Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Beschreibung der Amplikon-Metagenomik zur Bestimmung der Bakteriengemeinschaft von Traminette-Trauben, gärenden Trauben und Endwein vor.
Abstract
Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie und der relativ einfache Zugang zur Verwendung von Bioinformatik-Tools zur Profilierung mikrobieller Gemeinschaftsstrukturen haben ein besseres Verständnis sowohl kultivierbarer als auch nicht kultivierbarer Mikroben in Trauben und Wein ermöglicht. Während der industriellen Fermentation sind bekannte und unbekannte Mikroben oft für die Produktentwicklung und den Fehlgeschmack verantwortlich. Daher kann die Profilierung der Bakterien von der Traube bis zum Wein ein einfaches Verständnis der mikrobiellen Dynamik in situ ermöglichen. In dieser Studie wurden die Bakterien des Gärungsmostes der Traminette-Trauben und der endgültige Wein einer DNA-Extraktion unterzogen, die 15 ng/μl bis 87 ng/μl ergab. Das 16S-Amplikon der hypervariablen Region der V4-Region wurde sequenziert, relativ häufige Bakterien, bestehend aus den Stämmen Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota und gefolgt von der Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota und Acidobacteriota. Eine Venn-Diagramm-Analyse der gemeinsamen einzigartigen operativen taxonomischen Einheiten (OTU) ergab, dass 15 Bakterienstämme sowohl dem Traubenmost, der Gärphase als auch dem endgültigen Wein gemeinsam waren. Phyla, die zuvor nicht berichtet wurden, wurden mit der 16S-Amplikon-Sequenzierung nachgewiesen, ebenso wie Gattungen wie Enterobacteriaceae und Lactobacillaceae. Variationen in der Verwendung organischer Nährstoffe in Wein und ihre Auswirkungen auf Bakterien wurden getestet; Traminette R-Tank mit Fermaid O und Traminette L , stimuliert mit Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Die Alpha-Diversität mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests bestimmte den Grad der Gleichmäßigkeit. Die Beta-Diversität deutete auf eine Verschiebung der Bakterien in der Gärungsphase für die beiden Behandlungen hin, und die endgültigen Weinbakterien sahen ähnlich aus. Die Studie bestätigte, dass die 16S-Amplikon-Sequenzierung zur Überwachung von Bakterienveränderungen während der Weinproduktion verwendet werden kann, um die Qualität und bessere Nutzung von Traubenbakterien während der Weinproduktion zu unterstützen.
Introduction
Die Traminette-Traube zeichnet sich durch eine Produktion von höchster Weinqualität aus, zusätzlich zu einem beträchtlichen Ertrag und einer teilweisen Resistenz gegen verschiedene Pilzinfektionen 1,2,3. Die natürliche Gärung von Trauben hängt von assoziierten Mikroorganismen, der Weinproduktionsumgebung und den Gärgefäßenab 4,5. Oft verlassen sich viele Weingüter auf wilde Hefen und Bakterien für die Gärung, die Produktion von Alkohol, Estern, Aroma und Geschmacksentwicklung6.
Ziel dieser Studie ist es, die bakterielle Zusammensetzung von Trauben zu untersuchen und ihre Dynamik während der Gärung zu überwachen. Die moderne Verwendung von Starterkulturen wie Saccharomyces cerevisiae für die Primärgärung, bei der Alkohol produziert wird, ist jedoch bei verschiedenen Weinstilen üblich7. Darüber hinaus verbessert die Nachgärung, bei der Apfelsäure von Oenococcus oeni zu Milchsäure decarboxyliert wird, das organoleptische und Geschmacksprofil des Weins und reduziert den Säuregehalt des Weins 8,9. Mit den jüngsten Fortschritten bei der Verwendung kulturunabhängiger Methoden ist es nun möglich, verschiedene Mikroben zu bestimmen, die mit der Keltertraube assoziiert sind, und die Arten, die in den Most überführt werden und zu unterschiedlichen Zeitpunkten bis zum Endprodukt an der Gärung teilnehmen10.
Die Rolle und Dynamik von Wildbakterien aus verschiedenen Trauben, die während der Weingärung auf den Most übertragen werden, sind kaum verstanden. Die Taxonomie vieler dieser Bakterien ist nicht einmal bekannt, oder ihre phänotypischen Eigenschaften sind nicht charakterisiert. Dadurch wird ihre Anwendung in der Kokulturfermentation noch wenig genutzt. Mikrobiologische kulturbasierte Analysen wurden jedoch verwendet, um die Bakterienpopulation zu bestimmen, die mit Trauben und Wein assoziiert ist10. Es ist allgemein bekannt, dass die selektive Kulturbeschichtung langwierig und anfällig für Verunreinigungen ist, eine geringe Reproduzierbarkeit aufweist und die Ergebnisse zweifelhaft sein können. Es fehlen auch Bakterienarten, deren Wachstumsanforderungen unbekannt sind. Frühere Studien deuten darauf hin, dass kulturunabhängige, auf 16S-rRNA-Genen basierende Methoden einen zuverlässigeren und kostengünstigeren Ansatz zur Charakterisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften bieten11. Beispielsweise wurde die Sequenzierung der hypervariablen Regionen des 16S rRNA-Gens erfolgreich eingesetzt, um Bakterien in Weinblättern, Beeren und Wein zu untersuchen 12,13,14. Studien haben gezeigt, dass die Verwendung von 16S rRNA-Metabarcoding oder ganzer metagenomischer Sequenzierung für Mikrobiomstudien geeignet ist15. Es gibt neue Informationen über den möglichen Zusammenhang der bakteriellen Vielfalt mit ihren metabolischen Eigenschaften während der Weinproduktion, die bei der Bestimmung der önologischen Eigenschaften und des Terroirs helfen könnten16.
Die Notwendigkeit, die Vorteile der metagenomischen Werkzeuge durch Next-Generation-Sequencing (NGS) zur Untersuchung der mikrobiellen Ökologie von Trauben und Wein zu maximieren, wurde betont16,17. Auch der Einsatz kulturunabhängiger Methoden auf der Grundlage der Hochdurchsatzsequenzierung zur Profilierung der mikrobiellen Vielfalt des Lebensmittel- und Fermentationsökosystems ist für viele Labore sehr relevant und wertvoll geworden und wird für den industriellen Einsatz empfohlen18,19. Es bietet einen Vorteil bei der Erkennung und taxonomischen Profilierung der vorhandenen mikrobiellen Populationen und des Beitrags von Umweltmikroben, ihrer relativen Häufigkeit und der Alpha- und Beta-Diversität20. Die Sequenzierung der variablen Region der 16S-Region ist zu einem wichtigen Gen der Wahl geworden und wurde in verschiedenen mikrobiellen ökologischen Studien verwendet.
Während sich viele Studien auf Pilze, insbesondere Hefen, während der Weingärung konzentrieren21, berichtete diese Studie über die 16S-Amplikon-Sequenzierung und bioinformatische Werkzeuge, die zur Untersuchung der Bakterien während der Gärung von Traminette-Trauben für die Weinproduktion verwendet werden.
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Protocol
1. Experimentelle Weinproduktion
- Beziehen Sie Traminnette-Trauben von Dynamis Estate-Wein im Weinberg Jonesville, North Carolina, entrappen und zerkleinern, um den Most in zwei separate offene 600-Liter-Gärbehälter zu geben und etwa 4 Tage lang mit aufgesetzten Deckeln auf den Schalen zu belassen.
- Schlagen Sie die Kappen einmal täglich nach unten, um die Haut feucht zu halten und die Produktion flüchtiger Säuren (VA) zu begrenzen.
HINWEIS: Die Idee ist, dass sich viele der aromatischen Vorläufer (Monoterpene) in den Schalen befinden und den Saft in Kontakt mit der Haut lassen, um das aromatische Potenzial des Weins zu erhöhen. - Nach 4 Tagen Pech Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Diese Hefe wurde ausgewählt, da sie ein starker Gärer ist und mit der Verbesserung des Sortencharakters im Wein aus den Trauben verbunden ist.
- In einem Tank, Traminette R, 20 g/hL Fermaid O bei einem Brix von 17,7 und 20 g/hL Fermaid O und 12,5 g/hL Fermaid K bei 13,1 g/hL hinzufügen, um Gärsicherheit zu erreichen, während im anderen Tank, Traminette L, 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc bei einem Brix von 17,1 hinzugefügt werden. Bei einem Brix-Wert von 13,4 auch 20 g/hL Fermaid O hinzufügen, um den Sortencharakter des Weins zu verbessern.
- Doppelte Proben von Most (Tag 1), hinzugefügter Hefe (Tag 4), fermentiertem Most (Tag 15) und fertigen Weinproben (Tag 30) entnehmen und vor der DNA-Extraktion und metagenomischen Analyse bei -20 °C aufbewahren.
2. DNA-Extraktion für die Metagenomik
- Bewahren Sie alle oben gewonnenen doppelten Proben bis zur ersten Zentrifugation auf Eis auf.
- 20 ml der fermentierten Probe werden in ein steriles 50-ml-Schraubverschlussröhrchen überführt.
- 10 ml kaltes Wasser hinzufügen und homogenisieren (Vortex). 1 min bei 800 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen überführen.
HINWEIS: In diesem Schritt werden die Feststoffe der Probe entfernt. - Schritt 2.3 zweimal wiederholen und die Überstände im selben Röhrchen bündeln.
- Überstand bei 3.000 x g bei 4 °C 20 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand.
- Das Pellet in 1 ml PBS resuspendieren, in ein 2-ml-Schraubverschlussröhrchen umfüllen und 2 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugieren. Führen Sie zwei weitere Wäschen mit PBS durch.
- Frieren Sie die Pellets in diesem Schritt bei -20 °C ein oder befolgen Sie Schritt 2.8. Es ist wichtig, dass alle Proben gleich behandelt werden.
- Fügen Sie 978 μl Natriumphosphatpuffer hinzu. Natriumphosphatpuffer herstellen, 3,1 g NaH2PO4· H2O und 10,9 g Na2HPO4 (wasserfrei) zu destilliertem H2O zu einem Volumen von 1 l und pH-Wert auf 7,4 einstellen.
- 122 μl DNA-Puffer (DNA-Spin-Kit) hinzufügen und vortexen.
- Im Kühlschrank (4 °C) 45 min-1 h stehen lassen. Wirbeln Sie die Proben alle 15 min. Dieser Schritt kann über Nacht (o/n) oder bis zur weiteren Verwendung des DNA-Spin-Kits belassen werden.
- Übertragen Sie 1 ml Probe in ein Lyselösungsröhrchen 1 (DNA-Spin-Kit) und ziehen Sie die Kappe fest (schreiben Sie die Probennummer auf die Seite des Röhrchens und nicht auf die Kappe; die Kit-Reagenzien entfernen alles, was auf der Kappe steht).
- Die Probe wird in einem Perlbrecher (6,5 m/s, CY: 24 x 2) dreimal 60 s lang homogenisiert. Wenn die Perlmühle über die Vorrichtung zum Einfüllen von Eis verfügt, geben Sie 50 g Trockeneis unter die Röhrchen. Wenn nicht, bewahren Sie die Proben zwischen den einzelnen Homogenisierungsschritten 5 Minuten lang auf nassem Eis auf.
- Zentrifugieren Sie Lysing Matrix E-Röhrchen (DNA-Spin-Kit) für 1 Minute bei 16800 x g (oder maximaler Geschwindigkeit).
- Den Überstand in ein sauberes Mikroröhrchen geben. Fügen Sie danach 250 μl Reagenz für Proteinfällungslösung (PPS) (DNA-Spin-Kit) hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen 10 Mal von Hand schütteln.
- 5 min bei 16800 x g zentrifugieren, um den Niederschlag zu pelletieren.
- Den Überstand in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführen. Geben Sie 1 ml Bindungsmatrixsuspension (DNA-Spin-Kit) in den Überstand.
HINWEIS: Suspendieren Sie die Bindungsmatrixsuspension vor der Verwendung, bis sie homogen ist. - Drehen Sie die Röhrchen 2 Minuten lang von Hand um und lassen Sie die Röhrchen dann 3 Minuten lang in einem Gestell stehen (damit sich die Kieselsäurematrix absetzen kann).
- Entfernen Sie vorsichtig 1 ml des Überstands. Die Matrix wird im verbleibenden Überstand resuspendiert.
- 600 μl der Mischung in ein Spin-Filterröhrchen (DNA-Spin-Kit) überführen und 1 min bei 14500 x g zentrifugieren.
- Die restliche Mischung hinzufügen und zentrifugieren.
- Durchfluss dekantieren und 500 μl Waschlösung (DNA-Spin-Kit) in das Schleuderfilterröhrchen geben und 1 Minute bei 14500 x g zentrifugieren (EtOH zur Waschlösung hinzufügen; siehe Produkthandbuch). Dekantieren Sie den Durchfluss und wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male (insgesamt 3 Wäschen).
- Dekantieren Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie weitere 2 Minuten bei 14.500 x g , um die Matrix der restlichen Waschlösung zu trocknen.
- Entfernen Sie den Schleuderfilter und legen Sie ihn in ein frisches Auffangröhrchen (DNA-Spin-Kit). Trocknen Sie den Schleuderfilter 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) an der Luft.
- Erwärmen Sie das DNAse-freie Wasser (DNA-Spin-Kit) bei 55 °C für 5 min. Fügen Sie 50 μl DNAse-freies Wasser hinzu und rühren Sie die Matrix vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf der Filtermembran um, um eine effiziente Elution der DNA zu erzielen. Lassen Sie die Proben 1 Minute lang bei RT stehen und zentrifugieren Sie sie dann 1 Minute lang bei 14500 x g , um die DNA zu eluieren.
- Legen Sie die Proben auf Eis. Laden Sie die Probenmischung (2 μl Probe + 2 μl Wasser + 1 μl Ladepuffer) in ein Gel. Messen Sie die DNA-Konzentration.
- Lagern Sie die Proben bei -20 °C.
- Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die extrahierte DNA zu quantifizieren.
HINWEIS: Ein Volumen von 1 μl DNA wurde fallen gelassen und quantifiziert, und die Qualität der DNA wurde in einem Verhältnis von A260/A280 festgestellt.
3. DNA-Elektrophorese
- Bereiten Sie 1% Agarose-Gel in 0,5 Tris/Borat/EDTA (FSME)-Puffer vor (20 ml für ein Mini-Gel, 70-100 ml für ein mittleres Gel). Agarose + Puffer wiegen, in der Mikrowelle kochen, um Agarose zu schmelzen, erneut wiegen und dH2O zum Originalgewicht hinzufügen. Die Agaroselösung auf 55-60 °C abkühlen lassen und in den Gelbildner mit Kammaufbau gießen. Lassen Sie das Gel fest werden.
- Geben Sie 1 μl 10x Gelladepuffer in die Probe (10 μl) und laden Sie es neben einem Molekulargewichtsmarker auf das Gel. Von negativ (schwarz) nach positiv (rot) bei 100-115 V (großes Gel) oder 90 V (Mini-Gel) laufen, bis sich der blaue Farbstoff in der Nähe des Bodens befindet.
- Färben Sie das Gel 30 Minuten lang in 1 μl/ml Ethidiumbromid oder SYBR-Grün (Nitrilhandschuhe und Schutzbrille erforderlich), spülen Sie es in Wasser ab und betrachten Sie es unter einer ultravioletten (UV) Lichtquelle. Wählen Sie aus den doppelten Proben die höchste Ausbeute für die weitere Verarbeitung aus.
4. Hochdurchsatz-Sequenzierung
- Amplifizieren Sie die hypervariable V4-Region des 16S rRNA-Gens mit den spezifischen Primern 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') und 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Stellen Sie die Bedingungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf 94 °C für 2 min, 30 Zyklen von 94 °C für 20 s, 58 °C für 20 s, 65 °C für 1 min und 65 °C für 10 min (letzte Verlängerung) ein.
- Führen Sie PCR-Reaktionen mit einem High-Fidelity-PCR-Mastermix durch (Table of Materials).
- Generieren Sie Bibliotheken mit einem DNA-Bibliotheksvorbereitungskit und sequenzieren Sie dann mit Paired-End-Sequenzierung auf einer Sequenzierungsplattform.
HINWEIS: Hier wurden die mit dem NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit generierten Bibliotheken mittels Paired-End-Illumina-Sequenzierung (2 × 250 bp) auf der novaseq6000-Plattform sequenziert. - Befolgen Sie die Sequenzierungsschritte:
- Schritt 1: Scheren Sie die DNA mit einem Enzym, normalerweise durch eine Methode, die für eine allgemeine Größe selektiert.
- 3,5 μl Sequenzierpuffer und 1,5 μl Enzymmix zu 25 μl DNA (ca. 1 μg) geben, 10 mal mit einer Pipette mischen und schnell schleudern.
- In einen Thermocycler unter folgenden Bedingungen geben: Deckel auf 75 °C vorheizen, (1) 30 min auf 20 °C (2) 30 min auf 65 °C (3) bei 4 °C halten.
- Schritt 2: Adapter über Ligation hinzufügen
- Fügen Sie mit einer Pipette 15 μl Ligations-Mastermix, 1,25 μl Adapter, 0,5 μl Ligationsverstärker und 30 μl End-Prep-DNA-Mix hinzu.
- Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 20 °C in einem Thermocycler und geben Sie dann 1,5 μl uracilspezifisches Exzisionsreagenz (USER)-Enzym in die Ligationsmischung, um insgesamt 48,26 μl zu erhalten. Inkubieren Sie 37 °C für 15 Minuten.
- Fügen Sie 43,5 μl magnetische Beads zur Adapterligations-DNA hinzu, mischen Sie sie 20 Mal mit einer Pipette und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei RT. Trennen Sie die Beads mit einem Magnetgestell, inkubieren Sie dann 5-10 Minuten lang und entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das Pellet mit 100 μl 80% Ethanol, trocknen Sie es 30 s lang und waschen Sie es erneut. Eluieren Sie die Kügelchen und das Pellet in 8,5 μl 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, mischen Sie sie mit einer Pipette und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang bei RT.
- Im Magnetgestell inkubieren und 7,5 μl eluierte DNA als Überstand entfernen. Legen Sie die Elue in ein neues Röhrchen und führen Sie einen PCR-Schritt durch.
- Fügen Sie zunächst 12,5 μl Mastermix, 2,5 μl Index-Primer i7-Primer und 2,5 μl universellen PCR-Primer/i5-Primer zu 7,5 μl adapterligierter DNA hinzu, um 25 μl PCR-Reaktionsmix zu erhalten. Verwenden Sie die folgende PCR-Bedingung: Heizen Sie den Deckel auf 103 °C vor. 98 °C für 30 s, 98 °C für 10 s, 65 °C für 75 s, 65 °C für 5 min und halten Sie ihn nach 10 Zyklen bei 4 °C.
- Reinigen Sie die 25 μl amplifizierte DNA. Fügen Sie 22,5 μl Magnetkügelchen hinzu und mischen Sie 20 Mal. 5 Minuten bei RT inkubieren und 50 μl des Überstands entfernen. Waschen Sie die Kügelchen mit 100 μl 80%igem Ethanol und entfernen Sie das gesamte Ethanol, indem Sie die Kügelchen 30 s lang vorsichtig trocknen.
- Die dunkelbraunen Kügelchen in 16 μl Wasser resuspendieren, 20 Mal mit einer Pipette mischen und für 30-60 s in das Magnetgestell legen. 15 μl in ein neues Röhrchen umfüllen.
- Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Mischen Sie 90 μl Puffer + 1 μl Farbstoff + 2 μl DNA-Bibliotheksprobe und lesen Sie die Konzentration ab. Verdünnen Sie die DNA auf 2 nM, laden Sie 27-30 μl in die Durchflusszelle und legen Sie sie in den Sequenzierer.
- Schritt 3: Sequenzieren Sie die Adapter, hybridisieren Sie die oben generierten Bibliotheken mit der Matrix der gemusterten Durchflusszelle und erfassen Sie DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie es als Vorlage für die zweite Synthese.
- Amplifizieren Sie dann den zweiten Strang zu einem klonalen Cluster. Linearisieren Sie den Cluster und blockieren Sie die aktiven Standorte. Fügen Sie einen Sequenzierungsprimer hinzu, um einen Ort für die Sequenzierung durch Synthese in der Sequenz gemäß dem Protokoll des Herstellers bereitzustellen.
HINWEIS: Chemisch binden die modifizierten Nukleotide durch natürliche Komplementarität an den DNA-Matrizenstrang. Jedes Nukleotid hat eine fluoreszierende Markierung und einen reversiblen Terminator, der den Einschluss der nächsten Base blockiert. Daher zeigt das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals an, welches Nukleotid eingefügt wird, und der Terminator wird gespalten, damit die nächste Base binden kann.
- Amplifizieren Sie dann den zweiten Strang zu einem klonalen Cluster. Linearisieren Sie den Cluster und blockieren Sie die aktiven Standorte. Fügen Sie einen Sequenzierungsprimer hinzu, um einen Ort für die Sequenzierung durch Synthese in der Sequenz gemäß dem Protokoll des Herstellers bereitzustellen.
- Schritt 4: Amplifizieren Sie den einfach gebundenen Strang, um Cluster von Sequenzen zu erhalten, die durch Synthese zusammen sequenziert werden.
HINWEIS: Die Cluster geben durch bidirektionales Scannen und Zweikanal-Sequenzierungschemie ein helleres Signal als ein einzelner Strang. Die Sequenzierungssoftware überträgt Basisaufrufdateien (*.cbcl) automatisch zur Datenanalyse an den angegebenen Ausgabeordnerspeicherort.
- Schritt 1: Scheren Sie die DNA mit einem Enzym, normalerweise durch eine Methode, die für eine allgemeine Größe selektiert.
5. Bioinformatik
- Generieren Sie die Sequenzdaten als FASTQ-Dateien. Analysieren Sie, um die folgenden Teile einzuschließen.
- Teil I:
- Speichern Sie die vom Sequenzer erhaltenen FASTQ-Dateien, klicken Sie, um eine Tabellenkalkulationsdatei zu öffnen, und erstellen Sie Zuordnungs-/Metadatendateien.
- Öffnen Sie die Nephele-Website (https://nephele.niaid.nih.gov/), laden Sie die FASTQ-Dateien hoch, lesen Sie QC, Filtern und Trimmen in QIIME222. Hinterlegung der Rohsequenzen als Sequenzlesearchiv (SRA) und GenBank im NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
- Teil II: Gehen Sie auf die Nephele-Website (https://nephele.niaid.nih.gov/), führen Sie die demultiplexed Paired-End-Lesevorgänge, Filtersubstitution und Chimärenfehler durch und führen Sie mit DADA223 zusammen. Verwenden Sie den Naive Bayes-Klassifikator, der auf der Silva-Datenbank Version 132 99 % OTU trainiert wurde, um eine bakterielle taxonomische Zuordnung bei 97 % Ähnlichkeitdurchzuführen 24.
- Teil III: Öffnen Sie die MicrobiomeDB-Website, klicken Sie, um Dateien hochzuladen, und generieren Sie OTU-Alpha-Diversitäts-, Beta-Diversitäts-, relative Abundanz- und Verdünnungskurven (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Teil IV: Öffnen Sie eine Tabelle und übertragen Sie Daten, um Heatmaps, Venn-Diagramme und lineare Diskriminanzanalyse-Effektgrößen (https://microbiomedb.org/mbio/app) zu erstellen.
- Teil I:
6. Statistische Auswertung
- Öffnen Sie QIIME222 und bestimmen Sie die signifikanten Unterschiede in der Alpha-Diversität zwischen Gruppen mit dem Alpha-Gruppen-Signifikanz-Skript. Damit wird auch der Kruskal-Wallis-Test durchgeführt.
- Bestimmen Sie die Unterschiede in der Beta-Diversität zwischen Gruppen mit PERMANOVA, einschließlich eines paarweisen Tests25.
- Erhalten Sie die signifikanten Unterschiede in der Bakteriengemeinschaftsstruktur zwischen den Gruppen mit MicrobiomeDB. Ein p-Wert ≤0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Representative Results
Die Menge und Qualität der DNA, die aus Traubenmost, gärendem Wein und Endwein extrahiert wurde, wurden zunächst bestimmt; der Mengenwert reicht von 15-87 ng/μL (Tabelle 1).
Sequenzierung und Bioinformatik
Der Illumina-Hochdurchsatz-Sequenzer erzeugte eine FASTQ-Datei, die in den Nephele importiert und auf der QIIME 2-Plattform26 angezeigt wurde. Zunächst wurde die FastQC-Software verwendet, um die Sequenzqualität zu überprüfen. Dann wurde es sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende getrimmt, um Nukleotide von schlechter Qualität zu eliminieren, entrauscht, verschmolzen und von chimären Sequenzen abgereichert, bevor es mit dem DADA2-Denoiser23 zu OTUs (Operational Definition for a species) geclustert wurde. Sie wurden mit Hilfe der SILVA v138.1-Datenbank auf Bakterientaxa kartiert. Die Sequenzen wurden basierend auf einer 99%igen Nukleotidsequenzähnlichkeit in OTU gruppiert. Abbildung 1 zeigt die DADA2-Verdünnungskurven für die OTUs; es erreichte ein Plateau. Dies deutete darauf hin, dass genügend Sequenzen abgedeckt waren, um den Großteil der mikrobiellen Vielfalt anzuzeigen. Die Replikatanalyse der Sequenzen ergab keinen signifikanten Unterschied.
Die Heatmap, die auf der relativen Häufigkeit der Bakterien in verschiedenen Regimen von Traubenmost bis Wein basiert, ist in Abbildung 2 dargestellt. Die dominantesten rot dargestellten Stämme bestehen aus Proteobakterien, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota und, gefolgt von der Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota und Acidobacteriota. Die am wenigsten häufigen Bakterien waren blau markiert. Viele dieser Gruppen waren bei Zugabe von Hefe im Most vorhanden, fehlten aber während der Gärung, insbesondere Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota und Elusimicrobiota. Die relative Abundanz wurde auch auf Gattungsebene bestimmt, und die Ergebnisse deuteten auf wichtige Gattungen wie Enterobacteriaceae und Lactobacillaceae hin, wie in Abbildung 3 dargestellt. Eine Venn-Diagrammanalyse der gemeinsamen einzigartigen OTU ergab, dass 15 Bakterien vom Weintraubenmost bis zum endgültigen Wein vorhanden waren (Abbildung 4). Die Ergebnisse der Amplikon-Sequenzierung auf der Grundlage der V4-Variablenregion zeigten auch die Alpha-Diversität in den beiden Traminette R und L. Abbildung 4 zeigt die Gleichmäßigkeit der Arten als Verteilungsmarke, die sich zwischen den beiden Ernährungsbehandlungen unterscheidet. Die Daten zeigten, dass die Diversitätsverschiebung in der Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O bei 13,4 Brix niedriger als 1 war und die Gleichmäßigkeit gegen Null geht, da die relativen Häufigkeiten variieren. Die Daten wurden auch auf Beta-Diversität analysiert; Abbildung 5 zeigt den Unterschied zwischen den beiden Gärungstraminette R und L; Die Bakterien waren in den Stadien des Mostes und der Hefezugabe ähnlich. Bei den beiden Behandlungen gab es eine Verschiebung der Bakterien in der Gärungsphase, und im endgültigen Wein sieht es ähnlich aus (Abbildung 6).
Abbildung 1: Verdünnungsdiagramme der beobachteten OTUs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Heatmap der relativen Abundanz. Die Heatmap der relativen Abundanz auf den Stammebenen R und L unterschied sich nicht signifikant (p ≤0,05). Die Legendenleiste zeigt den Key Score an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Relative Abundanz der zehn wichtigsten Taxa. Die relative Häufigkeit der zehn besten Taxa auf Gattungsebene, die nach Medien mit Wilcoxon-Rangsummentest eingestuft wurden (p ≤0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Venn-Diagramm. Die einzigartigen und gemeinsamen Bakterien zwischen dem Most, der hinzugefügten Hefe, der Gärung und dem Wein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Alpha-Diversität von Traminette R und Traminette L. Alpha-Diversität des Shannon-H-Index der beiden Nährstoffe Fermaid O und Stimula Sauvignon blanc und Fermaid O (Dunn > 0,05) basierend auf der Analyse des Kruskal-Wallis-Tests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Hauptkomponentenanalyse. Hauptkomponentenanalyse von 16S rRNA-Daten der Beta-Diversität basierend auf Bray-Curtis der beiden Nährstoffe Fermaid O und Stimula Sauvignon Blanc und Fermaid O in verschiedenen Stadien der Weinproduktion. Der blaue Kreis stellt eine Gruppe von Most- und Hefezugabestufen dar. Der rote Kreis zeigt den endgültigen Wein an und der schwarze Kreis steht für die Gärungsphase in den beiden Behandlungen. Achse 1 und 2 sind Variationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Datum der Bemusterung | Probe | A260/A280 | Konzentration ng/μL Traminette R | A260/A280 | Konzentration ng/μL Traminette L |
| 8/30/21 | Weintraube | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | Muss | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | Ruhepause | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | Hefe hinzugefügt | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | Gärend | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | Gärend | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | Letzter Wein | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
Tabelle 1: Die Menge und Qualität der DNA, die aus Traubenmost, gärendem Wein und Endwein extrahiert wird.
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Discussion
Das Protokoll der Metagenomik beginnt mit der Probenahme des Traubenmostes, und wenn dem Most Hefe zugesetzt wurde, dem gärenden Wein und der endgültigen Weinprobe. Es folgte eine doppelte DNA-Extraktion, die erfolgreich aus diesen Proben extrahiert wurde. Die erhaltenen Mengen variierten in der Konzentration von 15 ng/μl bis 87 ng/μl. Dies zeigt, dass das DNA-Extraktionsprotokoll für metagenomische Studien von Wein wirksam ist. Obwohl die Qualität der DNA bei A260/A280 variiert, kann dies auf verschiedene Parameter zurückgeführt werden, die die Extraktion beeinflussen können, wie z. B. Alkoholkonzentration und andere Fermentationsmetaboliten, die sich während und nach der Fermentation entwickelt haben, sowie andere organische Pflanzenmaterialien, die die Genomextraktion hemmen können. Frühere Studien haben eine ähnliche Beobachtung am metagenomischen Pflanzenmaterial berichtet27. Die im beschriebenen Protokoll extrahierte DNA erreichte jedoch eine Menge, die für den nächsten Schritt der Analyse ausreichte. Das PCR-Barcoding, das für metagenomische Studien erforderlich ist, insbesondere unter Verwendung der Illumina-Sequenzierungsplattform, erfordert, dass die minimale DNA-Menge auf 1 ng/l festgelegt wird. Die V4-Region wurde sequenziert, und die Bestimmung der bakteriellen Diversität erfordert die Verwendung von 16S rRNA-Gensequenzierung; dieses Gen hat unterschiedliche variable Regionen von V1-V923. Insgesamt 6.393.443 Sequenzlesevorgänge mit einem Durchschnitt von 399590,1875 ± 138442,6148 aus der DNA, die aus den verschiedenen Proben extrahiert wurde. V4 wurde häufig verwendet und wird als die hypervariable Region des Gens bezeichnet, die sich gut für die bakterielle taxonomische und Diversitätsanalyse eignet. Während der Sequenzierung wurden gepaarte Illumina-Sequenzen mit ca. 200-300 bp-Sequenzen erzeugt. Es gibt verschiedene Plattformen, die für die Sequenzierung von DNA verwendet werden, die aus Lebensmitteln und fermentierten Getränken extrahiert wird28. Die Gründe für die Verwendung der Illumina-Plattform sind die folgenden: (1) Illumina ist eine Sequenzierungsplattform der 2. zweiten Generation mit hervorragendem Output, und ihre Chemie bietet eine niedrige Fehlerrate und ein geringes Profil. Es ist auch erschwinglich im Vergleich zu verfügbaren kommerziellen Kits für die Bibliotheksvorbereitung, und seine relativ kurzen Lesevorgänge sind ideal für die differentielle Expression. Der letzte Schritt des Protokolls war die Bioinformatik, ein wichtiger Bestandteil der Verwendung der Amplikon-16-Sequenzierung zur Bestimmung der mikrobiellen Vielfalt. Die Qualitätsprüfung der erhaltenen Sequenzen der FASTQ-Datei war sehr gut, und die von QIIME erhaltenen OTUs führten zu einer taxonomischen Analyse, die sich in den Ergebnissen der relativen Abundanz, Alpha- und Beta-Diversität zeigte.
Next-Generation-Sequencing (NGS) ist zu einem wichtigen Instrument für die Profilierung der Bakterien verschiedener mikrobieller Gemeinschaften in der Fermentation geworden. In dieser Studie wurde die 16S-Amplikon-Klassifizierung zunächst auf Stammebene durchgeführt, und während der Traubenweingärung wurde eine vielfältigere Gruppe von Bakterien als zuvor berichtet12 festgestellt; 15 Stämme wurden ebenfalls geteilt, wie aus der Analyse des Venn-Ergebnisses hervorgeht. Die Analyse auf Gattungsebene zeigte auch das Vorhandensein wichtiger Gattungen wie Enterobacteriaceae und Lactobacillaceae, die im Traminette-R-Becken häufiger vorkamen. Wir beschränkten unsere Analyse auf die Taxonomie auf Gattungsebene; Es gibt Studien, in denen die Methode zur Identifizierung auf Artebene durch hochauflösende Probeninferenzverwendet wurde 23. Eine der Einschränkungen der Amplikon-Sequenzierung besteht darin, dass die Sequenzdaten aufgrund der kurzen Länge der 16S-rRNA-Sequenz die Taxonomie auf Stammebene nicht bestimmen können. Eine weitere Einschränkung ist der Nachweis von Chloroplasten und Mitochondrien. Es wäre wünschenswert, wenn das bioinformatische Verfahren verwendet werden kann, um diese Sequenzen zu eliminieren, da es sich um Verunreinigungen von Traubenpflanzen handelt. Das Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von PNA-DNA-Klemmen zur Maximierung der Chloroplasten- und Mitochondrienkontamination29. Der hohe Gehalt an Firmicute im Traubenmost, während der Gärung und des Endweins, stimmt mit den früheren Studien über Keltertraubenüberein 30. Die Ergebnisse der Alpha-Diversitätsanalyse zeigten die Gleichmäßigkeit der Bakterien bei jeder Fermentationsernährungsbehandlung; es scheint, dass der Nährstoff Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O ein vielfältigeres Bakterium hervorgebracht hat. Darüber hinaus zeigten die Beta-Diversitätsdaten die Verschiebung der Bakterien in der Fermentationsphase; Dynamische Veränderungen deuten darauf hin, dass die Fermentationsphase eine sehr wichtige Periode ist, in der die Ernährungsänderungen die Bakterienselektion beeinflussen. Die Technik kann von der Industrie angepasst und verwendet werden, um die Gärung zu überwachen und die Qualität und Konsistenz zu verbessern28. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um den Einfluss organischer Nährstoffe auf die mikrobielle Vielfalt während der Weingärung besser zu verstehen.
Diese Studie ist die erste, die die Bakterienvielfalt während der Gärung von Traminette-Trauben und -Wein mit der 16S-Amplikon-Barcode-Sequenzierung untersucht, um die Bakterienveränderungen zu bestimmen. Dies bestätigte die Vielfalt der Bakterien auf Stamm- und Gattungsebene. Proteobakterien, gefolgt von Firmicutes, waren im Laufe der Gärung bis zum endgültigen Wein am häufigsten. Viele Stämme, die bisher nicht berichtet wurden, wurden mit der 16S-Amplikon-Sequenzierung nachgewiesen, was bestätigte, dass die Methode zur Überwachung der Weinproduktion verwendet werden kann. Die Alpha-Diversität zeigte die Rolle der Ernährungsumstellung; Es wirkte sich auf die Fermentationsbakterien aus, während die Beta-Diversität die Veränderungen während der Fermentationsphase anzeigt. Weitere Studien sind erforderlich, um die funktionelle Rolle zu untersuchen, die viele der beschriebenen Stämme und Gattungen bei der Weingärung spielen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Acknowledgments
Die Finanzierung durch das Stipendium des Appalachian State University Research Council (URC) und das CAPES Print Travel-Stipendium, das den Besuch der FAO an der Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasilien, unterstützte, werden dankbar gewürdigt. Diese Studie wurde teilweise von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finanzcode 001 finanziert. Das ECPDM ist dankbar für das CAPES Print Travel Stipendium, das ihren Besuch an der Appalachian State University unterstützte. Das ECPDM ist Research Fellow 2 des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasilien (CNPq).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
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