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Biology

मेटागेनोमिक एम्प्लिकॉन अनुक्रमण का उपयोग करके वाइन उत्पादन के दौरान किण्वन ट्रैमिनेट अंगूर के जीवाणु समुदाय की रूपरेखा

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65598
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

Summary

यहां, हम ट्रामिनेट अंगूर, किण्वन अंगूर और अंतिम शराब के जीवाणु समुदाय का निर्धारण करने के लिए एम्प्लिकॉन मेटागेनोमिक का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति और माइक्रोबियल समुदाय संरचनाओं को प्रोफाइल करने के लिए जैव सूचना विज्ञान उपकरणों के उपयोग के लिए अपेक्षाकृत आसान पहुंच ने अंगूर और शराब में खेती योग्य और गैर-संवर्धन योग्य रोगाणुओं दोनों की बेहतर समझ की सुविधा प्रदान की है। औद्योगिक किण्वन के दौरान, रोगाणुओं, ज्ञात और अज्ञात, अक्सर उत्पाद विकास और ऑफ-स्वाद के लिए जिम्मेदार होते हैं। इसलिए, अंगूर से शराब तक बैक्टीरिया की रूपरेखा स्वस्थानी माइक्रोबियल गतिशीलता में एक आसान समझ सक्षम कर सकती है। इस अध्ययन में, ट्रामिनेट अंगूर के बैक्टीरिया को किण्वन से गुजरना होगा, और अंतिम शराब डीएनए निष्कर्षण के अधीन थी जो 15 एनजी / माइक्रोन से 87 एनजी / माइक्रोन उत्पन्न करती थी। V4 क्षेत्र के हाइपरवेरिएबल क्षेत्र के 16S एम्प्लिकॉन को अनुक्रमित किया गया था, अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में बैक्टीरिया जिसमें फ़ाइला प्रोटियोबैक्टीरिया, एक्टिनोबैक्टीरियोटा, फर्मिक्यूट्स, बैक्टेरॉयडोटा, फ्यूसोबैक्टीरियोटा शामिल थे और इसके बाद वेरुकोमाइक्रोबायोटा, हेलोबैक्टेरोटा, डेसल्फोबैक्टेरोटा, मायक्सोकोकोटा और एसिडोबैक्टीरियोटा थे। साझा अद्वितीय परिचालन वर्गीकरण इकाइयों (ओटीयू) के एक वेन आरेख विश्लेषण से पता चला है कि 15 बैक्टीरिया फ़ाइला अंगूर मस्ट, किण्वन चरण और अंतिम शराब दोनों के लिए आम थे। फ़ाइला जो पहले रिपोर्ट नहीं की गई थी, 16S एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के साथ-साथ जेनेरा जैसे एंटरोबैक्टीरियासी और लैक्टोबैसिलेसी का उपयोग करके पता लगाया गया था। शराब में कार्बनिक पोषक तत्वों के उपयोग में भिन्नता और बैक्टीरिया पर इसके प्रभाव का परीक्षण किया गया था; Traminette R टैंक जिसमें Fermaid O और Traminette L होता है, जो स्टिमुला सॉविनन ब्लैंक + Fermaid O. के साथ उत्तेजित होता है। क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके अल्फा विविधता ने समरूपता की डिग्री निर्धारित की। बीटा विविधता ने दो उपचारों के लिए किण्वन चरण में बैक्टीरिया में बदलाव का संकेत दिया, और अंतिम शराब बैक्टीरिया समान दिखे। अध्ययन ने पुष्टि की कि वाइन उत्पादन के दौरान अंगूर बैक्टीरिया की गुणवत्ता और बेहतर उपयोग का समर्थन करने के लिए वाइन उत्पादन के दौरान बैक्टीरिया परिवर्तन की निगरानी के लिए 16S एम्प्लिकॉन अनुक्रमण का उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

Traminette अंगूर बेहतर शराब की गुणवत्ता के उत्पादन की विशेषता है, प्रशंसनीय उपज और कई फंगल संक्रमण 1,2,3 के लिए आंशिक प्रतिरोध के अलावा. अंगूर की प्राकृतिक किण्वन संबद्ध सूक्ष्मजीवों, शराब उत्पादन पर्यावरण, और किण्वन वाहिकाओं 4,5 पर निर्भर करता है. अक्सर, कई वाइनरी किण्वन, शराब के उत्पादन, एस्टर, सुगंध और स्वाद विकास के लिए जंगली खमीर और बैक्टीरिया पर भरोसा करतेहैं।

इस अध्ययन का लक्ष्य अंगूर की जीवाणु संरचना की जांच करना और किण्वन के दौरान उनकी गतिशीलता की निगरानी करना है। हालांकि, प्राथमिक किण्वन के लिए Saccharomyces cerevisiae के रूप में स्टार्टर संस्कृतियों के आधुनिक उपयोग, जहां शराब का उत्पादन किया जाता है, विभिन्न शराबशैलियों 7 के लिए आम है. इसके अलावा, माध्यमिक किण्वन, जहां मैलिक एसिड को ओनोकोकस ओनी द्वारा लैक्टिक एसिड में डीकार्बोक्सिलेट किया जाता है, शराब के ऑर्गेनोलेप्टिक और स्वाद प्रोफ़ाइल में सुधार करता है और शराब की अम्लता को कम करताहै 8,9. संस्कृति-स्वतंत्र तरीकों के उपयोग में हालिया प्रगति के साथ, अब वाइन अंगूर से जुड़े विभिन्न रोगाणुओं और प्रजातियों को निर्धारित करना संभव है जिन्हें अंतिम उत्पाद10 तक अलग-अलग समय पर किण्वन में स्थानांतरित किया जाता है।

वाइन किण्वन के दौरान आवश्यक रूप से स्थानांतरित किए गए विभिन्न अंगूरों से जंगली बैक्टीरिया की भूमिकाएं और गतिशीलता खराब समझी जाती हैं। इनमें से कई जीवाणुओं का वर्गीकरण भी ज्ञात नहीं है, या उनके फेनोटाइपिक गुण अनियंत्रित हैं। यह सहसंस्कृति किण्वन में उनके आवेदन को अभी भी खराब रूप से कम उपयोग करता है। हालांकि, अंगूर और शराब10 के साथ जुड़े जीवाणु आबादी निर्धारित करने के लिए सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृति आधारित विश्लेषण का इस्तेमाल किया गया है. यह व्यापक रूप से ज्ञात है कि चयनात्मक संस्कृति चढ़ाना थकाऊ है, संदूषण के लिए प्रवण है, कम प्रजनन क्षमता है, और उत्पादन संदिग्ध हो सकता है; यह बैक्टीरिया की प्रजातियों को भी याद करता है जिनकी विकास आवश्यकताएं अज्ञात हैं। पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि संस्कृति-स्वतंत्र, 16 एस आरआरएनए जीन-आधारित पद्धतियां जटिल माइक्रोबियल समुदायों11 को चिह्नित करने के लिए अधिक भरोसेमंद और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करती हैं। उदाहरण के लिए, 16S आरआरएनए जीन के हाइपरवेरिएबल क्षेत्रों को अनुक्रमित करने को अंगूर के पत्तों, जामुन और शराब 12,13,14में बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। अध्ययनों से पता चला है कि या तो 16 एस आरआरएनए मेटाबारकोडिंग या पूरे मेटागेनोमिक अनुक्रमण का उपयोग माइक्रोबायोम अध्ययन15 के लिए उपयुक्त है। शराब उत्पादन के दौरान उनके चयापचय विशेषताओं के लिए जीवाणु विविधता के संभावित संबंध के बारे में उभरती हुई जानकारी है, जो ओनोलॉजिकल गुणों और टेरोइर16 के निर्धारण में मदद कर सकती है।

अंगूर और शराब माइक्रोबियल पारिस्थितिकी का अध्ययन करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) का उपयोग कर metagenomic उपकरणों के फायदे को अधिकतम करने की जरूरत16,17 पर जोर दिया गया है. इसके अलावा, खाद्य और किण्वन पारिस्थितिकी तंत्र की प्रोफाइल माइक्रोबियल विविधता के लिए उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के आधार पर संस्कृति-स्वतंत्र तरीकों का उपयोग कई प्रयोगशालाओं के लिए बहुत प्रासंगिक और मूल्यवान हो गया है औरऔद्योगिक उपयोग 18,19के लिए अनुशंसित है। यह वर्तमान माइक्रोबियल आबादी का पता लगाने और वर्गीकरण रूपरेखा और पर्यावरण रोगाणुओं, उनके सापेक्ष बहुतायत, और अल्फा और बीटा विविधता20 के योगदान का एक लाभ प्रदान करता है. 16S क्षेत्र के चर क्षेत्र का अनुक्रमण पसंद का एक महत्वपूर्ण जीन बन गया है और इसका उपयोग विभिन्न माइक्रोबियल पारिस्थितिक अध्ययनों के दौरान किया गया है।

जबकि कई अध्ययन कवक पर ध्यान केंद्रित, विशेष रूप से खमीर, शराब किण्वन21 के दौरान, इस अध्ययन 16S amplicon अनुक्रमण और जैव सूचना उपकरण शराब उत्पादन के लिए Traminette अंगूर किण्वन के दौरान बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की सूचना दी.

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Protocol

1. प्रायोगिक शराब उत्पादन

  1. जोन्सविले, उत्तरी कैरोलिना दाख की बारी में डायनामिस एस्टेट वाइन से ट्रामिनेट अंगूर प्राप्त करें, और दो अलग-अलग 600 एल ओपन-टॉप किण्वकों में जारी करने के लिए क्रश करें और ढक्कन के साथ लगभग 4 दिनों के लिए खाल पर छोड़ दें।
  2. खाल को गीला रखने और वाष्पशील एसिड (वीए) उत्पादन को सीमित करने के लिए दिन में एक बार कैप को नीचे पंच करें।
    नोट: विचार यह है कि बहुत सारे सुगंधित अग्रदूत (मोनोटरपेन) खाल में स्थित होते हैं और शराब की सुगंधित क्षमता को बढ़ाने के लिए रस को त्वचा के संपर्क में छोड़ देते हैं।
  3. 4 दिनों के बाद, पिच Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). इस खमीर को चुना गया था क्योंकि यह एक मजबूत किण्वक है और अंगूर से शराब में वैरिएटल चरित्र को बढ़ाने के साथ जुड़ा हुआ है।
  4. एक टैंक में, Traminette R, 20 g/hL Fermaid O जोड़ें जब ब्रिक्स 17.7 और 20 g/hL Fermaid O और 12.5 g/hL Fermaid K पर 13.1 g/hL पर किण्वन सुरक्षा प्राप्त करने के लिए, जबकि दूसरा टैंक Traminette L, 40 g/hL स्टिमुला सॉविनन ब्लैंक जोड़ें जब ब्रिक्स 17.1 पर हो। वाइन के वैरिएटल चरित्र को बढ़ाने के लिए ब्रिक्स 13.4 पर होने पर 20 ग्राम/एचएल फर्मेड ओ भी जोड़ें।
  5. मस्ट (दिन 1), खमीर जोड़ा (दिन 4), किण्वित होना चाहिए (दिन 15), और समाप्त शराब के नमूने (दिन 30) के डुप्लिकेट नमूने लें और डीएनए निष्कर्षण और मेटागेनोमिक विश्लेषण से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

2. मेटागेनोमिक्स के लिए डीएनए निष्कर्षण

  1. पहले centrifugation जब तक बर्फ पर ऊपर प्राप्त सभी डुप्लिकेट नमूने रखें.
  2. एक बाँझ 50 एमएल पेंच टोपी ट्यूब में किण्वित नमूने के 20 एमएल स्थानांतरण.
  3. ठंडे पानी के 10 एमएल जोड़ें और homogenize (भंवर). 4 डिग्री सेल्सियस पर 800 x ग्राम पर 1 मिन के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: यह कदम नमूने के ठोस पदार्थों को हटा देगा।
  4. चरण 2.3 को दो बार दोहराएं और सुपरनेटेंट को एक ही ट्यूब में पूल करें।
  5. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला सुपरनेंट। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  6. पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, 2 एमएल स्क्रू-कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 2 मिन के लिए 14,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। पीबीएस का उपयोग कर दो और washes प्रदर्शन.
  7. इस चरण में, -20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों को फ्रीज करें या चरण 2.8 का पालन करें। यह महत्वपूर्ण है कि सभी नमूनों का इलाज उसी तरह किया जाए।
  8. सोडियम फॉस्फेट बफर के 978 माइक्रोन जोड़ें। सोडियम फॉस्फेट बफर तैयार करें, NaH2PO4· एच2ओ और ना2एचपीओ4 (निर्जल) के 10.9 ग्राम आसुत एच2ओ को 1 एल की मात्रा बनाने के लिए, और पीएच को 7.4 पर समायोजित करें।
  9. डीएनए बफर (डीएनए स्पिन किट) और भंवर के 122 माइक्रोन जोड़ें।
  10. इसे रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में 45 मिनट-1 घंटे के लिए खड़े होने दें। भंवर हर 15 मिनट में नमूने। यह कदम रातोंरात (ओ / एन) या डीएनए स्पिन किट का उपयोग जारी रखने के लिए तैयार होने तक छोड़ा जा सकता है।
  11. एक Lysis समाधान 1 ट्यूब (डीएनए स्पिन किट) में नमूना के 1 एमएल स्थानांतरण और टोपी कस (ट्यूब के पक्ष में और टोपी पर नहीं पर नमूना संख्या लिखें; किट अभिकर्मकों टोपी पर लिखा कुछ भी हटा देंगे).
  12. एक मनका पिटाई चक्की (6.5 मीटर / एस, सीवाई: 24 एक्स 2) में नमूना 60 एस तीन बार के लिए समरूप करें। यदि मनका-पिटाई की चक्की में बर्फ डालने का उपकरण है, तो ट्यूबों के नीचे 50 ग्राम सूखी बर्फ डालें। यदि नहीं, प्रत्येक homogenization कदम के बीच 5 मिनट के लिए गीला बर्फ पर नमूने रखें.
  13. अपकेंद्रित्र Lysing मैट्रिक्स ई ट्यूब (डीएनए स्पिन किट) 16800 x ग्राम (या अधिकतम गति) पर 1 मिनट के लिए.
  14. सतह पर तैरनेवाला एक साफ माइक्रोट्यूब में स्थानांतरण. इसके बाद, प्रोटीन वर्षा समाधान (पीपीएस) अभिकर्मक (डीएनए स्पिन किट) के 250 माइक्रोन जोड़ें और ट्यूब को 10 बार हाथ से हिलाकर मिलाएं।
  15. अवक्षेप को गोली देने के लिए 16800 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र।
  16. सतह पर तैरनेवाला एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण. सतह पर तैरनेवाला करने के लिए बाध्यकारी मैट्रिक्स निलंबन (डीएनए स्पिन किट) के 1 एमएल जोड़ें.
    नोट: उपयोग करने से पहले बाध्यकारी मैट्रिक्स निलंबन को फिर से निलंबित करें जब तक कि यह सजातीय न हो।
  17. 2 मिनट के लिए हाथ से ट्यूबों पलटना, तो ट्यूबों (सिलिका मैट्रिक्स के बसने की अनुमति देने के लिए) 3 मिनट के लिए एक रैक में खड़े हो जाओ.
  18. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के 1 एमएल हटा दें. शेष सतह पर तैरनेवाला में मैट्रिक्स को फिर से निलंबित करें।
  19. एक स्पिन फिल्टर ट्यूब (डीएनए स्पिन किट) में मिश्रण के 600 माइक्रोन और 14500 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र स्थानांतरण।
  20. बचा हुआ मिश्रण और अपकेंद्रित्र डालें।
  21. छानना प्रवाह के माध्यम से और स्पिन फिल्टर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में धोने समाधान (डीएनए स्पिन किट) के 500 माइक्रोन जोड़ने के लिए 14500 x ग्राम पर 1 मिनट (समाधान धोने के लिए EtOH जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें; उत्पाद पुस्तिका देखें). फ्लो-थ्रू को छान लें और वॉश को दो बार दोहराएं (कुल 3 वॉश)।
  22. अवशिष्ट धोने के समाधान के मैट्रिक्स को सुखाने के लिए 14,500 x ग्राम पर अतिरिक्त 2 मिनट के लिए प्रवाह-थ्रू और अपकेंद्रित्र को छान लें।
  23. स्पिन फिल्टर निकालें और यह एक ताजा पकड़ ट्यूब (डीएनए स्पिन किट) में जगह है. हवा कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए स्पिन फिल्टर सूखी.
  24. 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए मुक्त पानी (डीएनए स्पिन किट) गर्म. डीएनए मुक्त पानी के 50 माइक्रोन जोड़ें और धीरे डीएनए के कुशल क्षालन के लिए एक विंदुक टिप के साथ फिल्टर झिल्ली पर मैट्रिक्स हलचल. नमूने 1 मिनट के लिए आरटी पर खड़े हो जाओ, तो डीएनए elute करने के लिए 14500 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  25. बर्फ पर नमूने रखें. एक जेल में नमूना मिश्रण (नमूना के 2 माइक्रोन + पानी के 2 माइक्रोन + लोडिंग बफर के 1 माइक्रोन) लोड करें। डीएनए एकाग्रता को मापें।
  26. नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  27. निकाले गए डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें।
    नोट: डीएनए की 1 माइक्रोन मात्रा गिरा दी गई और मात्रा निर्धारित की गई, और डीएनए की गुणवत्ता को ए 260/ए 280 अनुपात में नोट किया गया।

3. डीएनए वैद्युतकणसंचलन

  1. 0.5 ट्रिस/बोरेट/ईडीटीए (टीबीई) बफर (मिनी जेल के लिए 20 एमएल, मध्यम जेल के लिए 70-100 एमएल) में 1% अगारोज जेल तैयार करें। अगारोज + बफर का वजन करें, माइक्रोवेव में उबालकर अगारोज को पिघलाएं, तौलें और मूल वजन में डीएच2ओ जोड़ें। 55-60 डिग्री सेल्सियस के लिए agarose समाधान ठंडा और कंघी विधानसभा के साथ जेल पूर्व में डालना. जेल को जमने के लिए छोड़ दें।
  2. नमूना (10 माइक्रोन) में 10x जेल लोडिंग बफर का 1 माइक्रोन जोड़ें और आणविक भार मार्कर के बगल में जेल पर लोड करें। नकारात्मक (काले) से सकारात्मक (लाल) तक 100-115 वी (बड़े जेल) या 90 वी (मिनी जेल) पर चलाएं जब तक कि नीली डाई नीचे के पास न हो।
  3. 1 माइक्रोन/एमएल एथिडियम ब्रोमाइड या एसवाईबीआर ग्रीन (नाइट्राइल दस्ताने और काले चश्मे की जरूरत) में 30 मिनट के लिए स्टेन जेल, पानी में कुल्ला, और एक पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश स्रोत के तहत देखें। डुप्लिकेट नमूनों से, आगे की प्रक्रिया के लिए उच्चतम उपज का चयन करें।

4. उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण

  1. विशिष्ट प्राइमरों 515F (5 '-GTGYCAGCMGCCGGGTAA-3') और 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22का उपयोग करके 16S rRNA जीन के V4 हाइपरवेरिएबल क्षेत्र को बढ़ाएं। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) की स्थिति को 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 20 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 20 एस के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, और 10 मिनट (अंतिम विस्तार) के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. एक उच्च निष्ठा पीसीआर मास्टर मिश्रण (सामग्री की तालिका) के साथ पीसीआर प्रतिक्रियाओं बाहर ले जाना.
  3. डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट के साथ पुस्तकालयों उत्पन्न करें और फिर एक अनुक्रमण मंच पर युग्मित अंत अनुक्रमण का उपयोग कर अनुक्रम.
    नोट: यहां, एनईबीनेक्स्ट अल्ट्रा II डीएनए लाइब्रेरी प्रेप किट के साथ उत्पन्न पुस्तकालयों को नोवासेक 6000 प्लेटफॉर्म पर युग्मित-अंत इलुमिना अनुक्रमण (2 × 250 बीपी) का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया था।
  4. अनुक्रमण चरणों का पालन करें:
    1. चरण 1: एक एंजाइम के साथ डीएनए कतरनी, आमतौर पर एक विधि द्वारा जो एक सामान्य आकार के लिए चयन करता है।
      1. अनुक्रमण बफर के 3.5 माइक्रोन और एंजाइम मिश्रण के 1.5 माइक्रोन को डीएनए के 25 माइक्रोन (सीए 1 माइक्रोग्राम) में जोड़ें, एक विंदुक के साथ 10 बार मिलाएं और जल्दी से स्पिन करें।
      2. निम्नलिखित स्थितियों के साथ एक थर्मोसाइक्लर में रखें: ढक्कन को 75 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें, (1) 20 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट (2) 65 डिग्री सेल्सियस (3) के लिए 30 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    2. चरण 2: बंधाव के माध्यम से एडेप्टर जोड़ें
      1. लिगेशन मास्टर मिक्स के 15 माइक्रोन, एडाप्टर के 1.25 माइक्रोन, लिगेशन बढ़ाने के 0.5 माइक्रोन, और एक विंदुक के साथ अंत प्रस्तुत करने का डीएनए मिश्रण के 30 माइक्रोन जोड़ें।
      2. थर्मोसाइक्लर में 15 मिन के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर कुल 48.26 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए लिगेशन मिक्स में 1.5 माइक्रोन-विशिष्ट छांटना अभिकर्मक (यूएसईआर) एंजाइम जोड़ें।
      3. एडाप्टर बंधाव डीएनए के लिए चुंबकीय मोती के 43.5 माइक्रोन जोड़ें, एक विंदुक के साथ 20 बार मिश्रण, और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। एक चुंबकीय रैक के साथ मोती अलग करें, फिर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      4. 80% इथेनॉल के 100 माइक्रोन के साथ गोली धो लें, 30 एस के लिए सूखी, और फिर से धो लें। 10 एमएम ट्रिस एचसीएल / 0.1x ट्रिस-ईडीटीए (टीई) / एचपीएलसीएच 20 के 8.5 माइक्रोन में मोती और गोली, एक विंदुक के साथ मिश्रण और 2 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
      5. चुंबकीय रैक में इनक्यूबेट करें और सतह पर तैरनेवाला के रूप में एल्यूटेड डीएनए के 7.5 माइक्रोन को हटा दें। एल्यूट को एक नई ट्यूब में रखें और पीसीआर स्टेप करें।
      6. सबसे पहले, पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के 25 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए मास्टर मिक्स के 12.5 माइक्रोन, इंडेक्स प्राइमर आई 7 प्राइमर के 2.5 माइक्रोन, और सार्वभौमिक पीसीआर प्राइमर / आई 5 प्राइमर के 2.5 माइक्रोन को 7.5 माइक्रोन एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए में जोड़ें। निम्नलिखित पीसीआर स्थिति का उपयोग करें: ढक्कन को 103 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें। 30 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 75 एस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 10 चक्रों के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
      7. 25 माइक्रोन प्रवर्धित डीएनए को साफ करें। चुंबकीय मोतियों के 22.5 माइक्रोन जोड़ें और 20 बार मिलाएं। 5 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें और सतह पर तैरनेवाला के 50 माइक्रोन को हटा दें। 80% इथेनॉल के 100 माइक्रोन के साथ मोती धो लें, और 30 एस के लिए धीरे से मोती सूखने से सभी इथेनॉल को हटा दें।
      8. पानी के 16 माइक्रोन में गहरे भूरे रंग के मोतियों को फिर से निलंबित करें, एक विंदुक के साथ 20 बार मिलाएं, और चुंबकीय रैक में 30-60 एस के लिए रखें। 15 माइक्रोन को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      9. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करें। बफर के 90 माइक्रोन + 1 माइक्रोन डाई + डीएनए लाइब्रेरी नमूने के 2 माइक्रोन मिलाएं, और एकाग्रता पढ़ें। डीएनए को 2 एनएम तक पतला करें, प्रवाह सेल में 27-30 माइक्रोन लोड करें, और इसे सीक्वेंसर में रखें।
    3. चरण 3: एडेप्टर अनुक्रम, पैटर्न प्रवाह सेल के मैट्रिक्स के लिए ऊपर उत्पन्न पुस्तकालयों संकर, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए पर कब्जा. इसे दूसरे संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करें।
      1. फिर, दूसरे स्ट्रैंड को क्लोनल क्लस्टर में बढ़ाएं। क्लस्टर को रैखिक करें और सक्रिय साइटों को ब्लॉक करें। manuacturer के प्रोटोकॉल के अनुसार अनुक्रम में संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण के लिए एक साइट प्रदान करने के लिए अनुक्रमण प्राइमर जोड़ें.
        नोट: रासायनिक रूप से, संशोधित न्यूक्लियोटाइड प्राकृतिक पूरकता का उपयोग करके डीएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड से बंधते हैं। प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड में एक फ्लोरोसेंट टैग और एक प्रतिवर्ती टर्मिनेटर होता है जो अगले आधार को शामिल करने को अवरुद्ध करता है। इसलिए, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल की उपस्थिति इंगित करती है कि कौन सा न्यूक्लियोटाइड डाला गया है, और टर्मिनेटर को बांधने के लिए अगले आधार के लिए क्लीव किया जाता है।
    4. चरण 4: संश्लेषण द्वारा अग्रानुक्रम में अनुक्रमित अनुक्रमित अनुक्रमों के समूहों को देने के लिए एकल-बाध्य स्ट्रैंड को बढ़ाएं।
      नोट: क्लस्टर द्विदिश स्कैनिंग और दो-चैनल अनुक्रमण रसायन विज्ञान के माध्यम से एकल स्ट्रैंड की तुलना में एक उज्जवल संकेत देते हैं। अनुक्रमण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से बेस कॉल (*.cbcl) फ़ाइलों को डेटा विश्लेषण के लिए निर्दिष्ट आउटपुट फ़ोल्डर स्थान पर स्थानांतरित करता है।

5. जैव सूचना विज्ञान

  1. अनुक्रम डेटा को FASTQ फ़ाइलों के रूप में उत्पन्न करें। निम्नलिखित भागों को शामिल करने के लिए विश्लेषण करें।
    1. भाग I:
      1. सीक्वेंसर से प्राप्त FASTQ फ़ाइलों को सहेजें, स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलने के लिए क्लिक करें, और मैपिंग/मेटाडेटा फ़ाइलें बनाएँ।
      2. Nephele वेबसाइट खोलें (https://nephele.niaid.nih.gov/), FASTQ फ़ाइलें अपलोड करें, QIIME222 में QC, फ़िल्टरिंग और ट्रिमिंग पढ़ें। कच्चे अनुक्रमों को अनुक्रम पठन संग्रह (एसआरए) और जेनबैंक के रूप में एनसीबीआई बायोप्रोजेक्ट (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/) में जमा करें
    2. भाग II: नेफ़ेले वेबसाइट (https://nephele.niaid.nih.gov/) पर जाएं, डीमल्टीप्लेक्स पेयर-एंड रीड, फ़िल्टर प्रतिस्थापन और चिमेरा त्रुटियाँ करें, और DADA223 का उपयोग करके मर्ज करें। 97% समानता24 पर बैक्टीरियल टैक्सोनोमिक असाइनमेंट करने के लिए सिल्वा संस्करण 132 99% ओटीयू डेटाबेस पर प्रशिक्षित Naive Bayes क्लासिफायरियर का उपयोग करें।
    3. भाग III: माइक्रोबायोमडीबी वेबसाइट खोलें, फाइल अपलोड करने के लिए क्लिक करें, और ओटीयू अल्फा-विविधता, बीटा-विविधता, सापेक्ष बहुतायत और दुर्लभ घटता (https://microbiomedb.org/mbio/app) उत्पन्न करें।
    4. भाग IV: एक स्प्रेडशीट खोलें और हीटमैप, वेन आरेख और रैखिक भेदभावपूर्ण विश्लेषण प्रभाव आकार (https://microbiomedb.org/mbio/app) बनाने के लिए डेटा स्थानांतरित करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. QIIME222 खोलें, और अल्फा-समूह-महत्व स्क्रिप्ट का उपयोग करके समूहों के बीच अल्फा विविधता में महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करें। यह क्रुस्कल-वालिस परीक्षण भी करेगा।
  2. PERMANOVA का उपयोग करके समूहों के बीच बीटा विविधता में अंतर का निर्धारण, एक जोड़ीवार परीक्षण25 सहित.
  3. माइक्रोबायोमडीबी का उपयोग करने वाले समूहों के बीच जीवाणु समुदाय संरचना में महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त करें। एक पी-मान ≤0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

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Representative Results

अंगूर से निकाले गए डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता, किण्वन शराब, और अंतिम शराब पहले निर्धारित की गई थी; मात्रा मान 15-87 एनजी/μL (तालिका 1) से होता है।

अनुक्रमण और जैव सूचना विज्ञान
इलुमिना उच्च थ्रूपुट सीक्वेंसर ने एक FASTQ फ़ाइल उत्पन्न की जिसे नेफ़ेले में आयात किया गया था और QIIME 2 प्लेटफ़ॉर्म26 पर देखा गया था। सबसे पहले, अनुक्रम गुणवत्ता की जांच के लिए FastQC सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। फिर, इसे 5'- और 3'- दोनों सिरों पर छंटनी की गई थी, खराब गुणवत्ता वाले न्यूक्लियोटाइड्स को खत्म करने के लिए, DADA2 denoiser23 का उपयोग करके OTUs (एक प्रजाति के लिए परिचालन परिभाषा) में क्लस्टरिंग से पहले काइमेरिक अनुक्रमों को समाप्त किया गया था। उन्हें सिल्वा v138.1 डेटाबेस का उपयोग करके बैक्टीरियल टैक्सा में मैप किया गया था। अनुक्रमों को 99% न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम समानता के आधार पर ओटीयू में क्लस्टर किया गया था। चित्र 1 OTUs के लिए DADA2 दुर्लभता घटता दिखाता है; यह एक पठार पर पहुंच गया। इससे संकेत मिलता है कि माइक्रोबियल विविधता के बहुमत को इंगित करने के लिए पर्याप्त अनुक्रम कवर किए गए थे। अनुक्रमों के प्रतिकृति विश्लेषण ने कोई महत्वपूर्ण अंतर उत्पन्न नहीं किया।

अंगूर से शराब के लिए विभिन्न शासनों में बैक्टीरिया के सापेक्ष बहुतायत के आधार पर हीटमैप चित्रा 2 में दिखाया गया है। लाल रंग में इंगित सबसे प्रमुख फ़ाइला में प्रोटियोबैक्टीरिया, एक्टिनोबैक्टीरियोटा, फर्मिक्यूट्स, बैक्टेरॉयडोटा, फ्यूसोबैक्टीरियोटा शामिल हैं, और, इसके बाद वेरुकोमाइक्रोबायोटा, हेलोबैक्टेरोटा, डेसल्फोबैक्टेरोटा, मायक्सोकोकोटा और एसिडोबैक्टीरियोटा शामिल हैं। कम से कम प्रचुर मात्रा में बैक्टीरिया नीले रंग में संकेत दिए गए थे। इनमें से कई समूह मस्ट में मौजूद थे, जब खमीर जोड़ा गया था, लेकिन किण्वन के दौरान अनुपस्थित थे, विशेष रूप से नाइट्रोस्पिरोटा, बेडेलोविब्रियोनोटा, नाइट्रोस्पिनोटा, आर्माटिमोनाडोटा, जेमैटिमोनाडोटा, क्लोरोफ्लेक्सी, कैंपिलोबैक्टेरोटा, डाइनोकोकोटा, पेटेसिबैक्टीरिया, प्लैक्टोमाइसेटोटा, एब्डिटिबैक्टीरियोटा, क्रेनारचायोटा, स्पाइरोचेटोटा, डिपेंडेंटिया, थर्मोटोगोटा, मिथाइलोमिरबिलोटा और एलुसिमाइक्रोबायोटा। सापेक्ष बहुतायत भी जीनस स्तर पर निर्धारित किया गया था, और परिणामों ने महत्वपूर्ण जेनेरा जैसे एंटरोबैक्टीरिया और लैक्टोबैसिलेसी का संकेत दिया, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। साझा अद्वितीय ओटीयू के एक वेन आरेख विश्लेषण से पता चला कि वाइन अंगूर से अंतिम शराब (चित्रा 4) तक 15 बैक्टीरिया मौजूद थे। V4 चर क्षेत्र पर आधारित एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के परिणामों ने दो Traminette R और L. में अल्फा विविधता का भी संकेत दिया। चित्रा 4 प्रजातियों की समरूपता को वितरण के निशान के रूप में दिखाता है, जो दो पोषण संबंधी उपचारों के बीच अलग है। आंकड़ों से पता चला है कि स्टिमुला सॉविनन ब्लैंक + फर्मेड ओ में विविधता बदलाव 13.4 ब्रिक्स पर 1 से कम था, और समरूपता शून्य तक पहुंच जाती है क्योंकि सापेक्ष बहुतायत अलग-अलग होती है। बीटा विविधता के लिए डेटा का भी विश्लेषण किया गया था; चित्रा 5 दो किण्वन Traminette आर और एल के बीच अंतर से पता चलता है; बैक्टीरिया जरूरी और खमीर वर्धित चरणों में समान थे। दो उपचारों के लिए किण्वन चरण में बैक्टीरिया में एक बदलाव था, और यह अंतिम शराब (चित्रा 6) में समान दिखता है।

Figure 1
चित्र 1: देखे गए ओटीयू के दुर्लभ भूखंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सापेक्ष बहुतायत हीटमैप। फाइलम स्तर आर और एल पर सापेक्ष बहुतायत का हीटमैप काफी अलग नहीं था (पी ≤0.05)। लीजेंड बार मुख्य स्कोर को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: शीर्ष दस टैक्सा की सापेक्ष बहुतायत। विलकॉक्सन रैंक योग परीक्षण (पी ≤0.05) के साथ मीडिया द्वारा रैंक किए गए शीर्ष दस टैक्सा के जीनस स्तर पर सापेक्ष बहुतायत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वेन आरेख। मस्ट, खमीर जोड़ा, किण्वन और शराब के बीच अद्वितीय और साझा बैक्टीरिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ट्रामिनेट आर और ट्रैमिनेट एल की अल्फा विविधता। क्रुस्कल-वालिस परीक्षण के विश्लेषण के आधार पर दो पोषण संबंधी फर्मेड ओ और स्टिमुला सॉविनन ब्लैंक और फेमेड ओ (डन > 0.05) के शैनन के एच इंडेक्स की अल्फा विविधता। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रिंसिपल घटक विश्लेषण। वाइन उत्पादन के विभिन्न चरणों में दो पोषण फर्मेड ओ और स्टिमुला सॉविनन ब्लैंक और फेमेड ओ के ब्रे-कर्टिस के आधार पर बीटा विविधता के 16 एस आरआरएनए डेटा का प्रमुख घटक विश्लेषण। नीला वृत्त आवश्यक और खमीर जोड़ चरणों के एक समूह का प्रतिनिधित्व करता है। लाल वृत्त अंतिम शराब को इंगित करता है और काला वृत्त दो उपचारों में किण्वन चरण है। एक्सिस 1 और 2 विविधताएं हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूनाकरण दिनांक नमूना ए260/ए280 एकाग्रता ng/μL Traminette R ए260/ए280 एकाग्रता ng/μL Traminette L
8/30/21 अंगूर 1.762 37 1.75 28
8/31/31 अनिवार्य 1.769 23 1.818 20
09-02-2021 विश्राम 1.667 15 -1 1
09-04-2021 खमीर जोड़ा गया 2.185 59 1.968 61
09-06-2021 किण्वन 2.023 87 2.048 43
09-09-2021 किण्वन 3.4 17 2.048 43
9/14/21 अंतिम शराब 2.143 30 2.042 49

तालिका 1: अंगूर से निकाले गए डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता, किण्वन शराब, और अंतिम शराब।

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Discussion

मेटागेनोमिक्स का प्रोटोकॉल अंगूर के नमूने से शुरू होता है, और जब खमीर को अवश्य जोड़ा जाता है, तो किण्वन शराब और अंतिम शराब के नमूने। इसके बाद डुप्लिकेट डीएनए निष्कर्षण किया गया था जिसे इन नमूनों से सफलतापूर्वक निकाला गया था। प्राप्त मात्रा 15 ng/μL से 87 ng/μL तक सांद्रता में भिन्न होती है। इससे पता चलता है कि डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल शराब के मेटागेनोमिक अध्ययन के लिए प्रभावी है। हालांकि A260/A280 पर डीएनए की गुणवत्ता भिन्न होती है, इसके लिए विभिन्न मापदंडों को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो निष्कर्षण को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि अल्कोहल एकाग्रता और अन्य किण्वन चयापचयों जो किण्वन के दौरान और बाद में विकसित हुए, साथ ही अन्य कार्बनिक पौधे सामग्री जो जीनोम निष्कर्षण को रोक सकती हैं। पिछले अध्ययनों metagenomic संयंत्र सामग्री27 पर एक समान अवलोकन की सूचना दी है. हालांकि, वर्णित प्रोटोकॉल में निकाले गए डीएनए ने एक मात्रा हासिल की जो विश्लेषण के अगले चरण के लिए पर्याप्त थी। मेटागेनोमिक अध्ययन के लिए आवश्यक पीसीआर बारकोडिंग, विशेष रूप से इलुमिना अनुक्रमण मंच का उपयोग करते हुए, न्यूनतम डीएनए मात्रा 1 एनजी / एल पर सेट करने की आवश्यकता है। V4 क्षेत्र को अनुक्रमित किया गया था, और जीवाणु विविधता के निर्धारण के लिए 16S rRNA जीन अनुक्रमण के उपयोग की आवश्यकता होती है; इस जीन V1-V923 से अलग चर क्षेत्रों है. विभिन्न नमूनों से निकाले गए डीएनए से कुल 6,393,443 युग्मित-अंत अनुक्रम 399590.1875 ± 138442.6148 के औसत के साथ पढ़ता है। V4 का आमतौर पर उपयोग किया गया है, और इसे जीन के हाइपरवेरिएबल क्षेत्र के रूप में जाना जाता है जो बैक्टीरियल टैक्सोनोमिक और विविधता विश्लेषण के लिए अच्छा है। अनुक्रमण के दौरान, युग्मित इलुमिना अनुक्रमण सीए 200-300 बीपी अनुक्रम उत्पन्न किए गए थे। वहाँ अलग प्लेटफार्मों अनुक्रमण डीएनए खाद्य और किण्वित पेय पदार्थों से निकाले28 के लिए इस्तेमाल किया जाता है. इलुमिना प्लेटफॉर्म का उपयोग करने के कारण निम्नलिखित हैं: (1) इलुमिना उत्कृष्ट आउटपुट के साथ दूसरी दूसरी पीढ़ी का अनुक्रमण मंच है, और इसकी रसायन विज्ञान कम त्रुटि दर और प्रोफ़ाइल देता है। यह पुस्तकालय प्रस्तुत करने के लिए उपलब्ध वाणिज्यिक किटों की तुलना में भी सस्ती है, और इसके अपेक्षाकृत कम पढ़ने अंतर अभिव्यक्ति के लिए आदर्श हैं। प्रोटोकॉल का अंतिम चरण जैव सूचना विज्ञान था, जो माइक्रोबियल विविधता के निर्धारण के लिए एम्प्लिकॉन 16 अनुक्रमण के उपयोग का एक महत्वपूर्ण घटक था। प्राप्त अनुक्रमों FASTQ फ़ाइल की गुणवत्ता जांच बहुत अच्छी थी, और QIIME से प्राप्त OTUs के परिणामस्वरूप सापेक्ष बहुतायत, अल्फा और बीटा विविधता के परिणामों में दिखाया गया एक वर्गीकरण विश्लेषण हुआ।

अगली पीढ़ी का अनुक्रमण (एनजीएस) विभिन्न किण्वन माइक्रोबियल समुदायों के बैक्टीरिया की रूपरेखा के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है। इस अध्ययन में, 16S एम्प्लिकॉन वर्गीकरण पहले फाइलम स्तर पर किया गया था, और अंगूर शराब किण्वन के दौरान पहले की तुलना में बैक्टीरिया का एक अधिक विविध समूह12 की तुलना में देखा गया था; 15 फ़ाइला भी साझा किए गए थे, जैसा कि वेन परिणाम के विश्लेषण से संकेत मिलता है। इसके अलावा, जीनस स्तर पर विश्लेषण ने महत्वपूर्ण जेनेरा की उपस्थिति दिखाई, जैसे कि एंटरोबैक्टीरियासी और लैक्टोबैसिलेसी जो ट्रैमिनेट आर टैंक में अधिक प्रचुर मात्रा में थे। हमने अपने विश्लेषण को जीनस-स्तरीय वर्गीकरण तक सीमित कर दिया; ऐसे अध्ययन हैं जहां विधि का उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन नमूना अनुमान23 के माध्यम से प्रजाति-स्तरीय वर्गीकरण में पहचान के लिए किया गया है। एम्प्लिकॉन अनुक्रमण की सीमाओं में से एक यह है कि अनुक्रम डेटा 16S rRNA अनुक्रम की छोटी लंबाई के कारण तनाव-स्तर वर्गीकरण निर्धारित नहीं कर सकता है। एक और सीमा क्लोरोप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगाना है। यह वांछनीय होगा यदि जैव सूचना प्रक्रिया का उपयोग इन अनुक्रमों को खत्म करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि वे अंगूर के पौधों के संदूषक हैं। हालांकि, क्लोरोप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रिया संदूषण को अधिकतम करने के लिए पीएनए-डीएनए क्लैंप का उपयोग करने वाला प्रवर्धन प्रोटोकॉल29. अंगूर में फर्मिक्यूट की उच्च बहुतायत, किण्वन और अंतिम शराब के दौरान, वाइन अंगूर30 पर पिछले अध्ययनों से सहमत होनी चाहिए। अल्फा विविधता विश्लेषण के परिणामों ने प्रत्येक किण्वन पोषण उपचार की बैक्टीरिया समरूपता का संकेत दिया; ऐसा प्रतीत होता है कि स्टिमुला सॉविनन ब्लैंक + फ़र्मेड ओ पोषक तत्व ने एक अधिक विविध जीवाणु उत्पन्न किया। इसके अलावा, बीटा विविधता डेटा ने किण्वन चरण में बैक्टीरिया में बदलाव दिखाया; गतिशील परिवर्तन इंगित करते हैं कि किण्वन चरण एक बहुत ही महत्वपूर्ण अवधि है जहां पोषण संबंधी परिवर्तन बैक्टीरिया के चयन को प्रभावित करते हैं। तकनीक अनुकूलित किया जा सकता है और किण्वन की निगरानी और गुणवत्ता और स्थिरता में सुधार करने के लिए उद्योगों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकताहै. हालांकि, वाइन किण्वन के दौरान माइक्रोबियल विविधता पर कार्बनिक पोषक तत्वों के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होगी।

यह अध्ययन बैक्टीरिया परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए 16S एम्प्लिकॉन बारकोड अनुक्रमण का उपयोग करके Traminette अंगूर और शराब के किण्वन के दौरान बैक्टीरिया विविधता की जांच करने वाला पहला है। इसने संघ और जीनस स्तरों पर बैक्टीरिया की विविधता की पुष्टि की। प्रोटियोबैक्टीरिया, इसके बाद फर्मिक्यूट्स, सबसे प्रचुर मात्रा में थे क्योंकि किण्वन अंतिम शराब में आगे बढ़ा। कई फ़ाइला जो पहले रिपोर्ट नहीं किए गए थे, 16S एम्प्लिकॉन अनुक्रमण का उपयोग करके पता लगाया गया था, और इससे पुष्टि हुई कि शराब उत्पादन की निगरानी के लिए विधि का उपयोग किया जा सकता है। अल्फा विविधता ने पोषण परिवर्तन की भूमिका दिखाई; इसने किण्वन बैक्टीरिया को प्रभावित किया, जबकि बीटा विविधता किण्वन चरण के दौरान परिवर्तनों को इंगित करती है। कार्यात्मक भूमिकाओं की जांच के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जो वाइन किण्वन में वर्णित फ़ाइला और जेनेरा में से कई खेलते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एपलाचियन स्टेट यूनिवर्सिटी रिसर्च काउंसिल (यूआरसी) अनुदान और सीएपीईएस प्रिंट ट्रैवल फेलोशिप से वित्त पोषण जिसने एफएओ की यूनिवर्सिडेड डी साओ पाउलो, रिबेरो प्रेटो - साओ पाउलो, ब्राजील की यात्रा का समर्थन किया, कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार किया जाता है। इस अध्ययन को Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001 द्वारा आंशिक रूप से वित्तपोषित किया गया था। ECPDM CAPES प्रिंट ट्रैवल अनुदान के लिए आभारी है जिसने Appalachian State University की उनकी यात्रा का समर्थन किया। ECPDM Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq) से एक रिसर्च फेलो 2 है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel  Promega, Madison, WI USA V3121 Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil  MP Biomedicals, Solon, OH USA 116560-200 DNA extraction 
FastQC software Babraham Institute, United Kingdom Bioinformatics 
Fermaid O Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix  New England Biolabs, USA F630S Polymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext Ultra New England Biolabs, USA NEB #E7103 DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS) Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
Novaseq6000 platform  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
QuiBit Thermoscientific, Waltham, MA, USA DNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer  Molecular device, San Jose, CA, USA DNA quantification 
Sodium Phosphate  Sigma Aldrich 342483 DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 

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मेटागेनोमिक एम्प्लिकॉन अनुक्रमण का उपयोग करके वाइन उत्पादन के दौरान किण्वन ट्रैमिनेट अंगूर के जीवाणु समुदाय की रूपरेखा
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