Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Profilering av bakteriesamhället i jäsande traminettedruvor under vinproduktion med hjälp av metagenomisk ampliconsekvensering

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65598
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva amplicon metagenomic för bestämning av bakteriesamhället i Traminette-druvor, jäsande druvor och slutvin.

Abstract

Framsteg inom sekvenseringsteknik och den relativt enkla tillgången till användning av bioinformatiska verktyg för att profilera mikrobiella samhällsstrukturer har underlättat en bättre förståelse av både odlingsbara och icke-odlingsbara mikrober i druvor och vin. Under industriell jäsning är mikrober, kända och okända, ofta ansvariga för produktutveckling och bismak. Att profilera bakterierna från druva till vin kan därför möjliggöra en enkel förståelse av mikrobiell dynamik in situ . I denna studie måste bakterierna i Traminette-druvor genomgå jäsning, och det slutliga vinet utsattes för DNA-extraktion som gav 15 ng/μL till 87 ng/μL. 16S-amplikonet i den hypervariabla regionen i V4-regionen sekvenserades, relativt rikligt förekommande bakterier bestående av fyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota och följdes av Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota och Acidobacteriota. En Venndiagramanalys av de delade unika operationella taxonomiska enheterna (OTU) avslöjade att 15 bakteriefyla var gemensamma för både druvmust, jäsningsstadium och slutligt vin. Fyla som inte tidigare rapporterats detekterades med hjälp av 16S-sekvensering, liksom släkten som Enterobacteriaceae och Lactobacillaceae. Variation i den organiska näringsanvändningen i vin och dess inverkan på bakterier testades; Traminette R-tank innehållande Fermaid O och Traminette L stimulerad med Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alfadiversitet med hjälp av Kruskal-Wallis-testet bestämde graden av jämnhet. Betadiversiteten indikerade en förändring i bakterierna vid jäsningsstadiet för de två behandlingarna, och de slutliga vinbakterierna såg likadana ut. Studien bekräftade att 16S ampliconsekvensering kan användas för att övervaka bakterieförändringar under vinproduktion för att stödja kvalitet och bättre utnyttjande av druvbakterier under vinproduktion.

Introduction

Traminette-druvan kännetecknas av produktion av överlägsen vinkvalitet, förutom betydande avkastning och partiell resistens mot flera svampinfektioner 1,2,3. Den naturliga jäsningen av druvor är beroende av associerade mikroorganismer, vinproduktionsmiljö och jäsningskärl 4,5. Ofta förlitar sig många vingårdar på vildjäst och bakterier för jäsning, produktion av alkohol, estrar, arom och smakutveckling6.

Målet med denna studie är att undersöka druvornas bakteriesammansättning och övervaka deras dynamik under jäsningen. Även om den moderna användningen av startkulturer som Saccharomyces cerevisiae för primärjäsning, där alkohol produceras, är gemensam för olika vinstilar7. Dessutom förbättrar den sekundära jäsningen, där äppelsyra dekarboxyleras av Oenococcus oeni till mjölksyra, vinets organoleptiska profil och smakprofil och minskar vinets syrahalt 8,9. Med de senaste framstegen i användningen av odlingsoberoende metoder är det nu möjligt att bestämma olika mikrober associerade med vindruvan och de arter som överförs till must och delta i jäsningen vid olika tidpunkter fram till slutprodukten10.

Rollerna och dynamiken hos vilda bakterier från olika druvor som överförs till musten under vinjäsningen är dåligt kända. Taxonomin för många av dessa bakterier är inte ens känd, eller så är deras fenotypiska egenskaper okarakteriserade. Detta gör att deras tillämpning i samkulturfermentering fortfarande är dåligt underutnyttjad. Mikrobiologisk odlingsbaserad analys har dock använts för att bestämma bakteriepopulationen i samband med druvor och vin10. Det är allmänt känt att selektiv odlingspätering är tråkigt, benäget att kontamineras, har låg reproducerbarhet och produktionen kan vara tveksam; Den missar också bakteriearter vars tillväxtbehov är okända. Tidigare studier tyder på att odlingsoberoende, 16S rRNA-genbaserade metoder erbjuder ett mer pålitligt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att karakterisera komplexa mikrobiella samhällen11. Till exempel har sekvensering av de hypervariabla regionerna i 16S rRNA-genen framgångsrikt använts för att studera bakterier i druvblad, bär och vin 12,13,14. Studier har visat att användningen av antingen 16S rRNA-metastreckkodning eller helmetagenomisk sekvensering är lämplig för mikrobiomstudier15. Det finns ny information om den möjliga kopplingen mellan bakteriell mångfald och deras metaboliska egenskaper under vinproduktion, vilket kan vara till hjälp vid bestämningen av oenologiska egenskaper och terroir16.

Behovet av att maximera fördelarna med de metagenomiska verktygen som använder nästa generations sekvensering (NGS) för att studera druvornas och vinets mikrobiella ekologi har betonats16,17. Användningen av odlingsoberoende metoder baserade på sekvensering med hög genomströmning för att profilera mikrobiell mångfald i livsmedels- och fermenteringsekosystemet har också blivit mycket relevant och värdefull för många laboratorier och rekommenderas för industriell användning18,19. Det ger en fördel av detektion och taxonomisk profilering av de nuvarande mikrobiella populationerna och bidraget från miljömikrober, deras relativa förekomst och alfa- och betadiversitet20. Sekvensering av den variabla regionen i 16S-regionen har blivit en viktig gen och har använts under olika mikrobiella ekologiska studier.

Medan många studier fokuserar på svampar, särskilt jäst, under vinjäsning21, rapporterade denna studie 16S amplikonsekvensering och bioinformatiska verktyg som används för att studera bakterierna under Traminette-druvjäsning för vinproduktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Experimentell vinproduktion

  1. Skaffa Traminnette-druvor från Dynamis Estate-vin i Jonesville, North Carolina vingård, avstjälka och krossa för att släppa musten i två separata 600 L jäskärl med öppen topp och låt stå på skalet i cirka 4 dagar med locken på.
  2. Stansa ner locken en gång om dagen för att hålla skinnet vått och begränsa produktionen av flyktiga syror (VA).
    OBS: Tanken är att en hel del av de aromatiska prekursorerna (monoterpenerna) sitter i skalen och lämnar saften i kontakt med skalet för att öka vinets aromatiska potential.
  3. Efter 4 dagar, pitch Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Denna jäst valdes eftersom den är en stark jäsare och förknippas med att förstärka druvsortskaraktären i vinet.
  4. I den ena tanken, Traminette R, tillsätt 20 g/hL Fermaid O när brixen är på 17,7 och 20 g/hL Fermaid O och 12,5 g/hL Fermaid K på 13,1 g/hL för att uppnå jäsningssäkerhet, medan den andra tanken Traminette L, tillsätt 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc när brixen är på 17,1. Tillsätt även 20 g/hL Fermaid O när brixen ligger på 13,4 för att förstärka vinets sortkaraktär.
  5. Ta dubbla prover av must (dag 1), tillsatt jäst (dag 4), jäst must (dag 15) och färdiga vinprover (dag 30) och förvara vid -20 °C före DNA-extraktion och metagenomisk analys.

2. DNA-extraktion för metagenomik

  1. Förvara alla dubbletter av proverna ovan på is fram till den första centrifugeringen.
  2. Överför 20 ml av det fermenterade provet till ett sterilt 50 ml skruvlocksrör.
  3. Tillsätt 10 ml kallt vatten och homogenisera (virvel). Centrifugera i 1 minut vid 800 x g vid 4 °C och överför supernatanten till ett nytt 50 ml rör.
    OBS: Detta steg kommer att ta bort de fasta ämnena i sample.
  4. Upprepa steg 2.3 två gånger och slå samman supernatanterna i samma rör.
  5. Centrifugera supernatanten vid 3 000 x g vid 4 °C i 20 minuter för att pelletera cellerna. Kassera supernatanten.
  6. Återsuspendera pelleten i 1 ml PBS, överför till ett 2 ml skruvlocksrör och centrifugera vid 14 000 x g i 2 minuter. Utför ytterligare två tvättar med PBS.
  7. I detta steg, frys pelletsen vid -20°C eller följ steg 2.8. Det är viktigt att alla prover behandlas på samma sätt.
  8. Tillsätt 978 μl natriumfosfatbuffert. Bered natriumfosfatbuffert, tillsätt 3,1 g NaH2PO4· H2O och 10,9 g Na2HPO4 (vattenfri) till destillerat H2O för att få en volym på 1 L och justera pH till 7,4.
  9. Tillsätt 122 μl DNA-buffert (DNA-spinnsats) och virvel.
  10. Låt stå i kylen (4 °C) i 45 min-1 h. Virvla proverna var 15:e minut. Detta steg kan lämnas över natten (o/n) eller tills du är redo att fortsätta använda DNA-spinnsatsen.
  11. Överför 1 ml sample till ett rör med lyslösning 1 (DNA-spinnsats) och dra åt locket (skriv provnumret på sidan av röret och inte på locket; kitreagenserna tar bort allt som står på locket).
  12. Homogenisera provet i en strängslip (6,5 m/s, CY: 24 x 2) i 60 s tre gånger. Om den pärlslagande kvarnen har en anordning för att lägga is, lägg 50 g torris under rören. Om inte, förvara proverna på våt is i 5 minuter mellan varje homogeniseringssteg.
  13. Centrifugera Lysing Matrix E-rör (DNA-spinnsats) i 1 min vid 16800 x g (eller maxhastighet).
  14. Överför supernatanten till ett rent mikrorör. Tillsätt därefter 250 μL reagens av proteinutfällningslösning (PPS) (DNA-spinnkit) och blanda genom att skaka röret för hand 10 gånger.
  15. Centrifugera i 5 minuter vid 16800 x g för att pelletera fällningen.
  16. Överför supernatanten till en steril 15 ml slang. Tillsätt 1 ml bindningsmatrissuspension (DNA-spinnkit) till supernatanten.
    OBS: Återsuspendera bindningsmatrissuspensionen före användning tills den är homogen.
  17. Vänd rören för hand i 2 min, låt sedan rören stå i ett ställ i 3 min (för att möjliggöra sedimentering av kiseldioxidmatris).
  18. Ta försiktigt bort 1 ml av supernatanten. Återsuspendera matrisen i den återstående supernatanten.
  19. Överför 600 μl av blandningen till ett spinnfilterrör (DNA-spinnsats) och centrifugera i 1 minut vid 14500 x g.
  20. Tillsätt resten av blandningen och centrifugera.
  21. Häll av genomflödet och tillsätt 500 μL tvättlösning (DNA-spinnkit) i centrifugeringsröret och centrifugera i 1 minut vid 14500 x g (se till att tillsätta EtOH till tvättlösningen; se produkthandboken). Dekantera genomströmningen och upprepa tvätten två gånger till (3 tvättar totalt).
  22. Dekantera genomströmningen och centrifugera i ytterligare 2 minuter vid 14 500 x g för att torka matrisen med kvarvarande tvättlösning.
  23. Ta bort spinnfiltret och placera det i ett nytt uppsamlingsrör (DNA-spinnsats). Lufttorka centrifugeringsfiltret i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
  24. Värm det DNAse-fria vattnet (DNA-spinnkit) vid 55 °C i 5 minuter. Tillsätt 50 μL DNAse-fritt vatten och rör försiktigt om matrisen på filtermembranet med en pipettspets för effektiv eluering av DNA. Låt proverna stå vid RT i 1 minut och centrifugera sedan i 1 minut vid 14500 x g för att eluera DNA.
  25. Lägg proverna på is. Fyll på provblandningen (2 μl prov + 2 μl vatten + 1 μl laddningsbuffert) i en gel. Mät DNA-koncentrationen.
  26. Förvara proverna vid -20 °C.
  27. Använd en spektrofotometer för att kvantifiera det extraherade DNA:t.
    OBS: En 1 μL volym DNA tappades och kvantifierades, och kvaliteten på DNA noterades i förhållandet A260/A280.

3. DNA-elektrofores

  1. Förbered 1 % agarosgel i 0,5 Tris/Borate/EDTA (TBE) buffert (20 ml för en minigel, 70-100 ml för en medium gel). Väg agaros+buffert, koka i mikrovågsugn för att smälta agaros, väg om och tillsätt dH2O till den ursprungliga vikten. Kyl agaroslösningen till 55-60 °C och häll i gelformaren med kam. Låt gelen stelna.
  2. Tillsätt 1 μl 10x gelladdningsbuffert till provet (10 μL) och fyll på gelen bredvid en molekylviktsmarkör. Kör från negativ (svart) till positiv (röd) vid 100-115 V (stor gel) eller 90 V (mini gel) tills det blå färgämnet är nära botten.
  3. Fläckgel i 30 minuter i 1 μL/ml etidiumbromid eller SYBR-grönt (nitrilhandskar och skyddsglasögon behövs), skölj i vatten och view under en ultraviolett (UV) ljuskälla. Från de duplicerade proverna väljer du det högsta utbytet för vidare bearbetning.

4. Sekvensering med hög genomströmning

  1. Amplifiera den hypervariabla V4-regionen av 16S rRNA-genen med hjälp av specifika primers 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') och 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Ställ in polymeraskedjereaktionsbetingelserna (PCR) vid 94 °C i 2 minuter, 30 cykler med 94 °C i 20 s, 58 °C i 20 s, 65 °C i 1 minut och 65 °C i 10 minuter (slutlig förlängning).
  2. Utför PCR-reaktioner med en högupplöst PCR-mastermix (Table of Materials).
  3. Generera bibliotek med DNA-biblioteksförberedelsekit och sekvensera sedan med hjälp av parad sekvensering på en sekvenseringsplattform.
    OBS: Här sekvenserades biblioteken som genererades med NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit med hjälp av Illumina-sekvensering med parad ände (2 × 250 bp) på novaseq6000-plattformen.
  4. Följ stegen för sekvensering:
    1. Steg 1: Klipp DNA med ett enzym, vanligtvis med en metod som selekterar för en allmän storlek.
      1. Tillsätt 3,5 μL sekvenseringsbuffert och 1,5 μL enzymblandning till 25 μL DNA (ca. 1 μg,) blanda 10 gånger med en pipett och centrifugera snabbt.
      2. Placera i en termocykler under följande förhållanden: förvärm locket vid 75°C, (1) 30 min i 20 °C (2) 30 min i 65 °C (3) håll vid 4°C.
    2. Steg 2: Lägg till adaptrar via ligering
      1. Tillsätt 15 μL ligation master mix, 1,25 μL adapter, 0,5 μL ligeringsförstärkare och 30 μL end prep DNA-blandning med en pipett.
      2. Inkubera vid 20 °C i 15 minuter i en termocykler och tillsätt sedan 1,5 μL enzym för uracilspecifikt excisionsreagens (USER) till ligeringsblandningen så att totalt 48,26 μL erhålls. Inkubera 37 °C i 15 min.
      3. Tillsätt 43,5 μL magnetiska pärlor till adapterligerings-DNA, blanda 20 gånger med en pipett och inkubera i 5 minuter vid RT. Separera pärlorna med ett magnetiskt ställ, inkubera sedan i 5-10 minuter och kassera supernatanten.
      4. Tvätta pelleten med 100 μL 80 % etanol, torka i 30 s och tvätta igen. Eluera pärlor och pellet i 8,5 μL 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, blanda med en pipett och inkubera vid RT i 2 min.
      5. Inkubera i magnetstället och avlägsna 7,5 μL eluerat DNA som supernatant. Placera elueringen i ett nytt rör och utför ett PCR-steg.
      6. Tillsätt först 12,5 μL mastermix, 2,5 μL indexprimer i7-primer och 2,5 μL universell PCR-primer/i5-primer till 7,5 μL adapter-ligerat DNA för att erhålla 25 μL PCR-reaktionsmix. Använd följande PCR-tillstånd: förvärm locket till 103 °C. 98 °C i 30 s, 98 °C i 10 s, 65 °C i 75 s, 65 °C i 5 minuter och håll i 4 °C efter 10 cykler.
      7. Rengör 25 μL amplifierat DNA. Tillsätt 22,5 μL magnetiska pärlor och blanda 20 gånger. Inkubera vid RT i 5 minuter och avlägsna 50 μl av supernatanten. Tvätta pärlorna med 100 μL 80 % etanol och ta bort all etanol genom att torka pärlorna försiktigt i 30 s.
      8. Blanda de mörkbruna pärlorna i 16 μL vatten, blanda 20 gånger med en pipett och placera i magnetstället i 30-60 s. Överför 15 μL till ett nytt rör.
      9. Bestäm DNA-koncentrationen med hjälp av en fluorometer. Blanda 90 μL buffert + 1 μL färgämne + 2 μL DNA-biblioteksprov och läs av koncentrationen. Späd DNA till 2 nM, ladda 27-30 μL till flödescellen och placera det i sekvenseraren.
    3. Steg 3: Sekvensera adaptrarna, hybridisera biblioteken som genereras ovan till matrisen i den mönstrade flödescellen och fånga DNA enligt tillverkarens instruktioner. Använd den som mall för den andra syntesen.
      1. Förstärk sedan den andra strängen till ett klonalt kluster. Linjärisera klustret och blockera de aktiva platserna. Lägg till sekvenseringsprimer för att tillhandahålla en plats för sekvensering genom syntes i sekvensen enligt tillverkarens protokoll.
        OBS: Kemiskt binder de modifierade nukleotiderna till DNA-mallsträngen med hjälp av naturlig komplementaritet. Varje nukleotid har en fluorescerande tagg och en reversibel terminator som blockerar inkluderingen av nästa bas. Därför indikerar närvaron av en fluorescerande signal vilken nukleotid som sätts in, och terminatorn klyvs för att nästa bas ska binda.
    4. Steg 4: Förstärk den enkelbundna strängen för att ge kluster av sekvenser som sekvenseras i tandem genom syntes.
      OBS: Klustren ger en ljusare signal än en enda sträng genom dubbelriktad skanning och tvåkanalig sekvenseringskemi. Sekvenseringsprogrammet överför automatiskt basanropsfiler (*.cbcl) till den angivna utdatamappens plats för dataanalys.

5. Bioinformatik

  1. Generera sekvensdata som FASTQ-filer. Analysera för att inkludera följande delar.
    1. Del I:
      1. Spara FASTQ-filerna som erhållits från sequencern, klicka för att öppna en kalkylbladsfil och skapa mappnings-/metadatafiler.
      2. Öppna Nephele webwebbplats (https://nephele.niaid.nih.gov/), ladda upp FASTQ-filerna, läs QC, filtrering och trimning i QIIME222. Deponera råsekvenserna som sekvensläsningsarkiv (SRA) och GenBank i NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. Del II: Gå till Nepheles webbplats (https://nephele.niaid.nih.gov/), gör demultiplexerade parade läsningar, filtersubstitution och chimärfel och sammanfoga med DADA223. Använd Naive Bayes-klassificeraren som tränats på Silva version 132 99 % OTU-databasen för att utföra bakteriell taxonomisk tilldelning med 97 % likhet24.
    3. Del III: Öppna MicrobiomeDB-webbplatsen, klicka för att ladda upp filer och generera OTU-alfadiversitet, betadiversitet, relativ abundans och sällsynthetskurvor (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. Del IV: Öppna ett kalkylblad och överför data för att skapa värmekartor, Venndiagram och linjär diskriminantanalys effektstorlek (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Statistisk analys

  1. Öppna QIIME222 och bestäm de signifikanta skillnaderna i alfadiversitet mellan grupper med hjälp av alfabetet alfagruppssignifikans. Detta kommer också att utföra Kruskal-Wallis-testet.
  2. Bestäm skillnaderna i betadiversitet mellan grupper med hjälp av PERMANOVA, inklusive ett parvis test25.
  3. Erhåll de signifikanta skillnaderna i bakteriesamhällets struktur mellan grupperna med hjälp av MicrobiomeDB. Ett p-värde ≤0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvantiteten och kvaliteten på DNA som extraherats från druvmust, jäsande vin och slutvin bestämdes först. kvantitetsvärdet varierar från 15-87 ng/μL (tabell 1).

Sekvensering och bioinformatik
Illumina-sekvenseraren med hög genomströmning genererade en FASTQ-fil som importerades till Nephele och visades på QIIME2-plattform 26. För det första användes FastQC-programvara för att kontrollera sekvenskvaliteten. Sedan trimmades den i både 5'- och 3'- ändar för att eliminera nukleotider av dålig kvalitet, denoised, sammanslagen och utarmad av chimära sekvenser innan den klustrades till OTU:er (operativ definition för en art) med hjälp av DADA2 denoiser23. De mappades till bakterietaxa med hjälp av databasen SILVA v138.1. Sekvenserna grupperades i OTU baserat på 99% nukleotidsekvenslikhet. Figur 1 visar DADA2-sällsynthetskurvorna för OTU:erna; Den nådde en platå. Detta indikerade att tillräckligt många sekvenser täcktes för att indikera majoriteten av den mikrobiella mångfalden. Replikatanalys av sekvenserna genererade ingen signifikant skillnad.

Värmekartan baserad på den relativa förekomsten av bakterierna vid olika regimer från druvmust till vin visas i figur 2. De mest dominanta fyla som anges i rött består av Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota och, följt av Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota och Acidobacteriota. De minst förekommande bakterierna indikerades i blått. Många av dessa grupper fanns i must, när jäst tillsattes men frånvarande under jäsningen, särskilt Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota och Elusimicrobiota. Den relativa abundansen bestämdes också på genusnivå, och resultaten indikerade viktiga släkten som Enterobacteriaceae och Lactobacillaceae, som visas i figur 3. En Venndiagramanalys av den delade unika OTU:n avslöjade att 15 bakterier fanns från vindruvmusten till det slutliga vinet (figur 4). Resultaten av amplikonsekvenseringen baserad på den V4-variabla regionen indikerade också alfadiversiteten i de två Traminette R och L. Figur 4 visar artens jämnhet som en markering av fördelningen, vilket skiljer sig mellan de två näringsbehandlingarna. Data visade att diversitetsförändringen i Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O var lägre än 1 vid 13,4 brix, och jämnheten närmar sig noll eftersom den relativa förekomsten varierar. Data analyserades också för betadiversitet; Figur 5 visar skillnaden mellan de två jäsningsämnena Traminette R och L; Bakterierna var likartade i must- och jäststadiet. Det skedde en förskjutning av bakterierna i jäsningsstadiet för de två behandlingarna, och det ser likadant ut i det slutliga vinet (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Rarefaktionsdiagram för observerade OTU:er. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Värmekarta över relativ förekomst. Värmekartan över den relativa abundansen på fylumnivåerna R och L skilde sig inte signifikant (p ≤0,05). Förklaringsfältet anger nyckelpoängen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Relativ förekomst av de tio främsta taxa. Den relativa abundansen på genusnivå för de tio bästa taxa rangordnade av media med Wilcoxons rangsummatest (p ≤0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Venndiagram. De unika och gemensamma bakterierna bland must, jäst, jäsning och vin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Alfadiversitet hos Traminette R och Traminette L. Alfadiversitet av Shannons H-index för de två näringsrika Fermaid O och Stimula Sauvignon blanc och Fermaid O (Dunn > 0,05) baserat på analysen av Kruskal-Wallis-testet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Analys av huvudkomponenten. Huvudkomponentanalys av 16S rRNA-data för betadiversitet baserad på Bray-Curtis av de två näringsrika Fermaid O och Stimula Sauvignon Blanc och Fermaid O i olika stadier av vinproduktionen. Den blå cirkeln representerar ett kluster av must- och jästtillsatssteg. Den röda cirkeln indikerar det slutliga vinet och den svarta cirkeln är jäsningssteget i de två behandlingarna. Axel 1 och 2 är variationer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Datum för provtagning Prov A260/A280 Koncentration ng/μL Traminette R A260/A280 Koncentration ng/μL Traminette L
8/30/21 Druva 1.762 37 1.75 28
8/31/31 Måste 1.769 23 1.818 20
09-02-2021 Vila 1.667 15 -1 1
09-04-2021 Jäst tillsatt 2.185 59 1.968 61
09-06-2021 Jäsa 2.023 87 2.048 43
09-09-2021 Jäsa 3.4 17 2.048 43
9/14/21 Slutligt vin 2.143 30 2.042 49

Tabell 1: Kvantitet och kvalitet på DNA som extraherats från druvmust, vin som jästs och slutvin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet för metagenomik börjar med provtagningen av druvmusten, och när jäst tillsattes till musten, det jäsande vinet och de slutliga vinproverna. Detta följdes av duplicerad DNA-extraktion som framgångsrikt extraherades från dessa prover. De erhållna mängderna varierade i koncentration från 15 ng / μL till 87 ng / μL. Detta visar att DNA-extraktionsprotokollet är effektivt för metagenomiska studier av vin. Även om kvaliteten på DNA vid A260/A280 varierar, kan detta tillskrivas olika parametrar som kan påverka extraktionen, såsom alkoholkoncentration och andra jäsningsmetaboliter som utvecklats under och efter jäsning, samt andra organiska växtmaterial som kan hämma genomextraktion. Tidigare studier har rapporterat en liknande observation på det metagenomiska växtmaterialet27. Det DNA som extraherades i det beskrivna protokollet uppnådde dock en mängd som räckte för nästa steg i analysen. PCR-streckkodningen som behövs för metagenomiska studier, särskilt med hjälp av Illumina-sekvenseringsplattformen, kräver att den minsta DNA-mängden fastställs till 1 ng/L. V4-regionen sekvenserades, och bestämningen av den bakteriella mångfalden kräver användning av 16S rRNA-gensekvensering; denna gen har olika variabla regioner från V1-V923. Totalt 6 393 443 parade sekvensavläsningar med ett genomsnitt på 399590,1875 ± 138442,6148 från DNA som extraherats från de olika proverna. V4 har använts ofta, och det kallas den hypervariabla regionen av genen som är bra för bakteriell taxonomisk och diversitetsanalys. Under sekvenseringen genererades parade Illumina-sekvenser med ca 200-300 bp. Det finns olika plattformar som används för att sekvensera DNA extraherat från livsmedel och fermenterade drycker28. Skälen för att använda Illumina-plattformen är följande: (1) Illumina är en 2:a andra generationens sekvenseringsplattform med utmärkt resultat, och dess kemi ger en låg felfrekvens och profil. Den är också prisvärd jämfört med tillgängliga kommersiella kit för biblioteksförberedelser, och dess relativt korta läsningar är idealiska för differentiellt uttryck. Det sista steget i protokollet var bioinformatik, en viktig komponent i användningen av amplikon 16-sekvensering för bestämning av mikrobiell mångfald. Kvalitetskontrollen av de sekvenser som FASTQ-filen erhöll var mycket bra, och OTU:erna som erhölls från QIIME resulterade i en taxonomisk analys som visades i resultaten av relativ abundans, alfa- och betadiversitet.

Nästa generations sekvensering (NGS) har blivit ett viktigt verktyg för att profilera bakterierna i olika mikrobiella samhällen i fermenteringen. I denna studie gjordes 16S-ampliconklassificeringen först på fylumnivå, och en mer varierad grupp av bakterier noterades än vad som tidigare rapporterats12 under druvvinsjäsning; 15 fyla delades också, vilket framgår av analysen av Venn-resultatet. Analyser på släktnivå visade också förekomsten av viktiga släkten, såsom Enterobacteriaceae och Lactobacillaceae, som var vanligare i Traminette R-akvariet. Vi begränsade vår analys till taxonomi på genusnivå; Det finns studier där metoden har använts för identifiering på artnivå taxonomi genom högupplöst provinferens23. En av begränsningarna med amplikonsekvensering är att sekvensdata inte kan bestämma taxonomi på stamnivå på grund av den korta längden på 16S rRNA-sekvensen. En annan begränsning är detektion av kloroplast och mitokondrier. Det är önskvärt om det bioinformatiska förfarandet kan användas för att eliminera dessa sekvenser eftersom de är föroreningar av druvväxter. Amplifieringsprotokoll som använder PNA-DNA-klämmor för att maximera kloroplast- och mitokondriekontaminering29. Den höga förekomsten av Firmicute i druvor måste, under jäsning och slutvin, stämma överens med tidigare studier på vindruva30. Resultaten av alfadiversitetsanalysen indikerade bakteriernas jämnhet för varje fermenteringsnäringsbehandling; det verkar som om näringsämnet Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O genererade en mer varierad bakterie. Dessutom visade betadiversitetsdata förändringen i bakterierna i jäsningsstadiet; Dynamiska förändringar indikerar att jäsningsstadiet är en mycket viktig period där näringsförändringarna påverkar bakterieurvalet. Tekniken kan anpassas och användas av industrier för att övervaka jäsningen och förbättra kvaliteten och konsistensen28. Ytterligare studier kommer dock att behövas för att bättre förstå de organiska näringsämnenas inverkan på den mikrobiella mångfalden under vinjäsningen.

Denna studie är den första som undersöker bakteriediversiteten under jäsningen av Traminette-druvor och vin med hjälp av 16S amplicon-streckkodssekvensering för att bestämma bakterieförändringarna. Detta bekräftade mångfalden av bakterier på fylum- och genusnivå. Proteobakterier, följt av Firmicutes, var vanligast när jäsningen fortskred till det slutliga vinet. Många fyla som inte tidigare rapporterats upptäcktes med hjälp av 16S-sekvenseringen, och detta bekräftade att metoden kan användas för att övervaka vinproduktionen. Alfadiversitet visade betydelsen av näringsförändringar; Det påverkade fermenteringsbakterierna, medan betadiversitet indikerar förändringarna under jäsningsstadiet. Ytterligare studier behövs för att undersöka de funktionella roller som många av de beskrivna fyla och släktena spelar i vinjäsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Finansiering från Appalachian State University Research Council (URC) och CAPES Print Travel-stipendium som stödde FAO:s besök vid Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasilien, är tacksamma. Denna studie finansierades delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. ECPDM är tacksamma för CAPES Print Travel-stipendium som stödde hennes besök på Appalachian State University. ECPDM är en forskare 2 från Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasilien (CNPq).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel  Promega, Madison, WI USA V3121 Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil  MP Biomedicals, Solon, OH USA 116560-200 DNA extraction 
FastQC software Babraham Institute, United Kingdom Bioinformatics 
Fermaid O Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix  New England Biolabs, USA F630S Polymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext Ultra New England Biolabs, USA NEB #E7103 DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS) Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
Novaseq6000 platform  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
QuiBit Thermoscientific, Waltham, MA, USA DNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer  Molecular device, San Jose, CA, USA DNA quantification 
Sodium Phosphate  Sigma Aldrich 342483 DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
  2. Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
  3. Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
  4. Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
  5. Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
  6. Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
  7. Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
  8. Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
  9. Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
  10. Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
  11. Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
  12. Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
  13. Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
  14. Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
  15. Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
  16. Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
  17. Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
  18. Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
  19. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).
  20. Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
  21. Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
  22. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
  23. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  24. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  25. Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
  26. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  27. Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
  28. van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
  29. Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
  30. Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).

Tags

Biologi utgåva 202
Profilering av bakteriesamhället i jäsande traminettedruvor under vinproduktion med hjälp av metagenomisk ampliconsekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goppold, A., Conradie, L., Almeida,… More

Goppold, A., Conradie, L., Almeida, O. G. G. d., De Martinis, E. C. P., Oguntoyinbo, F. A. Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (202), e65598, doi:10.3791/65598 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter