes de V1-V923. Un total de 6 393 443 lectures de séquences appariées avec une moyenne de 399590.1875 ± 138442.6148 à partir de l’ADN extrait des différents échantillons. V4 a été couramment utilisé, et il est considéré comme la région hypervariable du gène qui est bonne pour l’analyse taxonomique et de la diversité bactérienne. Pendant le séquençage, des séquences appariées d’Illumina d’environ 200 à 300 pb ont été générées. Il existe différentes plateformes utilisées pour séquencer l’ADN extrait des aliments et des boissons fermentées28. Les raisons d’utiliser la plate-forme Illumina sont les suivantes : (1) Illumina est une plate-forme de séquençage de 2e génération avec un excellent rendement, et sa chimie donne un faible taux d’erreur et un profil faible. Il est également abordable par rapport aux kits disponibles dans le commerce pour la préparation des bibliothèques, et ses lectures relativement courtes sont idéales pour l’expression différentielle. La dernière étape du protocole était la bioinformatique, un élément important de l’utilisation du séquençage de l’amplicon 16 pour la détermination de la diversité microbienne. Le contrôle de la qualité des séquences obtenues par le fichier FASTQ a été très bon, et les UTO obtenues à partir de QIIME ont abouti à une analyse taxonomique montrée dans les résultats de l’abondance relative, de la diversité alpha et bêta.
Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est devenu un outil important pour profiler les bactéries de différentes communautés microbiennes de fermentation. Dans cette étude, la classification des amplicons 16S a d’abord été effectuée au niveau du phylum, et un groupe de bactéries plus diversifié a été remarqué que précédemment12 pendant la fermentation du vin de raisin ; 15 embranchements ont également été partagés, comme l’indique l’analyse du résultat de Venn. De plus, l’analyse au niveau du genre a montré la présence de genres importants, tels que les Enterobacteriaceae et les Lactobacillaceae qui étaient plus abondants dans le réservoir Traminette R. Nous avons limité notre analyse à la taxonomie au niveau du genre ; Il existe des études où la méthode a été utilisée pour l’identification au niveau de la taxonomie au niveau de l’espèce par inférence d’échantillon à haute résolution23. L’une des limites du séquençage des amplicons est que les données de séquence ne peuvent pas déterminer la taxonomie au niveau de la souche en raison de la courte longueur de la séquence de l’ARNr 16S. Une autre limitation est la détection des chloroplastes et des mitochondries. Il sera souhaitable que la procédure bioinformatique puisse être utilisée pour éliminer ces séquences car elles sont des contaminants des plants de raisin. Cependant, protocole d’amplification utilisant des pinces PNA-ADN pour maximiser la contamination des chloroplastes et des mitochondries29. La grande abondance de Firmicute dans les raisins doit, pendant la fermentation et le vin final, concorder avec les études précédentes sur le raisinde cuve 30. Les résultats de l’analyse de la diversité alpha ont indiqué l’uniformité bactérienne de chaque traitement nutritionnel de fermentation ; il semble que le nutriment Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O ait généré une bactérie plus diversifiée. De plus, les données sur la diversité bêta ont montré le changement des bactéries au stade de la fermentation ; Les changements dynamiques indiquent que l’étape de fermentation est une période très importante où les changements nutritionnels affectent la sélection bactérienne. La technique peut être adaptée et utilisée par les industries pour surveiller la fermentation et améliorer la qualité et la cohérence28. Cependant, d’autres études seront nécessaires pour mieux comprendre l’impact des nutriments organiques sur la diversité microbienne pendant la fermentation du vin.
Cette étude est la première à examiner la diversité bactérienne pendant la fermentation des raisins et du vin Traminette en utilisant le séquençage du code-barres de l’amplicon 16S pour déterminer les changements bactériens. Cela a confirmé la diversité des bactéries au niveau du phylum et du genre. Les protéobactéries, suivies des firmicutes, étaient les plus abondantes au fur et à mesure que la fermentation progressait vers le vin final. De nombreux embranchements qui n’avaient pas été signalés auparavant ont été détectés à l’aide du séquençage d’amplicons 16S, ce qui a confirmé que la méthode peut être utilisée pour surveiller la production de vin. La diversité alpha a montré le rôle du changement nutritionnel ; Il a eu un impact sur les bactéries de fermentation, tandis que la diversité bêta indique les changements au cours de la phase de fermentation. D’autres études sont nécessaires pour étudier les rôles fonctionnels que jouent de nombreux embranchements et genres décrits dans la fermentation du vin.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Le financement de la subvention du Conseil de recherche de l’Université d’État des Appalaches (URC) et de la bourse de voyage CAPES Print qui a soutenu la visite de la FAO à l’Université de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brésil, est vivement remercié. Cette étude a été financée en partie par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. L’ECPDM est reconnaissant de la bourse CAPES Print Travel qui a soutenu sa visite à l’Appalachian State University. L’ECPDM est chercheur associé 2 au Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
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