Summary
Qui, presentiamo un protocollo per descrivere la metagenomica degli ampliconi per determinare la comunità batterica dell'uva Traminette, dell'uva in fermentazione e del vino finale.
Abstract
I progressi nella tecnologia di sequenziamento e l'accesso relativamente facile all'uso di strumenti bioinformatici per profilare le strutture delle comunità microbiche hanno facilitato una migliore comprensione dei microbi coltivabili e non coltivabili nell'uva e nel vino. Durante la fermentazione industriale, i microbi, noti e sconosciuti, sono spesso responsabili dello sviluppo del prodotto e del sapore sgradevole. Pertanto, la profilazione dei batteri dall'uva al vino può consentire una facile comprensione delle dinamiche microbiche in situ . In questo studio, i batteri del mosto d'uva Traminette in fase di fermentazione e il vino finale sono stati sottoposti a estrazione di DNA che ha prodotto da 15 ng/μL a 87 ng/μL. È stato sequenziato l'amplicone 16S della regione ipervariabile della regione V4, batteri relativamente abbondanti costituiti da phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e seguiti da Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. Un'analisi del diagramma di Venn delle unità tassonomiche operative uniche condivise (OTU) ha rivelato che 15 phyla batterici erano comuni sia al mosto d'uva, alla fase di fermentazione che al vino finale. I phyla che non erano stati segnalati in precedenza sono stati rilevati utilizzando il sequenziamento dell'amplicone 16S, così come generi come Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae. È stata testata la variazione nell'uso di nutrienti organici nel vino e il suo impatto sui batteri; Serbatoio di Traminette R contenente Fermaid O e Traminette L stimolati con Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversità alfa utilizzando il test di Kruskal-Wallis ha determinato il grado di uniformità. La diversità beta indicava un cambiamento nei batteri nella fase di fermentazione per i due trattamenti, e i batteri finali del vino sembravano simili. Lo studio ha confermato che il sequenziamento dell'amplicone 16S può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti batterici durante la produzione del vino per supportare la qualità e un migliore utilizzo dei batteri dell'uva durante la produzione del vino.
Introduction
L'uva Traminette è caratterizzata da una produzione di vino di qualità superiore, oltre che da una resa apprezzabile e da una parziale resistenza a diverse infezioni fungine 1,2,3. La fermentazione naturale dell'uva si basa sui microrganismi associati, sull'ambiente di produzione del vino e sui recipienti di fermentazione 4,5. Spesso, molte aziende vinicole si affidano a lieviti e batteri selvatici per la fermentazione, la produzione di alcol, esteri, aroma e sviluppo del sapore6.
L'obiettivo di questo studio è quello di esaminare la composizione batterica dell'uva e monitorarne la dinamica durante la fermentazione. Tuttavia, l'uso moderno di colture starter come il Saccharomyces cerevisiae per la fermentazione primaria, dove viene prodotto l'alcol, è comune a diversi stili di vino7. Inoltre, la fermentazione secondaria, in cui l'acido malico viene decarbossilato da Oenococcus oeni ad acido lattico, migliora il profilo organolettico e gustativo del vino e riduce l'acidità del vino 8,9. Con i recenti progressi nell'uso di metodi indipendenti dalla coltura, è ora possibile determinare diversi microbi associati all'uva da vino e alle specie che vengono trasferite al mosto e partecipano alla fermentazione in tempi diversi fino al prodotto finale10.
I ruoli e le dinamiche dei batteri selvatici provenienti da diverse uve trasferite al mosto durante la fermentazione del vino sono poco conosciuti. La tassonomia di molti di questi batteri non è nemmeno nota, o le loro proprietà fenotipiche non sono caratterizzate. Questo rende la loro applicazione nella fermentazione in cocoltura ancora poco sottoutilizzata. Tuttavia, l'analisi microbiologica basata sulla coltura è stata utilizzata per determinare la popolazione batterica associata all'uva e al vino10. È ampiamente noto che la placcatura selettiva della coltura è noiosa, soggetta a contaminazione, ha una bassa riproducibilità e la produzione può essere dubbia; Mancano anche le specie batteriche le cui esigenze di crescita sono sconosciute. Studi precedenti indicano che le metodologie basate sul gene rRNA 16S, indipendenti dalla coltura, offrono un approccio più affidabile ed economico alla caratterizzazione di comunità microbiche complesse11. Ad esempio, il sequenziamento delle regioni ipervariabili del gene rRNA 16S è stato impiegato con successo per studiare i batteri nelle foglie d'uva, nelle bacche e nel vino 12,13,14. Gli studi hanno dimostrato che l'uso del metabarcoding dell'rRNA 16S o del sequenziamento metagenomico dell'intero è adatto per gli studi sul microbioma15. Stanno emergendo informazioni sul possibile legame tra la diversità batterica e le loro caratteristiche metaboliche durante la produzione del vino, che potrebbero aiutare nella determinazione delle proprietà enologiche e del terroir16.
È stata sottolineata la necessità di massimizzare i vantaggi degli strumenti metagenomici che utilizzano il sequenziamento di nuova generazione (NGS) per studiare l'ecologia microbica dell'uva e del vino16,17. Inoltre, l'uso di metodi indipendenti dalla coltura basati sul sequenziamento ad alto rendimento per profilare la diversità microbica dell'ecosistema alimentare e di fermentazione è diventato molto rilevante e prezioso per molti laboratori ed è raccomandato per l'uso industriale18,19. Fornisce un vantaggio per il rilevamento e la profilazione tassonomica delle attuali popolazioni microbiche e del contributo dei microbi ambientali, della loro abbondanza relativa e della diversità alfa e beta20. Il sequenziamento della regione variabile della regione 16S è diventato un importante gene di scelta ed è stato utilizzato durante diversi studi di ecologia microbica.
Mentre molti studi si concentrano sui funghi, in particolare sui lieviti, durante la fermentazione del vino21, questo studio ha riportato il sequenziamento dell'amplicone 16S e gli strumenti bioinformatici utilizzati per studiare i batteri durante la fermentazione dell'uva Traminette per la produzione di vino.
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Protocol
1. Produzione sperimentale di vino
- Ottenere l'uva Traminnette dal vino Dynamis Estate a Jonesville, nel vigneto della Carolina del Nord, diraspare e pigiare per rilasciare il mosto in due fermentatori separati a cielo aperto da 600 L e lasciare sulle bucce per circa 4 giorni con i coperchi.
- Punzonare i tappi una volta al giorno per mantenere la pelle bagnata e limitare la produzione di acidi volatili (VA).
NOTA: L'idea è che molti dei precursori aromatici (monoterpeni) si trovino nelle bucce e lascino il succo a contatto con la buccia per aumentare il potenziale aromatico del vino. - Dopo 4 giorni, pecare Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Questo lievito è stato selezionato in quanto è un forte fermentatore ed è associato all'esaltazione del carattere varietale del vino delle uve.
- In un serbatoio, Traminette R, aggiungere 20 g/hL di Fermaid O quando il grado brix è a 17,7 e 20 g/hL di Fermaid O e 12,5 g/hL di Fermaid K a 13,1 g/hL per ottenere la sicurezza della fermentazione, mentre nell'altro serbatoio Traminette L, aggiungere 40 g/hL di Stimula Sauvignon blanc quando il grado brix è a 17,1. Aggiungere anche 20 g/hL di Fermaid O quando il grado brix è a 13,4 per esaltare il carattere varietale del vino.
- Prelevare campioni in doppio di mosto (giorno 1), lievito aggiunto (giorno 4), mosto fermentato (giorno 15) e campioni di vino finito (giorno 30) e conservare a -20 °C prima dell'estrazione del DNA e dell'analisi metagenomica.
2. Estrazione del DNA per la metagenomica
- Conservare tutti i campioni duplicati ottenuti sopra su ghiaccio fino alla prima centrifugazione.
- Trasferire 20 mL del campione fermentato in una provetta sterile con tappo a vite da 50 mL.
- Aggiungere 10 mL di acqua fredda e omogeneizzare (vortex). Centrifugare per 1 minuto a 800 x g a 4 °C e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 mL.
NOTA: Questo passaggio rimuoverà i solidi del campione. - Ripetere il passaggio 2.3 due volte e raggruppare i surnatanti nella stessa provetta.
- Centrifugare il surnatante a 3.000 x g a 4 °C per 20 minuti per pellettare le cellule. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 1 mL di PBS, trasferire in una provetta con tappo a vite da 2 mL e centrifugare a 14.000 x g per 2 min. Eseguire altri due lavaggi utilizzando PBS.
- A questo punto, congelare i pellet a -20°C o seguire il passaggio 2.8. È importante che tutti i campioni siano trattati allo stesso modo.
- Aggiungere 978 μL di tampone fosfato di sodio. Preparare il tampone fosfato di sodio, aggiungere 3,1 g di NaH2PO4· H2O e 10,9 g di Na2HPO4 (anidro) a H2O distillato per ottenere un volume di 1 L e regolare il pH a 7,4.
- Aggiungere 122 μL di tampone di DNA (DNA spin kit) e vortice.
- Lasciare riposare in frigorifero (4 °C) per 45 min-1 h. Vortex i campioni ogni 15 min. Questo passaggio può essere lasciato durante la notte (o/n) o fino a quando non si è pronti per continuare a utilizzare il kit di rotazione del DNA.
- Trasferire 1 mL di campione in una provetta della soluzione di lisi 1 (kit di centrifugazione del DNA) e serrare il tappo (scrivere il numero del campione sul lato della provetta e non sul tappo; i reagenti del kit rimuoveranno tutto ciò che è scritto sul tappo).
- Omogeneizzare il campione in un macinatore per sbattere le perle (6,5 m/s, CY: 24 x 2) per 60 s per tre volte. Se il macinino battitallone ha il dispositivo per mettere il ghiaccio, metti 50 g di ghiaccio secco sotto i tubi. In caso contrario, conservare i campioni su ghiaccio umido per 5 minuti tra una fase di omogeneizzazione e l'altra.
- Centrifugare le provette E della matrice lisante (kit di centrifugazione del DNA) per 1 minuto a 16800 x g (o velocità massima).
- Trasferire il surnatante in una microprovetta pulita. Successivamente, aggiungere 250 μL di reagente per la soluzione di precipitazione proteica (PPS) (kit di centrifugazione del DNA) e mescolare agitando la provetta a mano 10 volte.
- Centrifugare per 5 minuti a 16800 x g per pellettare il precipitato.
- Trasferire il surnatante in una provetta sterile da 15 ml. Aggiungere 1 mL di sospensione della matrice di legame (kit di spin del DNA) al surnatante.
NOTA: Risospendere la sospensione della matrice di legame prima dell'uso fino a quando non è omogenea. - Capovolgere le provette a mano per 2 minuti, quindi lasciare riposare le provette in una griglia per 3 minuti (per consentire la sedimentazione della matrice di silice).
- Rimuovere con cautela 1 mL di surnatante. Risospendere la matrice nel surnatante rimanente.
- Trasferire 600 μL della miscela in una provetta con filtro centrifugo (DNA spin kit) e centrifugare per 1 minuto a 14500 x g.
- Aggiungere il restante composto e centrifugare.
- Decantare a flusso continuo e aggiungere 500 μL di soluzione di lavaggio (kit di centrifugazione del DNA) nella provetta del filtro centrifugante e centrifugare per 1 minuto a 14500 x g (assicurarsi di aggiungere EtOH alla soluzione di lavaggio; vedere il manuale del prodotto). Decantare il flow-through e ripetere il lavaggio altre due volte (3 lavaggi in totale).
- Decantare il flow-through e centrifugare per altri 2 minuti a 14.500 x g per asciugare la matrice di soluzione di lavaggio residua.
- Rimuovere il filtro rotante e metterlo in una nuova provetta di raccolta (kit di centrifuga DNA). Asciugare all'aria il filtro centrifugo per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Riscaldare l'acqua priva di DNAsi (DNA spin kit) a 55 °C per 5 min. Aggiungere 50 μL di acqua priva di DNAsi e mescolare delicatamente la matrice sulla membrana filtrante con un puntale per pipetta per un'efficiente eluizione del DNA. Lasciare riposare i campioni a RT per 1 minuto, quindi centrifugare per 1 minuto a 14500 x g per eluire il DNA.
- Mettere i campioni sul ghiaccio. Caricare la miscela del campione (2 μL di campione + 2 μL di acqua + 1 μL di tampone di carico) in un gel. Misurare la concentrazione di DNA.
- Conservare i campioni a -20 °C.
- Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare il DNA estratto.
NOTA: Un volume di 1 μL di DNA è stato eliminato e quantificato e la qualità del DNA è stata notata con un rapporto A260/A280.
3. Elettroforesi del DNA
- Preparare un gel di agarosio all'1% in un tampone da 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 mL per un mini gel, 70-100 mL per un gel medio). Pesare l'agarosio+tampone, far bollire in microonde per sciogliere l'agarosio, ripesare e aggiungere dH2O al peso originale. Raffreddare la soluzione di agarosio a 55-60 °C e versarla nella formatrice di gel con pettine. Lasciare solidificare il gel.
- Aggiungere 1 μL di tampone di caricamento gel 10x al campione (10 μL) e caricarlo sul gel accanto a un marcatore di peso molecolare. Passare dal negativo (nero) al positivo (rosso) a 100-115 V (gel grande) o 90 V (mini gel) fino a quando il colorante blu non è vicino al fondo.
- Colorare il gel per 30 minuti in bromuro di etidio da 1 μL/mL o verde SYBR (sono necessari guanti e occhiali in nitrile), risciacquare in acqua e guardare sotto una fonte di luce ultravioletta (UV). Dai campioni duplicati, selezionare la resa più alta per l'ulteriore elaborazione.
4. Sequenziamento ad alto rendimento
- Amplificare la regione ipervariabile V4 del gene rRNA 16S utilizzando primer specifici 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') e 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Impostare le condizioni di reazione a catena della polimerasi (PCR) a 94 °C per 2 min, 30 cicli di 94 °C per 20 s, 58 °C per 20 s, 65 °C per 1 min e 65 °C per 10 min (estensione finale).
- Eseguire reazioni PCR con una miscela master PCR ad alta fedeltà (Table of Materials).
- Genera librerie con il kit di preparazione della libreria di DNA e quindi sequenzia utilizzando il sequenziamento a due estremità su una piattaforma di sequenziamento.
NOTA: In questo caso, le librerie generate con il kit di preparazione della libreria del DNA NEBNext Ultra II sono state sequenziate utilizzando il sequenziamento Illumina paired-end (2 × 250 bp) sulla piattaforma novaseq6000. - Seguire i passaggi di sequenziamento:
- Fase 1: Tagliare il DNA con un enzima, di solito con un metodo che seleziona per una dimensione generale.
- Aggiungere 3,5 μL di tampone di sequenziamento e 1,5 μL di miscela enzimatica a 25 μL di DNA (circa 1 μg), mescolare 10 volte con una pipetta e centrifugare rapidamente.
- Mettere in un termociclatore con le seguenti condizioni: preriscaldare il coperchio a 75°C, (1) 30 min per 20 °C (2) 30 min per 65 °C (3) tenere a 4°C.
- Passaggio 2: aggiungere gli adattatori tramite legatura
- Aggiungere 15 μL di miscela master di legatura, 1,25 μL di adattatore, 0,5 μL di potenziatore di legatura e 30 μL di miscela di DNA di preparazione finale con una pipetta.
- Incubare a 20 °C per 15 minuti in un termociclatore e quindi aggiungere 1,5 μL di enzima reagente di escissione uracil-specifico (USER) alla miscela di legatura per ottenere un totale di 48,26 μL. Incubare a 37 °C per 15 minuti.
- Aggiungere 43,5 μL di microsfere magnetiche al DNA di legatura dell'adattatore, mescolare 20 volte con una pipetta e incubare per 5 minuti a RT. Separare le perle con un rack magnetico, quindi incubare per 5-10 minuti e scartare il surnatante.
- Lavare il pellet con 100 μL di etanolo all'80%, asciugare per 30 secondi e lavare di nuovo. Eluire le perle e il pellet in 8,5 μL di Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20 a 10 mM, miscelare con una pipetta e incubare a RT per 2 min.
- Incubare nel rack magnetico e rimuovere 7,5 μL di DNA eluito come surnatante. Posizionare l'eluito in una nuova provetta ed eseguire una fase di PCR.
- Innanzitutto, aggiungere 12,5 μL di master mix, 2,5 μL di primer indice i7 e 2,5 μL di primer PCR universale/primer i5 al DNA legato-adattatore da 7,5 μL per ottenere 25 μL di miscela di reazione PCR. Utilizzare la seguente condizione PCR: preriscaldare il coperchio a 103 °C. 98 °C per 30 s, 98 °C per 10 s, 65 °C per 75 s, 65 °C per 5 min e mantenere a 4 °C dopo 10 cicli.
- Pulire il DNA amplificato da 25 μL. Aggiungere 22,5 μL di microsfere magnetiche e mescolare 20 volte. Incubare a RT per 5 minuti e rimuovere 50 μL del surnatante. Lavare le perline con 100 μL di etanolo all'80% e rimuovere tutto l'etanolo asciugando delicatamente le perle per 30 secondi.
- Risospendere le perle marrone scuro in 16 μL di acqua, mescolare 20 volte con una pipetta e posizionare nel rack magnetico per 30-60 s. Trasferire 15 μL in una nuova provetta.
- Determinare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro. Mescolare 90 μL di tampone + 1 μL di colorante + 2 μL di campione di DNA e leggere la concentrazione. Diluire il DNA a 2 nM, caricare 27-30 μL sulla cella di flusso e posizionarlo nel sequenziatore.
- Fase 3: Sequenziare gli adattatori, ibridare le librerie generate sopra alla matrice della cella di flusso modellata e catturare il DNA secondo le istruzioni del produttore. Usalo come modello per la seconda sintesi.
- Quindi, amplificare il secondo filamento in un cluster clonale. Linearizzare il cluster e bloccare i siti attivi. Aggiungere il primer di sequenziamento per fornire un sito per il sequenziamento per sintesi nella sequenza secondo il protocollo del produttore.
NOTA: Chimicamente, i nucleotidi modificati si legano al filamento stampo di DNA utilizzando la complementarità naturale. Ogni nucleotide ha un tag fluorescente e un terminatore reversibile che blocca l'inclusione della base successiva. Pertanto, la presenza di un segnale fluorescente indica quale nucleotide è inserito e il terminatore viene scisso per consentire alla base successiva di legarsi.
- Quindi, amplificare il secondo filamento in un cluster clonale. Linearizzare il cluster e bloccare i siti attivi. Aggiungere il primer di sequenziamento per fornire un sito per il sequenziamento per sintesi nella sequenza secondo il protocollo del produttore.
- Passo 4: Amplificare il filamento a legame singolo per ottenere cluster di sequenze che vengono sequenziate in tandem per sintesi.
NOTA: I cluster forniscono un segnale più luminoso rispetto a un singolo filamento attraverso la scansione bidirezionale e la chimica di sequenziamento a due canali. Il software di sequenziamento trasferisce automaticamente i file delle chiamate di base (*.cbcl) alla posizione della cartella di output specificata per l'analisi dei dati.
- Fase 1: Tagliare il DNA con un enzima, di solito con un metodo che seleziona per una dimensione generale.
5. Bioinformatica
- Generare i dati della sequenza come file FASTQ. Analizza per includere le seguenti parti.
- Parte I:
- Salvate i file FASTQ ottenuti dal sequencer, fate clic per aprire un foglio di calcolo e create i file di mappatura/metadati.
- Aprire il sito Web di Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), caricare i file FASTQ, leggere QC, filtraggio e ritaglio in QIIME222. Depositare le sequenze grezze come archivio di lettura delle sequenze (SRA) e GenBank in NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
- Parte II: Andate sul sito web di Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), eseguite le letture demultiplexate paired-end, la sostituzione dei filtri e gli errori chimera, e unite usando DADA223. Utilizzare il classificatore Naive Bayes addestrato sul database OTU 99% Silva versione 132 per eseguire l'assegnazione tassonomica batterica al 97% di somiglianza24.
- Parte III: Apri il sito Web di MicrobiomeDB, fai clic per caricare i file e genera le curve di alfa-diversità, beta-diversità, abbondanza relativa e rarefazione OTU (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Parte IV: Aprire un foglio di calcolo e trasferire i dati per creare mappe di calore, diagrammi di Venn e dimensioni dell'effetto dell'analisi discriminante lineare (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Parte I:
6. Analisi statistica
- Aprire QIIME222 e determinare le differenze significative nella diversità alfa tra i gruppi utilizzando lo script alpha-group-meaning. Questo eseguirà anche il test di Kruskal-Wallis.
- Determinare le differenze nella diversità beta tra i gruppi utilizzando PERMANOVA, incluso un test a coppie25.
- Ottenere le differenze significative nella struttura della comunità batterica tra i gruppi utilizzando MicrobiomeDB. Un valore p ≤0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Representative Results
Per prima cosa sono state determinate la quantità e la qualità del DNA estratto dal mosto d'uva, dal vino in fermentazione e dal vino finale; il valore della quantità varia da 15 a 87 ng/μL (Tabella 1).
Sequenziamento e bioinformatica
Il sequencer ad alta produttività Illumina ha generato un file FASTQ che è stato importato in Nephele e visualizzato sulla piattaforma QIIME2 26. In primo luogo, è stato utilizzato il software FastQC per verificare la qualità della sequenza. Quindi, è stato tagliato a entrambe le estremità 5' e 3'- per eliminare nucleotidi di scarsa qualità, denoised, merged e impoverito di sequenze chimeriche prima di clusterizzarsi in OTU (definizione operativa per una specie) utilizzando il denoiserDADA2 23. Sono stati mappati su taxa batterici utilizzando il database SILVA v138.1. Le sequenze sono state raggruppate in OTU sulla base di una somiglianza della sequenza nucleotidica del 99%. La Figura 1 mostra le curve di rarefazione DADA2 per le OTU; Raggiunse un plateau. Ciò ha indicato che sono state coperte sequenze sufficienti per indicare la maggior parte della diversità microbica. L'analisi replicata delle sequenze non ha generato alcuna differenza significativa.
La mappa termica basata sull'abbondanza relativa dei batteri a diversi regimi dal mosto d'uva al vino è mostrata nella Figura 2. I phyla più dominanti indicati in rosso sono costituiti da Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e, seguiti da Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. I batteri meno abbondanti sono stati indicati in blu. Molti di questi gruppi erano presenti nel mosto, quando veniva aggiunto il lievito ma assenti durante la fermentazione, in particolare Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota ed Elusimicrobiota. L'abbondanza relativa è stata determinata anche a livello di genere e i risultati hanno indicato generi importanti come Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae, come mostrato nella Figura 3. Un'analisi del diagramma di Venn dell'OTU unico condiviso ha rivelato che 15 batteri erano presenti dal mosto d'uva da vino al vino finale (Figura 4). I risultati del sequenziamento degli ampliconi basati sulla regione variabile V4 hanno anche indicato la diversità alfa nelle due Traminette R e L. La Figura 4 mostra l'uniformità della specie come segno di distribuzione, che è diversa tra i due trattamenti nutrizionali. I dati hanno mostrato che lo spostamento della diversità nello Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O era inferiore a 1 a 13,4 brix e l'uniformità si avvicina allo zero al variare delle abbondanze relative. I dati sono stati analizzati anche per la diversità beta; La figura 5 mostra la differenza tra le due traminette di fermentazione R e L; I batteri erano simili nelle fasi di aggiunta del mosto e del lievito. C'è stato un cambiamento nei batteri nella fase di fermentazione per i due trattamenti, e sembra simile nel vino finale (Figura 6).
Figura 1: Grafici di rarefazione delle OTU osservate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Mappa di calore dell'abbondanza relativa. La mappa di calore dell'abbondanza relativa ai livelli di phylum R e L non era significativamente diversa (p ≤0,05). La barra della legenda indica il punteggio chiave. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Abbondanza relativa dei primi dieci taxa. L'abbondanza relativa a livello di genere dei primi dieci taxa classificati dai media con il test della somma dei ranghi di Wilcoxon (p ≤0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diagramma di Venn. I batteri unici e condivisi tra il mosto, i lieviti aggiunti, la fermentazione e il vino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Diversità alfa di Traminette R e Traminette L. Diversità alfa dell'indice H di Shannon dei due nutrienti Fermaid O e Stimula Sauvignon blanc e Fermaid O (Dunn > 0,05) sulla base dell'analisi del test Kruskal-Wallis. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi delle componenti principali. Analisi delle componenti principali dei dati di rRNA 16S della diversità beta basata su Bray-Curtis dei due nutrienti Fermaid O e Stimula Sauvignon Blanc e Fermaid O in diverse fasi della produzione del vino. Il cerchio blu rappresenta un gruppo di fasi di aggiunta del mosto e del lievito. Il cerchio rosso indica il vino finale e il cerchio nero è la fase di fermentazione nei due trattamenti. Gli assi 1 e 2 sono variazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Data di campionamento | Campione | A260/A280 | Concentrazione ng/μL Traminette R | A260/A280 | Concentrazione ng/μL Traminette L |
| 8/30/21 | Uva | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | Dovere | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | Riposo | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | Lievito aggiunto | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | Fermentazione | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | Fermentazione | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | Vino finale | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
Tabella 1: La quantità e la qualità del DNA estratto dal mosto d'uva, dal vino in fermentazione e dal vino finale.
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Discussion
Il protocollo di metagenomica parte dal campionamento del mosto d'uva, e quando al mosto è stato aggiunto il lievito, il vino in fermentazione e i campioni finali di vino. Questo è stato seguito dall'estrazione del DNA duplicato che è stato estratto con successo da questi campioni. Le quantità ottenute variavano in concentrazione da 15 ng/μL a 87 ng/μL. Ciò dimostra che il protocollo di estrazione del DNA è efficace per gli studi metagenomici del vino. Sebbene la qualità del DNA in A260/A280 vari, ciò può essere attribuito a diversi parametri che possono influenzare l'estrazione, come la concentrazione di alcol e altri metaboliti della fermentazione che si sono sviluppati durante e dopo la fermentazione, nonché altri materiali vegetali organici che possono inibire l'estrazione del genoma. Studi precedenti hanno riportato un'osservazione simile sul materiale vegetale metagenomico27. Tuttavia, il DNA estratto nel protocollo descritto ha raggiunto una quantità sufficiente per la fase successiva dell'analisi. Il codice a barre PCR necessario per gli studi metagenomici, in particolare utilizzando la piattaforma di sequenziamento Illumina, richiede che la quantità minima di DNA sia fissata a 1 ng/L. La regione V4 è stata sequenziata e la determinazione della diversità batterica richiede l'uso del sequenziamento del gene rRNA 16S; questo gene ha diverse regioni variabili da V1-V923. Un totale di 6.393.443 letture di sequenze a due estremità con una media di 399590,1875 ± 138442,6148 dal DNA estratto dai diversi campioni. V4 è stato comunemente usato ed è indicato come la regione ipervariabile del gene che è buona per l'analisi tassonomica batterica e della diversità. Durante il sequenziamento, sono state generate sequenze appaiate di circa 200-300 bp. Esistono diverse piattaforme utilizzate per il sequenziamento del DNA estratto da alimenti e bevande fermentate28. I motivi per utilizzare la piattaforma Illumina sono i seguenti: (1) Illumina è una piattaforma di sequenziamento di seconda generazione di seconda generazione con un'uscita eccellente e la sua chimica offre un basso tasso di errore e un basso profilo. È anche conveniente rispetto ai kit commerciali disponibili per la preparazione delle biblioteche e le sue letture relativamente brevi sono ideali per l'espressione differenziale. La fase finale del protocollo è stata la bioinformatica, una componente importante dell'uso del sequenziamento dell'amplicone 16 per la determinazione della diversità microbica. Il controllo di qualità delle sequenze ottenute dal file FASTQ è stato molto buono e le OTU ottenute da QIIME hanno portato a un'analisi tassonomica mostrata nei risultati dell'abbondanza relativa, della diversità alfa e beta.
Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è diventato uno strumento importante per la profilazione dei batteri di diverse comunità microbiche di fermentazione. In questo studio, la classificazione dell'amplicone 16S è stata eseguita per la prima volta a livello di phylum ed è stato notato un gruppo di batteri più diversificato rispetto a quanto precedentemente riportato12 durante la fermentazione del vino d'uva; Sono stati condivisi anche 15 phyla, come indicato dall'analisi del risultato di Venn. Inoltre, l'analisi a livello di genere ha mostrato la presenza di generi importanti, come Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae che erano più abbondanti nella vasca Traminette R. Abbiamo limitato la nostra analisi alla tassonomia a livello di genere; Ci sono studi in cui il metodo è stato utilizzato per l'identificazione a livello di tassonomia a livello di specie attraverso l'inferenza del campione ad alta risoluzione23. Uno dei limiti del sequenziamento degli ampliconi è che i dati della sequenza non possono determinare la tassonomia a livello di ceppo a causa della breve lunghezza della sequenza di rRNA 16S. Un'altra limitazione è il rilevamento di cloroplasti e mitocondri. Sarebbe auspicabile se il procedimento bioinformatico potesse essere utilizzato per eliminare queste sequenze poiché sono contaminanti delle piante di vite. Tuttavia, il protocollo di amplificazione utilizza clamp PNA-DNA per massimizzare la contaminazione da cloroplasti e mitocondri29. L'elevata abbondanza di Firmicute nel mosto d'uva, durante la fermentazione e il vino finale, concorda con i precedenti studi sull'uvada vino 30. I risultati dell'analisi della diversità alfa hanno indicato l'uniformità batterica di ogni trattamento nutrizionale fermentativo; sembra che il nutriente Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O abbia generato un batterio più diversificato. Inoltre, i dati sulla diversità beta hanno mostrato lo spostamento dei batteri nella fase di fermentazione; I cambiamenti dinamici indicano che la fase di fermentazione è un periodo molto importante in cui i cambiamenti nutrizionali influenzano la selezione batterica. La tecnica può essere adattata e utilizzata dalle industrie per monitorare la fermentazione e migliorare la qualità e la consistenza28. Tuttavia, saranno necessari ulteriori studi per comprendere meglio l'impatto dei nutrienti organici sulla diversità microbica durante la fermentazione del vino.
Questo studio è il primo ad esaminare la diversità batterica durante la fermentazione dell'uva Traminette e del vino utilizzando il sequenziamento del codice a barre dell'amplicone 16S per determinare i cambiamenti batterici. Ciò ha confermato la diversità dei batteri a livello di phylum e genere. I Proteobacteria, seguiti dai Firmicutes, sono stati i più abbondanti man mano che la fermentazione progrediva fino al vino finale. Molti phyla che non erano stati segnalati in precedenza sono stati rilevati utilizzando il sequenziamento dell'amplicone 16S, e questo ha confermato che il metodo può essere utilizzato per monitorare la produzione di vino. La diversità alfa ha mostrato il ruolo del cambiamento nutrizionale; Ha avuto un impatto sui batteri di fermentazione, mentre la diversità beta indica i cambiamenti durante la fase di fermentazione. Sono necessari ulteriori studi per indagare i ruoli funzionali che molti dei phyla e dei generi descritti svolgono nella fermentazione del vino.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Si ringraziano i finanziamenti dell'Appalachian State University Research Council (URC) e della borsa di studio CAPES Print Travel che hanno sostenuto la visita della FAO all'Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasile. Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Codice Finanziario 001. ECPDM è grata per la sovvenzione CAPES Print Travel che ha sostenuto la sua visita all'Appalachian State University. ECPDM è assegnista di ricerca 2 presso il Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasile (CNPq).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
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