Summary
Burada, Traminette üzümlerinin, fermente üzümlerin ve nihai şarabın bakteri topluluğunu belirlemek için amplikon metagenomiğini tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Dizileme teknolojisindeki ilerlemeler ve mikrobiyal topluluk yapılarının profilini çıkarmak için biyoinformatik araçların kullanımına nispeten kolay erişim, üzüm ve şarapta hem kültürlenebilir hem de kültürlenemeyen mikropların daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmıştır. Endüstriyel fermantasyon sırasında, bilinen ve bilinmeyen mikroplar genellikle ürün geliştirme ve tatsızlıktan sorumludur. Bu nedenle, üzümden şaraba kadar bakterilerin profillenmesi, in situ mikrobiyal dinamiklerin kolay anlaşılmasını sağlayabilir. Bu çalışmada, Traminette üzümlerinin bakterileri fermantasyona tabi tutulmalı ve nihai şarap, 15 ng/μL ila 87 ng/μL veren DNA ekstraksiyonuna tabi tutulmuştur. V4 bölgesinin hiperdeğişken bölgesinin 16S amplikonu, filum Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota'dan oluşan nispeten bol bakteri ve ardından Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota ve Acidobacteriota'dan oluşan nispeten bol bakteriler dizilendi. Paylaşılan benzersiz operasyonel taksonomik birimlerin (OTU) bir Venn şeması analizi, 15 bakteri filumunun hem üzüm şırası, hem fermantasyon aşaması hem de son şarap için ortak olduğunu ortaya koydu. Daha önce bildirilmeyen filumlar, 16S amplikon diziliminin yanı sıra Enterobacteriaceae ve Lactobacillaceae gibi cinsler kullanılarak tespit edildi. Şarapta organik besin kullanımındaki varyasyon ve bunun bakteriler üzerindeki etkisi test edildi; Fermaid O içeren Traminette R tankı ve Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O ile uyarılan Traminette L . Kruskal-Wallis testi kullanılarak alfa çeşitliliği düzgünlük derecesini belirledi. Beta çeşitliliği, iki işlem için fermantasyon aşamasında bakterilerde bir kayma olduğunu gösterdi ve son şarap bakterileri benzer görünüyordu. Çalışma, şarap üretimi sırasında üzüm bakterilerinin kalitesini ve daha iyi kullanımını desteklemek için şarap üretimi sırasında bakteri değişikliklerini izlemek için 16S amplikon diziliminin kullanılabileceğini doğruladı.
Introduction
Traminette üzümü, kayda değer verim ve çeşitli mantar enfeksiyonlarına karşı kısmi dirence ek olarak üstün şarap kalitesi üretimi ile karakterize edilir 1,2,3. Üzümlerin doğal fermantasyonu, ilişkili mikroorganizmalara, şarap üretim ortamına ve fermantasyon kaplarınadayanır 4,5. Çoğu zaman, birçok şarap imalathanesi fermantasyon, alkol üretimi, esterler, aroma ve lezzet gelişimi için yabani maya ve bakterilere güvenir6.
Bu çalışmanın amacı, üzümlerin bakteri bileşimini incelemek ve fermantasyon sırasındaki dinamiklerini izlemektir. Bununla birlikte, alkolün üretildiği birincil fermantasyon için Saccharomyces cerevisiae gibi başlangıç kültürlerinin modern kullanımı, farklı şarap stillerinde ortaktır7. Ek olarak, malik asidin Oenococcus oeni tarafından laktik aside dekarboksilatlandığı ikincil fermantasyon, şarabın organoleptik ve tat profilini iyileştirir ve şarabın asitliğini azaltır 8,9. Kültürden bağımsız yöntemlerin kullanımındaki son gelişmelerle birlikte, şaraplık üzüm ve şıraya aktarılan ve son ürüne kadar farklı zamanlarda fermantasyona katılan türlerle ilişkili farklı mikropları belirlemek artık mümkündür10.
Şarap fermantasyonu sırasında şıraya aktarılan farklı üzümlerden elde edilen yabani bakterilerin rolleri ve dinamikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu bakterilerin çoğunun taksonomisi bile bilinmemektedir veya fenotipik özellikleri karakterize edilmemiştir. Bu, kokültür fermantasyonundaki uygulamalarının hala yeterince kullanılmamasına neden olur. Bununla birlikte, üzüm ve şarapla ilişkili bakteri popülasyonunu belirlemek için mikrobiyolojik kültüre dayalı analizler kullanılmıştır10. Seçici kültür kaplamasının sıkıcı olduğu, kontaminasyona eğilimli olduğu, düşük tekrarlanabilirliğe sahip olduğu ve çıktının şüpheli olabileceği yaygın olarak bilinmektedir; Ayrıca büyüme gereksinimleri bilinmeyen bakteri türlerini de özlüyor. Önceki çalışmalar, kültürden bağımsız, 16S rRNA gen tabanlı metodolojilerin, karmaşık mikrobiyal toplulukları karakterize etmek için daha güvenilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunduğunu göstermektedir11. Örneğin, 16S rRNA geninin hiperdeğişken bölgelerinin dizilenmesi, üzüm yaprakları, meyveler ve şaraptaki bakterileri incelemek için başarıyla kullanılmıştır 12,13,14. Çalışmalar, 16S rRNA metabarkodlama veya tüm metagenomik dizileme kullanımının mikrobiyom çalışmaları için uygun olduğunu göstermiştir15. Şarap üretimi sırasında bakteri çeşitliliğinin metabolik özellikleriyle olası bağlantısı hakkında ortaya çıkan bilgiler vardır, bu da şarapolojik özelliklerin ve terörün belirlenmesine yardımcı olabilir16.
Üzüm ve şarap mikrobiyal ekolojisini incelemek için yeni nesil dizileme (NGS) kullanan metagenomik araçların avantajlarını en üst düzeye çıkarma ihtiyacı vurgulanmıştır16,17. Ayrıca, gıda ve fermantasyon ekosisteminin mikrobiyal çeşitliliğinin profilini çıkarmak için yüksek verimli dizilemeye dayalı kültürden bağımsız yöntemlerin kullanılması, birçok laboratuvar için çok alakalı ve değerli hale gelmiştir ve endüstriyel kullanım için önerilmektedir18,19. Mevcut mikrobiyal popülasyonların tespiti ve taksonomik profillemesi ve çevresel mikropların katkısı, nispi bollukları ve alfa ve beta çeşitliliği20 için bir avantaj sağlar. 16S bölgesinin değişken bölgesinin dizilimi, tercih edilen önemli bir gen haline gelmiştir ve farklı mikrobiyal ekolojik çalışmalar sırasında kullanılmıştır.
Birçok çalışma, şarapfermantasyonu sırasında mantarlara, özellikle mayalara odaklanırken, bu çalışma, şarap üretimi için Traminette üzümlerinin fermantasyonu sırasında bakterileri incelemek için kullanılan 16S amplikon dizilimi ve biyoinformatik araçları bildirmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Deneysel şarap üretimi
- Jonesville, Kuzey Carolina bağındaki Dynamis Estate şarabından Traminnette üzümleri elde edin, kökünü çıkarın ve şırayı iki ayrı 600 L'lik üstü açık fermentöre bırakmak için ezin ve kapakları kapalı olarak yaklaşık 4 gün kabukları üzerinde bırakın.
- Derileri ıslak tutmak ve uçucu asit (VA) üretimini sınırlamak için kapakları günde bir kez yumruklayın.
NOT: Buradaki fikir, aromatik öncülerin (monoterpenlerin) çoğunun kabuklarda yer alması ve şarabın aromatik potansiyelini artırmak için meyve suyunu deri ile temas halinde bırakmasıdır. - 4 gün sonra, Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand) atın. Bu maya, güçlü bir fermentör olduğu ve üzümlerden elde edilen şaraptaki çeşit karakterini arttırmakla ilişkili olduğu için seçilmiştir.
- Bir tankta, Traminette R, fermantasyon güvenliğini sağlamak için briks 17.7 ve 20 g/hL Fermaid O ve 13.1 g/hL'de 12.5 g/hL Fermaid K iken 20 g/hL Fermaid O ve 12.5 g/hL Fermaid K ekleyin, diğer tank Traminette L, briks 17.1'deyken 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc ekleyin. Ayrıca şarabın çeşitli karakterini arttırmak için briks 13.4'teyken 20 g/hL Fermaid O ekleyin.
- Şıra (1. gün), maya eklenmiş (4. gün), fermente şıra (15. gün) ve bitmiş şarap örnekleri (30. gün) kopya örnekleri alın ve DNA ekstraksiyonu ve metagenomik analizden önce -20 ° C'de tutun.
2. Metagenomik için DNA ekstraksiyonu
- Yukarıda elde edilen tüm kopya numuneleri ilk santrifüjlemeye kadar buz üzerinde tutun.
- Fermente edilmiş numunenin 20 mL'sini steril 50 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın.
- 10 mL soğuk su ekleyin ve homojenize edin (vorteks). 4 ° C'de 800 x g'de 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
NOT: Bu adım, numunenin katılarını çıkaracaktır. - Adım 2.3'ü iki kez tekrarlayın ve süpernatantları aynı tüpte toplayın.
- Hücreleri peletlemek için süpernatanı 4 ° C'de 3.000 x g'de 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Peleti 1 mL PBS içinde yeniden süspanse edin, 2 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve 2 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin. PBS kullanarak iki yıkama daha yapın.
- Bu adımda, peletleri -20°C'de dondurun veya 2.8 adımını izleyin. Tüm numunelerin aynı şekilde işlenmesi önemlidir.
- 978 μL sodyum fosfat tamponu ekleyin. Sodyum fosfat tamponu hazırlayın, 3.1 g NaH2PO4 · H2Ove 10.9 gNa2HPO4(susuz) damıtılmışH2O'ya1 L'lik bir hacim yapmak ve pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- 122 μL DNA tamponu (DNA döndürme kiti) ve vorteks ekleyin.
- Buzdolabında (4 °C) 45 dk-1 saat bekletin. Numuneleri her 15 dakikada bir vorteksleyin. Bu adım, gece boyunca (o/n) veya DNA spin kitini kullanmaya devam etmeye hazır olana kadar bırakılabilir.
- 1 mL numuneyi bir Lizis çözeltisi 1 tüpüne (DNA sıkma kiti) aktarın ve kapağı sıkın (numune numarasını kapağın üzerine değil, tüpün yan tarafına yazın; kit reaktifleri kapağın üzerinde yazılı olan her şeyi çıkaracaktır).
- Numuneyi boncuk çırpıcı bir öğütücüde (6,5 m/s, CY: 24 x 2) 60 saniye boyunca üç kez homojenize edin. Boncuk çırpıcı öğütücü buz koyacak cihaza sahipse, tüplerin altına 50 g kuru buz koyun. Değilse, numuneleri her homojenizasyon adımı arasında 5 dakika ıslak buz üzerinde tutun.
- Lizing Matrix E tüplerini (DNA sıkma kiti) 16800 x g'de (veya maksimum hızda) 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı temiz bir mikrotüpe aktarın. Daha sonra 250 μL protein çökeltme çözeltisi (PPS) reaktifi (DNA sıkma kiti) ekleyin ve tüpü elle 10 kez çalkalayarak karıştırın.
- Çökeltiyi peletlemek için 16800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Süpernatanıma 1 mL bağlayıcı matris süspansiyonu (DNA spin kiti) ekleyin.
NOT: Bağlayıcı matris süspansiyonunu kullanmadan önce homojen olana kadar yeniden askıya alın. - Tüpleri elle 2 dakika ters çevirin, ardından tüpleri 3 dakika boyunca bir rafta bekletin (silika matrisinin yerleşmesine izin vermek için).
- Süpernatanın 1 mL'sini dikkatlice çıkarın. Kalan süpernatanttaki matrisi yeniden askıya alın.
- Karışımın 600 μL'sini bir spin filtre tüpüne (DNA spin kiti) aktarın ve 14500 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Kalan karışımı ve santrifüjü ekleyin.
- Akışı boşaltın ve spin filtre tüpüne 500 μL yıkama solüsyonu (DNA spin kiti) ekleyin ve 14500 x g'da 1 dakika santrifüjleyin (yıkama solüsyonuna EtOH eklediğinizden emin olun; ürün el kitabına bakın). Akışı boşaltın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama).
- Akışı boşaltın ve artık yıkama çözeltisi matrisini kurutmak için 14.500 x g'da 2 dakika daha santrifüjleyin.
- Döndürme filtresini çıkarın ve yeni bir yakalama tüpüne (DNA döndürme kiti) yerleştirin. Sıkma filtresini oda sıcaklığında (RT) 5 dakika havayla kurutun.
- DNAse içermeyen suyu (DNA sıkma kiti) 55 °C'de 5 dakika ısıtın. 50 μL DNAse-free su ekleyin ve DNA'nın verimli bir şekilde elüsyonu için filtre membranı üzerindeki matrisi bir pipet ucuyla hafifçe karıştırın. Numunelerin RT'de 1 dakika bekletilmesine izin verin, ardından DNA'yı elüte etmek için 14500 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Numuneleri buzun üzerine yerleştirin. Numune karışımını (2 μL numune + 2 μL su + 1 μL yükleme tamponu) bir jele yükleyin. DNA konsantrasyonunu ölçün.
- Numuneleri -20 °C'de saklayın.
- Ekstrakte edilen DNA'yı ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.
NOT: 1 μL'lik bir DNA hacmi düşürüldü ve ölçüldü ve DNA'nın kalitesi A260 / A280 oranında kaydedildi.
3. DNA elektroforezi
- 0.5 Tris/Borat/EDTA (TBE) tamponunda (mini jel için 20 mL, orta jel için 70-100 mL) %1 agaroz jel hazırlayın. Agaroz + tamponu tartın, agarozu eritmek için mikrodalgada kaynatın, tekrar tartın ve orijinal ağırlığına dH2O ekleyin. Agaroz çözeltisini 55-60 °C'ye soğutun ve tarak tertibatlı jel kalıbına dökün. Jeli katılaşmaya bırakın.
- Numuneye 1 μL 10x jel yükleme tamponu ekleyin (10 μL) ve bir moleküler ağırlık işaretleyicisinin yanındaki jele yükleyin. Mavi boya dibe yakın olana kadar 100-115 V (büyük jel) veya 90 V (mini jel) sıcaklıkta negatiften (siyah) pozitife (kırmızı) çalıştırın.
- Jeli 1 μL/mL etidyum bromür veya SYBR yeşili (nitril eldiven ve gözlük gereklidir) içinde 30 dakika lekeleyin, suyla durulayın ve view ultraviyole (UV) ışık kaynağı altında. Yinelenen numunelerden, daha sonraki işlemler için en yüksek verimi seçin.
4. Yüksek verimli sıralama
- Spesifik primerler 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') ve 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22 kullanarak 16S rRNA geninin V4 hiperdeğişken bölgesini amplifiye edin. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) koşullarını 2 dakika boyunca 94 °C'de, 20 saniye boyunca 30 döngü 94 °C'de, 20 saniye boyunca 58 °C'de, 1 dakika boyunca 65 °C'de ve 10 dakika boyunca 65 °C'ye ayarlayın (son uzatma).
- PCR reaksiyonlarını yüksek kaliteli bir PCR ana karışımı ile gerçekleştirin (Malzeme Tablosu).
- DNA kitaplığı hazırlama kiti ile kitaplıklar oluşturun ve ardından bir dizileme platformunda eşleştirilmiş uç dizileme kullanarak dizileme yapın.
NOT: Burada, NEBNext Ultra II DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti ile oluşturulan kütüphaneler, novaseq6000 platformunda eşleştirilmiş uçlu Illumina dizilemesi (2 × 250 bp) kullanılarak dizilenmiştir. - Sıralama adımlarını izleyin:
- Adım 1: DNA'yı bir enzimle, genellikle genel bir boyut seçen bir yöntemle kesin.
- 25 μL DNA'ya (yaklaşık 1 μg) 3,5 μL dizileme tamponu ve 1,5 μL enzim karışımı ekleyin, bir pipetle 10 kez karıştırın ve hızlıca döndürün.
- Aşağıdaki koşullara sahip bir termodöngüleyiciye yerleştirin: kapağı 75°C'de önceden ısıtın, (1) 20 °C için 30 dakika (2) 65 °C için 30 dakika (3) 4°C'de tutun.
- 2. Adım: Ligasyon yoluyla bağdaştırıcılar ekleyin
- Bir pipet ile 15 μL ligasyon ana karışımı, 1,25 μL adaptör, 0,5 μL ligasyon arttırıcı ve 30 μL son hazırlık DNA karışımı ekleyin.
- Bir termosiklerde 20 °C'de 15 dakika inkübe edin ve ardından toplam 48.26 μL elde etmek için ligasyon karışımına 1.5 μL urasil-spesifik eksizyon reaktifi (USER) enzimi ekleyin. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- Adaptör ligasyon DNA'sına 43,5 μL manyetik boncuk ekleyin, bir pipetle 20 kez karıştırın ve RT'de 5 dakika inkübe edin. Boncukları manyetik bir rafla ayırın, ardından 5-10 dakika inkübe edin ve süpernatanı atın.
- Peleti 100 μL %80 etanol ile yıkayın, 30 saniye kurutun ve tekrar yıkayın. Boncukları ve peletleri 8,5 μL'lik 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20'da elute edin, bir pipetle karıştırın ve RT'de 2 dakika inkübe edin.
- Manyetik rafta inkübe edin ve süpernatan olarak 7.5 μL ayrıştırılmış DNA'yı çıkarın. Elute'u yeni bir tüpe yerleştirin ve bir PCR adımı gerçekleştirin.
- İlk olarak, 25 μL PCR reaksiyon karışımı elde etmek için 7,5 μL adaptörle bağlanmış DNA'ya 12,5 μL ana karışım, 2,5 μL indeks primer i7 primer ve 2,5 μL evrensel PCR primer/i5 primer ekleyin. Aşağıdaki PCR koşulunu kullanın: kapağı önceden 103 °C'ye ısıtın. 98 saniye boyunca 30 °C, 98 saniye boyunca 10 °C, 65 saniye boyunca 75 °C, 65 dakika boyunca 5 °C ve 4 döngüden sonra 10 °C'de tutun.
- 25 μL amplifiye DNA'yı temizleyin. 22,5 μL manyetik boncuk ekleyin ve 20 kez karıştırın. RT'de 5 dakika inkübe edin ve süpernatanın 50 μL'sini çıkarın. Boncukları 100 μL %80 etanol ile yıkayın ve boncukları 30 saniye boyunca nazikçe kurutarak tüm etanolü çıkarın.
- Koyu kahverengi boncukları 16 μL suda tekrar süspanse edin, bir pipetle 20 kez karıştırın ve 30-60 saniye manyetik rafa koyun. 15 μL'yi yeni bir tüpe aktarın.
- Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin. 90 μL tampon + 1 μL boya + 2 μL DNA kütüphanesi örneğini karıştırın ve konsantrasyonu okuyun. DNA'yı 2 nM'ye seyreltin, akış hücresine 27-30 μL yükleyin ve sıralayıcıya yerleştirin.
- Adım 3: Adaptörleri sıralayın, yukarıda oluşturulan kitaplıkları desenli akış hücresinin matrisine hibritleştirin ve üreticinin talimatlarına göre DNA'yı yakalayın. İkinci sentez için şablon olarak kullanın.
- Ardından, ikinci ipliği bir klonal kümeye yükseltin. Kümeyi doğrusallaştırın ve etkin siteleri engelleyin. Üreticinin protokolüne göre dizide sentez yoluyla dizileme için bir alan sağlamak için sıralama astarı ekleyin.
NOT: Kimyasal olarak, modifiye edilmiş nükleotidler, doğal tamamlayıcılık kullanarak DNA şablon zincirine bağlanır. Her nükleotidin bir floresan etiketi ve bir sonraki bazın dahil edilmesini engelleyen tersine çevrilebilir bir sonlandırıcısı vardır. Bu nedenle, bir floresan sinyalinin varlığı, hangi nükleotidin yerleştirildiğini gösterir ve sonlandırıcı, bir sonraki bazın bağlanması için bölünür.
- Ardından, ikinci ipliği bir klonal kümeye yükseltin. Kümeyi doğrusallaştırın ve etkin siteleri engelleyin. Üreticinin protokolüne göre dizide sentez yoluyla dizileme için bir alan sağlamak için sıralama astarı ekleyin.
- Adım 4: Sentez yoluyla art arda sıralanan dizi kümeleri vermek için tek bağlı ipliği güçlendirin.
NOT: Kümeler, çift yönlü tarama ve iki kanallı dizileme kimyası yoluyla tek bir iplikten daha parlak bir sinyal verir. Sıralama yazılımı, temel çağrı (*.cbcl) dosyalarını veri analizi için belirtilen çıktı klasörü konumuna otomatik olarak aktarır.
- Adım 1: DNA'yı bir enzimle, genellikle genel bir boyut seçen bir yöntemle kesin.
5. Biyoinformatik
- Dizi verilerini FASTQ dosyaları olarak oluşturun. Aşağıdaki bölümleri içerecek şekilde analiz edin.
- Bölüm I:
- Sıralayıcıdan alınan FASTQ dosyalarını kaydedin, bir elektronik tablo dosyası açmak için tıklayın ve eşleme/meta veri dosyaları oluşturun.
- Nephele web sitesini (https://nephele.niaid.nih.gov/) açın, FASTQ dosyalarını yükleyin, QIIME222'de QC, filtreleme ve kırpmayı okuyun. Ham dizileri dizi okuma arşivi (SRA) ve GenBank olarak NCBI BioProject'te (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/) saklayın
- Bölüm II: Nephele web sitesine (https://nephele.niaid.nih.gov/) gidin, çoğullamadan arındırılmış eşleştirilmiş uç okumaları, filtre değiştirme ve kimera hatalarını yapın ve DADA223 kullanarak birleştirin. %97 benzerlikte bakteri taksonomik ataması gerçekleştirmek için Silva sürüm 132 %99 OTU veritabanında eğitilmiş Naive Bayes sınıflandırıcısını kullanın24.
- Bölüm III: MicrobiomeDB web sitesini açın, dosyaları yüklemek için tıklayın ve OTU alfa çeşitliliği, beta çeşitliliği, göreceli bolluk ve seyrekleşme eğrileri (https://microbiomedb.org/mbio/app) oluşturun.
- Bölüm IV: Isı haritaları, Venn diyagramları ve doğrusal diskriminant analizi efekt boyutu (https://microbiomedb.org/mbio/app) yapmak için bir elektronik tablo açın ve verileri aktarın.
- Bölüm I:
6. İstatistiksel analiz
- QIIME222'yi açın ve alfa-grup-önem komut dosyasını kullanarak gruplar arasındaki alfa çeşitliliğindeki önemli farklılıkları belirleyin. Bu aynı zamanda Kruskal-Wallis testini de gerçekleştirecektir.
- İkili bir test25 de dahil olmak üzere PERMANOVA kullanarak gruplar arasındaki beta çeşitliliğindeki farklılıkları belirleyin.
- MicrobiomeDB kullanan gruplar arasında bakteri topluluk yapısındaki önemli farklılıkları elde edin. p değerinin ≤0.05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üzüm şırasından elde edilen DNA'nın miktarı ve kalitesi, fermente şarap ve nihai şarap ilk olarak belirlendi; miktar değeri 15-87 ng/μL arasında değişmektedir (Tablo 1).
Sıralama ve biyoinformatik
Illumina yüksek verimli sıralayıcı, Nephele'ye aktarılan ve QIIME 2 platform26'da görüntülenen bir FASTQ dosyası oluşturdu. İlk olarak, dizi kalitesini kontrol etmek için FastQC yazılımı kullanıldı. Daha sonra, DADA2 gürültü giderici23 kullanılarak OTU'lara (bir tür için operasyonel tanım) kümelenmeden önce düşük kaliteli nükleotidleri ortadan kaldırmak için hem 5' hem de 3'- uçlarında kesildi, gürültüden arındırıldı, birleştirildi ve kimerik diziler tükendi. SILVA v138.1 veritabanı kullanılarak bakteri taksonlarıyla eşleştirildiler. Diziler, %99 nükleotid dizi benzerliğine dayalı olarak OTU'da kümelendi. Şekil 1 , OTU'lar için DADA2 nadirlik eğrilerini göstermektedir; bir platoya ulaştı. Bu, mikrobiyal çeşitliliğin çoğunluğunu belirtmek için yeterli dizinin kapsandığını gösterdi. Dizilerin tekrarlanan analizi anlamlı bir fark yaratmadı.
Üzüm şırasından şaraba kadar farklı rejimlerde bakterilerin nispi bolluğuna dayanan ısı haritası Şekil 2'de gösterilmektedir. Kırmızı ile gösterilen en baskın filumlar Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota'dan oluşur ve bunu Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota ve Acidobacteriota takip eder. En az bulunan bakteri mavi renkle gösterildi. Bu grupların çoğu, maya eklendiğinde ancak fermantasyon sırasında bulunmadığında, özellikle Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota ve Elusimicrobiota'da mevcuttu. Bağıl bolluk cins düzeyinde de belirlendi ve sonuçlar, Şekil 3'te gösterildiği gibi Enterobacteriaceae ve Lactobacillaceae gibi önemli cinsleri gösterdi. Paylaşılan benzersiz OTU'nun bir Venn şeması analizi, şaraplık üzüm şırasından son şaraba kadar 15 bakterinin mevcut olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 4). V4 değişken bölgesine dayanan amplikon dizilemesinin sonuçları, iki Traminette R ve L'deki alfa çeşitliliğini de göstermiştir. Şekil 4, iki beslenme tedavisi arasında farklı olan bir dağılım işareti olarak tür düzgünlüğünü göstermektedir. Veriler, Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O'daki çeşitlilik değişiminin 13.4 brix'te 1'den düşük olduğunu ve nispi bolluklar değiştikçe düzgünlüğün sıfıra yaklaştığını gösterdi. Veriler ayrıca beta çeşitliliği açısından analiz edildi; Şekil 5, iki fermantasyon Traminette R ve L arasındaki farkı göstermektedir; Bakteriler şıra ve maya eklenmiş aşamalarda benzerdi. İki işlem için fermantasyon aşamasında bakterilerde bir kayma oldu ve son şarapta benzer görünüyor (Şekil 6).
Şekil 1: Gözlemlenen OTU'ların seyrekleşme grafikleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Göreceli bolluk ısı haritası. R ve L filum seviyelerindeki nispi bolluğun ısı haritası önemli ölçüde farklı değildi (p ≤0.05). Gösterge çubuğu anahtar puanı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İlk on taksonun nispi bolluğu. Wilcoxon sıra toplamı testi ile ortama göre sıralanan ilk on taksonun cins düzeyindeki nispi bolluğu (p ≤0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Venn şeması. Şıra, maya eklenen, fermantasyon ve şarap arasındaki benzersiz ve paylaşılan bakteriler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Traminette R ve Traminette L'nin alfa çeşitliliği. Kruskal-Wallis testinin analizine dayanan iki besinsel Fermaid O ve Stimula Sauvignon blanc ve Fermaid O'nun (Dunn > 0.05) Shannon's H indeksinin alfa çeşitliliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Temel bileşen analizi. Şarap üretiminin farklı aşamalarında iki besinsel Fermaid O ve Stimula Sauvignon Blanc ve Fermaid O'nun Bray-Curtis'ine dayanan beta çeşitliliğinin 16S rRNA verilerinin temel bileşen analizi. Mavi daire, şıra ve maya ekleme aşamalarından oluşan bir kümeyi temsil eder. Kırmızı daire son şarabı gösterir ve siyah daire iki işlemde fermantasyon aşamasıdır. Eksen 1 ve 2 varyasyonlardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnekleme tarihi | Örnek | A260/A280 Serisi | Konsantrasyon ng/μL Traminette R | A260/A280 Serisi | Konsantrasyon ng / μL Traminette L |
| 8/30/21 | Üzüm | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | Olmazsa olmaz | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | Dinlenme | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | Maya eklendi | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | Fermantasyon | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | Fermantasyon | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | Son şarap | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
Tablo 1: Üzüm şırasından ekstrakte edilen DNA'nın miktarı ve kalitesi, fermente şarap ve son şarap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metagenomik protokolü, üzüm şırasının örneklenmesinden başlar ve şıraya maya eklendiğinde, fermente şarap ve son şarap örnekleri. Bunu, bu örneklerden başarıyla ekstrakte edilen çift DNA ekstraksiyonu izledi. Elde edilen miktarların konsantrasyonu 15 ng/μL ila 87 ng/μL arasında değişmiştir. Bu, DNA ekstraksiyon protokolünün şarabın metagenomik çalışmaları için etkili olduğunu göstermektedir. A260/A280'deki DNA'nın kalitesi değişse de, bu, fermantasyon sırasında ve sonrasında gelişen alkol konsantrasyonu ve diğer fermantasyon metabolitleri gibi ekstraksiyonu etkileyebilecek farklı parametrelere ve ayrıca genom ekstraksiyonunu engelleyebilecek diğer organik bitki materyallerine bağlanabilir. Önceki çalışmalar, metagenomik bitki materyali27 üzerinde benzer bir gözlem bildirmiştir. Bununla birlikte, tarif edilen protokolde ekstrakte edilen DNA, analizin bir sonraki adımı için yeterli olan bir miktar elde etti. Özellikle Illumina dizileme platformunu kullanan metagenomik çalışmalar için gereken PCR barkodlaması, minimum DNA miktarının 1 ng/L olarak ayarlanmasını gerektirir. V4 bölgesi dizilendi ve bakteri çeşitliliğinin belirlenmesi için 16S rRNA gen diziliminin kullanılması gerekiyor; bu genin V1-V923'ten farklı değişken bölgeleri vardır. Farklı örneklerden çıkarılan DNA'dan ortalama 399590.1875 ± 138442.6148 olmak üzere toplam 6.393.443 çift uçlu dizi okunur. V4 yaygın olarak kullanılmaktadır ve bakteri taksonomik ve çeşitlilik analizi için iyi olan genin hiperdeğişken bölgesi olarak adlandırılır. Dizileme sırasında, eşleştirilmiş Illumina dizilimi yaklaşık 200-300 bp dizileri üretildi. Yiyeceklerden ve fermente içeceklerden ekstrakte edilen DNA'yı dizilemek için kullanılan farklı platformlar vardır28. Illumina platformunu kullanma nedenleri şunlardır: (1) Illumina, mükemmel çıktıya sahip 2. ikinci nesil bir dizileme platformudur ve kimyası düşük hata oranı ve profili verir. Ayrıca, kütüphane hazırlığı için mevcut ticari kitlere kıyasla ekonomiktir ve nispeten kısa okumaları, diferansiyel ifade için idealdir. Protokolün son adımı, mikrobiyal çeşitliliğin belirlenmesi için amplikon 16 dizilemesinin kullanımının önemli bir bileşeni olan biyoinformatikti. Elde edilen FASTQ dosyası dizilerinin kalite kontrolü çok iyiydi ve QIIME'den elde edilen OTU'lar, nispi bolluk, alfa ve beta çeşitliliği sonuçlarında gösterilen taksonomik bir analizle sonuçlandı.
Yeni nesil dizileme (NGS), farklı fermantasyon mikrobiyal topluluklarının bakterilerinin profilini çıkarmak için önemli bir araç haline gelmiştir. Bu çalışmada, 16S amplikon sınıflandırması ilk olarak filum düzeyinde yapıldı ve üzüm şarabı fermantasyonu sırasında daha önce bildirilenden12 daha çeşitli bir bakteri grubu fark edildi; Venn sonucunun analizinden de belirtildiği gibi 15 filum da paylaşıldı. Ayrıca, cins düzeyinde yapılan analizler, Traminette R tankında daha bol bulunan Enterobacteriaceae ve Lactobacillaceae gibi önemli cinslerin varlığını gösterdi. Analizimizi cins düzeyinde taksonomi ile sınırladık; Yöntemin, yüksek çözünürlüklü örneklem çıkarımı yoluyla tür düzeyinde taksonomide tanımlama için kullanıldığı çalışmalar vardır23. Amplikon dizilemesinin sınırlamalarından biri, dizi verilerinin 16S rRNA dizisinin kısa uzunluğu nedeniyle gerinim seviyesi taksonomisini belirleyememesidir. Diğer bir sınırlama, kloroplast ve mitokondrinin tespitidir. Üzüm bitkilerinin kirleticileri oldukları için bu dizileri ortadan kaldırmak için biyoinformatik prosedürün kullanılıp kullanılamayacağı arzu edilecektir. Bununla birlikte, kloroplast ve mitokondri kontaminasyonunu en üst düzeye çıkarmak için PNA-DNA kelepçelerini kullanan amplifikasyon protokolü29. Üzümlerdeki yüksek Firmicute bolluğu, fermantasyon ve son şarap sırasında, şaraplık üzüm30 ile ilgili önceki çalışmalarla aynı fikirde olmalıdır. Alfa çeşitliliği analizinin sonuçları, her bir fermantasyon beslenme tedavisinin bakteri düzgünlüğünü gösterdi; Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O besinin daha çeşitli bir bakteri ürettiği görülüyor. Ek olarak, beta çeşitlilik verileri, fermantasyon aşamasında bakterilerdeki değişimi gösterdi; Dinamik değişiklikler, fermantasyon aşamasının, beslenme değişikliklerinin bakteri seçimini etkilediği çok önemli bir dönem olduğunu göstermektedir. Teknik, fermantasyonu izlemek ve kalite ve tutarlılığı iyileştirmek için endüstriler tarafından uyarlanabilir ve kullanılabilir28. Bununla birlikte, şarap fermantasyonu sırasında organik besinlerin mikrobiyal çeşitlilik üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulacaktır.
Bu çalışma, bakteri değişikliklerini belirlemek için 16S amplikon barkod dizilimi kullanarak Traminette üzümlerinin ve şarabının fermantasyonu sırasında bakteri çeşitliliğini inceleyen ilk çalışmadır. Bu, filum ve cins seviyelerinde bakteri çeşitliliğini doğruladı. Proteobakteriler, ardından Firmicutes, fermantasyon son şaraba ilerledikçe en bol olanıydı. Daha önce bildirilmeyen birçok filum, 16S amplikon dizilimi kullanılarak tespit edildi ve bu, yöntemin şarap üretimini izlemek için kullanılabileceğini doğruladı. Alfa çeşitliliği beslenme değişikliğinin rolünü gösterdi; Fermantasyon bakterilerini etkilerken, beta çeşitliliği fermantasyon aşamasındaki değişiklikleri gösterir. Tarif edilen filum ve cinslerin çoğunun şarap fermantasyonunda oynadığı fonksiyonel rolleri araştırmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
FAO'nun Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brezilya'ya yaptığı ziyareti destekleyen Appalachian Eyalet Üniversitesi Araştırma Konseyi (URC) hibesi ve CAPES Print Travel bursundan sağlanan fon minnetle kabul edilmektedir. Bu çalışma kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finans Kodu 001 tarafından finanse edilmiştir. ECPDM, Appalachian Eyalet Üniversitesi'ne yaptığı ziyareti destekleyen CAPES Print Travel hibesi için minnettardır. ECPDM, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brezilya'dan (CNPq) 2 araştırma görevlisidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
- Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
- Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
- Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
- Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
- Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
- Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
- Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
- Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
- Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
- Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
- Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
- Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
- Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
- Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
- Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
- Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
- Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
- Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
- Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
- Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
- Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
- van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
- Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
- Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).
