Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

יצירת פרופיל של אוכלוסיית החיידקים של תסיסה של ענבי טרמינט במהלך ייצור היין באמצעות ריצוף אמפליקון מטאגנומי

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65598
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור אמפליקון מטגנומי לקביעת אוכלוסיית החיידקים של ענבי טרמינט, ענבים מותססים ויין סופי.

Abstract

ההתקדמות בטכנולוגיית הריצוף והגישה הקלה יחסית לשימוש בכלים ביואינפורמטיים לפרופיל מבנים קהילתיים מיקרוביאליים אפשרו הבנה טובה יותר של מיקרובים הניתנים לגידול ושאינם ניתנים לגידול בענבים וביין. במהלך התסיסה התעשייתית, חיידקים, ידועים ולא ידועים, אחראים לעתים קרובות על פיתוח המוצר ועל הטעם. לכן, אפיון החיידקים מענבים ליין יכול לאפשר הבנה קלה של דינמיקה מיקרוביאלית באתר . במחקר זה, החיידקים של ענבי טרמינט חייבים לעבור תסיסה, והיין הסופי עבר מיצוי DNA שהניב 15 ננוגרם/מיקרוליטר עד 87 ננוגרם/מיקרוליטר. האמפליקון 16S של האזור ההיפר-משתנה של אזור V4 רוצף, חיידקים נפוצים יחסית המורכבים מפילה פרוטאובקטריוטה (phyla Proteobacteria), אקטינובקטריוטה (Actinobacteriota), פירמיקוטס (Firmicutes), בקטרואידוטה (Bacteroidota), פוסובקטריוטה (Fusobacteriota) ואחריו Verrucomicrobiota, הלובקטרוטה (Halobacterota), דסולפובקטרוטה (Desulfobacterota), מיקסוקוקוטה (Myxococcota) ואצידובקטריוטה (Acidobacteriota). ניתוח דיאגרמת Venn של היחידות הטקסונומיות התפעוליות הייחודיות המשותפות (OTU) גילה כי 15 חיידקי פילה היו משותפים הן לענבים, לשלב התסיסה והן ליין הסופי. פילות שלא דווחו קודם לכן זוהו באמצעות ריצוף אמפליקון 16S, כמו גם סוגים כגון Enterobacteriaceae ו- Lactobacillaceae. נבדקה שונות בשימוש התזונתי האורגני ביין והשפעתו על חיידקים; מיכל Traminette R המכיל Fermaid O ו- Traminette L מגורה עם Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. מגוון אלפא באמצעות מבחן Kruskal-Wallis קבע את מידת האחידות. מגוון הבטא הצביע על שינוי בחיידקים בשלב התסיסה של שני הטיפולים, וחיידקי היין הסופיים נראו דומים. המחקר אישר כי ניתן להשתמש בריצוף אמפליקון 16S כדי לעקוב אחר שינויים בחיידקים במהלך ייצור היין כדי לתמוך באיכות ובניצול טוב יותר של חיידקי ענבים במהלך ייצור היין.

Introduction

ענבי טרמינט מאופיינים בייצור באיכות יין מעולה, בנוסף ליבול ניכר ועמידות חלקית למספר זיהומים פטרייתיים 1,2,3. התסיסה הטבעית של ענבים מסתמכת על מיקרואורגניזמים הקשורים, סביבת ייצור היין וכלי התסיסה 4,5. לעיתים קרובות, יקבים רבים מסתמכים על שמרי בר וחיידקים לצורך תסיסה, ייצור אלכוהול, אסטרים, ארומה ופיתוח טעמים6.

מטרת המחקר היא לבחון את הרכב החיידקים של ענבים ולעקוב אחר הדינמיקה שלהם במהלך התסיסה. אמנם, השימוש המודרני בתרבויות ראשונות כגון Saccharomyces cerevisiae לתסיסה ראשונית, שבה מיוצר אלכוהול, משותף לסגנונות יין שונים7. בנוסף, תסיסה שניונית, שבה חומצה מאלית היא decarboxylated על ידי Oenococcus oeni לחומצה לקטית, משפר את פרופיל organoleptic ואת הטעם של היין ומפחית את החומציות של היין 8,9. עם ההתקדמות האחרונה בשימוש בשיטות שאינן תלויות בתרבית, ניתן כיום לקבוע מיקרובים שונים הקשורים לענבי היין ולזנים המועברים אליהם חייבים ולהשתתף בתסיסה בזמנים שונים עד לתוצר הסופי10.

התפקידים והדינמיקה של חיידקי בר מענבים שונים המועברים לחובה במהלך תסיסה של יין אינם מובנים היטב. הטקסונומיה של רבים מהחיידקים הללו כלל אינה ידועה, או שתכונותיהם הפנוטיפיות אינן מאופיינות כלל. זה עושה את היישום שלהם תסיסה coculture עדיין מנוצל בצורה גרועה. עם זאת, ניתוח מיקרוביולוגי מבוסס תרבית שימש כדי לקבוע את אוכלוסיית החיידקים הקשורים ענבים ויין10. ידוע כי ציפוי תרבית סלקטיבית הוא מייגע, נוטה לזיהום, בעל יכולת שחזור נמוכה, והתפוקה יכולה להיות מוטלת בספק; הוא גם מפספס מיני חיידקים שדרישות הגידול שלהם אינן ידועות. מחקרים קודמים מצביעים על כך שמתודולוגיות מבוססות גנים 16S rRNA שאינן תלויות בתרבית מציעות גישה אמינה וחסכונית יותר לאפיון קהילות מיקרוביאליות מורכבות11. לדוגמה, ריצוף האזורים ההיפר-משתנים של הגן rRNA 16S שימש בהצלחה לחקר חיידקים בעלי ענבים, פירות יער ויין 12,13,14. מחקרים הראו כי השימוש במטא-ברקוד rRNA 16S או בריצוף מטאגנומי שלם מתאים למחקרי מיקרוביום15. יש מידע מתפתח על הקשר האפשרי של מגוון חיידקים לתכונות המטבוליות שלהם במהלך ייצור יין, אשר יכול לעזור בקביעת תכונות oenological ו terroir16.

הצורך למקסם את היתרונות של הכלים המטאגנומיים באמצעות ריצוף הדור הבא (NGS) לחקר האקולוגיה המיקרוביאלית של ענבים ויין הודגש16,17. כמו כן, השימוש בשיטות תלויות תרבית המבוססות על ריצוף בתפוקה גבוהה כדי לאפיין את המגוון המיקרוביאלי של המערכת האקולוגית של המזון והתסיסה הפך רלוונטי מאוד ובעל ערך רב למעבדות רבות ומומלץ לשימוש תעשייתי18,19. הוא מספק יתרון של גילוי ופרופיל טקסונומי של אוכלוסיות החיידקים הנוכחיות ואת תרומתם של מיקרובים סביבתיים, השפע היחסי שלהם, ומגוון אלפא ובטא20. ריצוף האזור המשתנה של אזור 16S הפך לגן חשוב של בחירה ושימש במהלך מחקרים אקולוגיים מיקרוביאליים שונים.

בעוד שמחקרים רבים מתמקדים בפטריות, במיוחד שמרים, במהלך תסיסה של יין21, מחקר זה דיווח על ריצוף אמפליקון 16S וכלים ביואינפורמטיים המשמשים לחקר החיידקים במהלך תסיסה של ענבי טרמינט לייצור יין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור יין ניסיוני

  1. השג ענבי טרמינט מיין Dynamis Estate בג'ונסוויל, צפון קרוליינה כרם, destem, ו למחוץ חייב לשחרר חייב לשני תסיסה נפרדת 600 L פתוח העליון ולהשאיר על הקליפות במשך כ 4 ימים עם המכסים על.
  2. יש לנקב את הפקקים פעם ביום כדי לשמור על העור רטוב ולהגביל את ייצור החומצה הנדיפה (VA).
    הערה: הרעיון הוא שהרבה מהקודמנים הארומטיים (מונוטרפנים) ממוקמים בקליפות ומשאירים את המיץ במגע עם העור כדי להגדיל את הפוטנציאל הארומטי של היין.
  3. לאחר 4 ימים, המגרש Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). שמרים אלו נבחרו מכיוון שהם מתסיסים חזקים וקשורים להעצמת האופי הזני ביין מהענבים.
  4. במיכל אחד, Traminette R, מוסיפים 20 גרם/hL בתולת O כאשר הבריקס נמצא ב-17.7 ו-20 גרם/hL Fermaid O ו-12.5 גרם/hL Fermaid K ב-13.1 גרם/שעה כדי להשיג ביטחון תסיסה, בעוד שהמכל השני, Traminette L, מוסיפים 40 גרם/hL Stimula Sauvignon blanc כאשר הבריקס נמצא ב-17.1. הוסיפו גם 20 גרם / ליטר פרמידה O כאשר הבריקס הוא ב 13.4 כדי לשפר את אופי הזנים של היין.
  5. קחו דגימות כפולות של חובה (יום 1), שמרים שנוספו (יום 4), חייבים מותססים (יום 15) ודגימות יין מוגמרות (יום 30) ושמרו על טמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני מיצוי DNA וניתוח מטגנומי.

2. מיצוי DNA למטגנומיקה

  1. שמור את כל הדגימות הכפולות שהתקבלו לעיל על קרח עד הצנטריפוגה הראשונה.
  2. מעבירים 20 מ"ל מהדגימה המותססת לצינור פקק בורג סטרילי של 50 מ"ל.
  3. מוסיפים 10 מ"ל מים קרים והומוגניזציה (מערבולת). צנטריפוגה למשך דקה אחת ב 800 x גרם ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש 50 מ"ל.
    הערה: שלב זה יסיר את מוצקי הדגימה.
  4. חזרו על שלב 2.3 פעמיים ואגרו את הסופרנאטנטים באותו צינור.
  5. צנטריפוגה supernatant ב 3,000 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות כדי לגלול את התאים. השליכו את הסופרנטנט.
  6. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS, העבר לצינור מכסה בורג 2 מ"ל, וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם למשך 2 דקות. בצע שתי שטיפות נוספות באמצעות PBS.
  7. בשלב זה, יש להקפיא את הכדוריות בטמפרטורה של -20°C או לבצע את שלב 2.8. חשוב שכל הדגימות יטופלו באותו אופן.
  8. הוסף 978 μL של מאגר פוספט נתרן. הכינו מאגר נתרן פוספט, הוסיפו 3.1 גרם של NaH2PO4· H2O ו- 10.9 גרם של Na2HPO4 (נטול מים) ל- H2O מזוקק כדי ליצור נפח של 1 L, ולהתאים את ה- pH ל- 7.4.
  9. הוסף 122 μL של מאגר DNA (ערכת ספין DNA) ומערבולת.
  10. תן לו לעמוד במקרר (4 ° C) במשך 45 דקות-1 שעות. מערבלים את הדגימות כל 15 דקות. ניתן להשאיר שלב זה למשך הלילה (o/n) או עד שהוא מוכן להמשיך להשתמש בערכת הספין של הדנ"א.
  11. העבירו 1 מ"ל דגימה לתוך צינור תמיסת ליזיס 1 (ערכת ספין DNA) והדקו את הפקק (כתבו את מספר הדגימה בצד הצינור ולא על הפקק; ריאגנטים של הערכה יסירו כל מה שכתוב על הפקק).
  12. הומוגניזציה של הדגימה במטחנת חרוזים (6.5 מטר לשנייה, CY: 24 x 2) במשך 60 שניות שלוש פעמים. אם מטחנת חרוזים יש את המכשיר לשים קרח, לשים 50 גרם של קרח יבש מתחת צינורות. אם לא, שמרו את הדגימות על קרח רטוב למשך 5 דקות בין כל שלב הומוגניזציה.
  13. צנטריפוגות Lysing Matrix E tubes (ערכת ספין DNA) למשך דקה אחת במהירות של 16800 x g (או מהירות מרבית).
  14. מעבירים את הסופרנאטנט לתוך מיקרו-צינור נקי. לאחר מכן, הוסף 250 μL של מגיב תמיסת משקעים חלבונית (PPS) (ערכת ספין DNA) וערבב על ידי ניעור הצינור ביד 10 פעמים.
  15. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 16800 x גרם כדי pellet את המשקע.
  16. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור סטרילי של 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של מתלה מטריצת קשירה (ערכת ספין DNA) לסופרנטנט.
    הערה: השהה מחדש את מתלה מטריצת הכריכה לפני השימוש עד שהוא הומוגני.
  17. הפכו את הצינורות ביד למשך 2 דקות, ואז הניחו לצינורות לעמוד במדף למשך 3 דקות (כדי לאפשר שקיעה של מטריצת סיליקה).
  18. בזהירות להסיר 1 מ"ל של supernatant. השהה מחדש את המטריצה בסופרנאטנט הנותר.
  19. מעבירים 600 μL של התערובת לתוך צינור מסנן ספין (ערכת ספין DNA) וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב 14500 x גרם.
  20. מוסיפים את יתרת התערובת והצנטריפוגה.
  21. דקנט זרימה דרך והוסף 500 μL של תמיסת שטיפה (ערכת ספין DNA) לתוך צינור מסנן הסחיטה והצנטריפוגה למשך דקה אחת ב 14500 x גרם (הקפד להוסיף EtOH לתמיסת שטיפה; עיין במדריך המוצר). מרוקנים את הזרימה וחוזרים על הכביסה פעמיים נוספות (3 כביסות בסך הכל).
  22. דקו את הזרימה והצנטריפוגה למשך 2 דקות נוספות במהירות של 14,500 x גרם כדי לייבש את המטריצה של תמיסת השטיפה השיורית.
  23. הסר את מסנן הסחיטה והנח אותו בצינור תפיסה טרי (ערכת ספין DNA). יבשו את מסנן הסחיטה באוויר למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  24. חממו את המים נטולי ה-DNAse (ערכת סיבוב DNA) ב-55°C למשך 5 דקות. הוסף 50 μL של מים נטולי DNAse וערבב בעדינות את המטריצה על קרום המסנן עם קצה פיפטה לפליטה יעילה של ה- DNA. תן לדגימות לעמוד ב- RT למשך דקה אחת, ולאחר מכן בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב- 14500 x גרם כדי לשלול DNA.
  25. מניחים את הדגימות על קרח. טען את תערובת הדגימה (2 μL של מדגם + 2 μL של מים + 1 μL של חיץ העמסה) לתוך ג'ל. למדוד את ריכוז הדנ"א.
  26. אחסן את הדגימות ב -20 °C.
  27. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את הדנ"א שחולץ.
    הערה: נפח של 1 μL של DNA הושמט וכומת, ואיכות הדנ"א נצפתה ביחס A260/A280.

3. אלקטרופורזה DNA

  1. הכינו ג'ל אגרוז 1% בחיץ 0.5 Tris/Borate/EDTA (TBE) (20 מ"ל לג'ל מיני, 70-100 מ"ל לג'ל בינוני). שוקלים אגרוז+חיץ, מרתיחים במיקרוגל כדי להמיס אגרוז, שוקלים מחדש ומוסיפים dH2O למשקל המקורי. מצננים את תמיסת האגרוז ל 55-60 מעלות צלזיוס ויוצקים לתוך הג'ל לשעבר עם הרכבת מסרק. השאירו את הג'ל להתמצקות.
  2. יש להוסיף 1 μL של חיץ העמסת ג'ל 10x לדגימה (10 μL) ולהעמיס על הג'ל ליד סמן משקל מולקולרי. יש לעבור משלילי (שחור) לחיובי (אדום) במתח של 100-115 וולט (ג'ל גדול) או 90 וולט (מיני ג'ל) עד שהצבע הכחול קרוב לתחתית.
  3. יש לצבוע בג'ל למשך 30 דקות ב-1 μL/mL ethidium bromide או SYBR green (יש צורך בכפפות ניטריל ובמשקפי מגן), יש לשטוף במים ולצפות תחת מקור אור אולטרה סגול (UV). מתוך הדגימות הכפולות, בחר את התשואה הגבוהה ביותר לעיבוד נוסף.

4. ריצוף בתפוקה גבוהה

  1. הגבירו את האזור ההיפר-משתנה V4 של הגן 16S rRNA באמצעות פריימרים ספציפיים 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') ו-806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. הגדר את תנאי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) על 94 ° C למשך 2 דקות, 30 מחזורים של 94 ° C עבור 20 שניות, 58 ° C עבור 20 שניות, 65 ° C עבור דקה אחת ו- 65 ° C במשך 10 דקות (הארכה סופית).
  2. בצע תגובות PCR עם תערובת מאסטר PCR באיכות גבוהה (טבלה של חומרים).
  3. צור ספריות עם ערכת הכנת ספריית DNA ולאחר מכן רצף באמצעות ריצוף זוגי על פלטפורמת ריצוף.
    הערה: כאן, הספריות שנוצרו באמצעות NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit רוצפו באמצעות ריצוף Illumina משולב (2 × 250 bp) על פלטפורמת novaseq6000.
  4. בצע את שלבי הרצף:
    1. שלב 1: גזירת הדנ"א עם אנזים, בדרך כלל בשיטה שבוחרת גודל כללי.
      1. הוסף 3.5 μL של חיץ ריצוף ו 1.5 μL של תערובת אנזימים ל 25 μL של DNA (בערך 1 מיקרוגרם,) לערבב 10 פעמים עם פיפטה ולהסתובב במהירות.
      2. יש להניח בתרמוסיקר בתנאים הבאים: לחמם מראש את המכסה ב-75°C, (1) 30 דקות עבור 20°C (2) 30 דקות עבור 65°C (3) להחזיק ב-4°C.
    2. שלב 2: הוספת מתאמים באמצעות קשירה
      1. הוסף 15 μL של תערובת מאסטר קשירה, 1.25 μL של מתאם, 0.5 μL של משפר קשירה, ו 30 μL של תערובת DNA הכנה קצה עם פיפטה.
      2. יש לדגור בטמפרטורה של 20°C למשך 15 דקות בתרמוסייקלר ולאחר מכן להוסיף 1.5 μL אנזים מגיב כריתה ספציפי לאורציל (USER) לתערובת הקשירה לקבלת סך כולל של 48.26 μL. לדגור 37°C למשך 15 דקות.
      3. הוסיפו 43.5 μL של חרוזים מגנטיים לדנ"א של קשירת המתאם, ערבבו 20 פעמים עם פיפטה ודגרו במשך 5 דקות ב-RT. הפרידו את החרוזים בעזרת מתלה מגנטי, ואז דגרו במשך 5-10 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
      4. לשטוף את הגלולה עם 100 μL של 80% אתנול, יבש במשך 30 שניות, ולשטוף שוב. יש לערבב חרוזים וגלולה ב-8.5 מיקרוליטר של 10 mM Tris HCl/0.1x Tris-EDTA(TE)/HPLCH 20, לערבב עם פיפטה ולדגור ב-RT למשך 2 דקות.
      5. לדגור במדף המגנטי ולהסיר 7.5 μL של DNA מדולל כמו supernatant. מניחים את הנלוט בצינור חדש ומבצעים שלב PCR.
      6. ראשית, הוסף 12.5 μL של תערובת מאסטר, 2.5 μL של פריימר אינדקס i7 פריימר, ו- 2.5 μL של פריימר PCR אוניברסלי / i5 פריימר ל- 7.5 μL DNA קשור מתאם כדי לקבל 25 μL של תערובת תגובת PCR. השתמש במצב ה-PCR הבא: חמם מראש את המכסה ל-103°C. 98°C למשך 30 שניות, 98°C למשך 10 שניות, 65°C למשך 75 שניות, 65°C למשך 5 דקות והחזיקו ב-4°C לאחר 10 מחזורים.
      7. נקו את הדנ"א המוגבר של 25 μL. מוסיפים 22.5 μL של חרוזים מגנטיים ומערבבים 20 פעמים. דוגרים ב-RT למשך 5 דקות ומסירים 50 מיקרוליטר מהסופרנטנט. לשטוף את החרוזים עם 100 μL של 80% אתנול, ולהסיר את כל אתנול על ידי ייבוש חרוזים בעדינות במשך 30 שניות.
      8. מרחפים מחדש את החרוזים החומים הכהים ב-16 מיקרוליטר מים, מערבבים 20 פעמים עם פיפטה ומניחים במדף המגנטי למשך 30-60 שניות. מעבירים 15 μL לצינור חדש.
      9. לקבוע את ריכוז ה- DNA באמצעות פלואורומטר. מערבבים 90 μL של חיץ + 1 μL צבע + 2 μL של דגימת ספריית DNA, וקוראים את הריכוז. מדללים את הדנ"א ל-2 ננומטר, מעמיסים 27-30 מיקרוליטר לתא הזרימה ומניחים אותו ברצף.
    3. שלב 3: רצף את המתאמים, הכלאה של הספריות שנוצרו לעיל למטריצה של תא הזרימה בתבנית ולכידת DNA בהתאם להוראות היצרן. השתמש בו כתבנית לסינתזה השנייה.
      1. לאחר מכן, הגבירו את הגדיל השני לצביר שבטי. הפוך את האשכול לליניארי וחסום את האתרים הפעילים. הוסף פריימר ריצוף כדי לספק אתר לריצוף על ידי סינתזה ברצף לפי פרוטוקול manuacturer.
        הערה: מבחינה כימית, הנוקלאוטידים שעברו שינוי נקשרים לגדיל תבנית הדנ"א באמצעות השלמה טבעית. לכל נוקלאוטיד יש תג פלואורסצנטי וטרמינטור הפיך שחוסם את הכללת הבסיס הבא. לכן, נוכחותו של אות פלואורסצנטי מציינת איזה נוקלאוטיד מוכנס, והטרמינטור נבקע עבור הבסיס הבא להיקשר.
    4. שלב 4: הגבירו את הגדיל בעל החסימה הבודדת כדי לתת אשכולות של רצפים המרוצפים יחד על ידי סינתזה.
      הערה: הצבירים נותנים אות בהיר יותר מגדיל בודד באמצעות סריקה דו-כיוונית וכימיה של רצף דו-ערוצי. תוכנת הרצף מעבירה באופן אוטומטי קבצי קריאת בסיס (*.cbcl) למיקום תיקיית הפלט שצוין לצורך ניתוח נתונים.

5. ביואינפורמטיקה

  1. צור את נתוני הרצף כקבצי FASTQ. נתח כדי לכלול את החלקים הבאים.
    1. חלק א':
      1. שמור את קבצי FASTQ שהתקבלו מהרצף, לחץ כדי לפתוח קובץ גיליון אלקטרוני וצור קבצי מיפוי/מטא נתונים.
      2. פתח את אתר Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), העלה את קבצי FASTQ, קרא QC, סינון וחיתוך ב- QIIME222. הפקד את הרצפים הגולמיים כארכיון קריאת רצף (SRA) ו- GenBank ב- NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. חלק II: עבור אל אתר האינטרנט של Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), בצע את הקריאות הזוגיות, החלפת המסננים ושגיאות כימרה, והתמזג באמצעות DADA223. השתמש במסווג Naive Bayes שהוכשר על בסיס הנתונים Silva version 132 99% OTU כדי לבצע הקצאה טקסונומית חיידקית בדמיון של 97%24.
    3. חלק שלישי: פתחו את אתר MicrobiomeDB, לחצו להעלאת קבצים וצרו מגוון אלפא של OTU, גיוון בטא, שפע יחסי ועקומות נדירות (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. חלק IV: פתח גיליון אלקטרוני והעבר נתונים כדי ליצור מפות חום, דיאגרמות חיתוך קבוצות (Venn) וגודל אפקט ניתוח דיסקרימיננטי ליניארי (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. ניתוח סטטיסטי

  1. פתח את QIIME222, וקבע את ההבדלים המשמעותיים במגוון אלפא בין קבוצות באמצעות סקריפט אלפא-קבוצה-מובהקות. זה יבצע גם את מבחן Kruskal-Wallis.
  2. קבע את ההבדלים במגוון בטא בין קבוצות באמצעות PERMANOVA, כולל מבחן זוגות25.
  3. השיגו את ההבדלים המשמעותיים במבנה קהילת החיידקים בין הקבוצות באמצעות MicrobiomeDB. ערך p ≤0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כמות ואיכות הדנ"א המופק מענבים חייבים, יין מתסיס ויין סופי נקבעו לראשונה; ערך הכמות נע בין 15-87 ננוגרם/מיקרוליטר (טבלה 1).

ריצוף וביואינפורמטיקה
רצף התפוקה הגבוהה של Illumina יצר קובץ FASTQ שיובא ל- Nephele ונצפה בפלטפורמת QIIME 226. ראשית, תוכנת FastQC שימשה לבדיקת איכות הרצף. לאחר מכן, הוא קוצץ בשני הקצוות של 5' ו-3' כדי לחסל נוקלאוטידים באיכות ירודה, נורעש, מוזג והתרוקן מרצפים כימריים לפני שהתקבץ ל-OTUs (הגדרה תפעולית למין) באמצעות DADA2 denoiser23. הם מופו לטקסה חיידקית באמצעות מסד הנתונים SILVA v138.1. הרצפים קובצו ל-OTU בהתבסס על דמיון של 99% ברצף הנוקלאוטידים. איור 1 מראה את עקומות ה-DADA2 rarefaction עבור ה-OTUs; הוא הגיע לרמה. זה הצביע על כך שמספיק רצפים כוסו כדי להצביע על רוב המגוון המיקרוביאלי. ניתוח משוכפל של הרצפים לא יצר הבדל משמעותי.

מפת החום המבוססת על השפע היחסי של חיידקים במשטרים שונים, מענבים ועד יין, מוצגת באיור 2. הפילה הדומיננטית ביותר המסומנת באדום מורכבת מפרוטאובקטריה, אקטינובקטריוטה (Actinobacteriota), פירמיקוטס (Firmicutes), בקטרואידוטה (Bacteroidota), פוסובקטריוטה (Fusobacteriota), ואחריה Verrucomicrobiota, הלובקטרוטה (Halobacterota), דסולפובקטרוטה (Desulfobacterota), מיקסוקוקוטה (Myxococcota) ואצידובקטריוטה (Acidobacteriota). החיידקים הכי פחות נפוצים סומנו בכחול. רבות מקבוצות אלה היו קיימות בחייבים, כאשר שמרים נוספו אך נעדרו במהלך התסיסה, במיוחד Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota ו Elusimicrobiota. השפע היחסי נקבע גם ברמת הסוג, והתוצאות הצביעו על סוגים חשובים כמו Enterobacteriaceae ו-Lactobacillaceae, כפי שמוצג באיור 3. ניתוח דיאגרמת Venn של ה-OTU הייחודי המשותף גילה כי 15 חיידקים היו נוכחים מענבי היין ועד ליין הסופי (איור 4). תוצאות ריצוף האמפליקון המבוסס על אזור המשתנה V4 הצביעו גם על מגוון אלפא בשני הטרמינטונים R ו-L. איור 4 מראה את אחידות המינים כסימן להתפלגות, שהיא שונה בין שני הטיפולים התזונתיים. הנתונים הראו כי שינוי הגיוון בסטימולה סוביניון בלאן + פרמידה O היה נמוך מ-1 ב-13.4 בריקס, והאחידות מתקרבת לאפס כאשר השפע היחסי משתנה. הנתונים נותחו גם עבור גיוון בטא; איור 5 מראה את ההבדל בין שתי התסיסות R ו-L; החיידקים היו דומים בשלב הוספת השמרים והשמרים. היה שינוי בחיידקים בשלב התסיסה של שני הטיפולים, וזה נראה דומה ביין הסופי (איור 6).

Figure 1
איור 1: חלקות נדירות של OTUs שנצפו. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מפת חום יחסית של שפע. מפת החום של השפע היחסי ברמות הפילום R ו-L לא הייתה שונה באופן משמעותי (p ≤0.05). סרגל המקרא מציין את תוצאת המפתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
תרשים 3: השפע היחסי של עשרת המסים המובילים. השפע היחסי ברמת הסוג של עשרת הטקסים המובילים המדורגים על ידי התקשורת עם מבחן סכום הדירוג של Wilcoxon (p ≤0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn). החיידקים הייחודיים והמשותפים בין החובה, תוספת שמרים, תסיסה ויין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מגוון אלפא של Traminette R ו-Traminette L. אלפא מגוון של מדד H של שאנון של שני Fermaid O תזונתיים ו Stimula Sauvignon blanc ו Fermaid O (Dunn > 0.05) מבוסס על ניתוח של מבחן Kruskal-Wallis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
תרשים 6: ניתוח רכיבים עיקריים. ניתוח רכיבים עיקריים של נתוני 16S rRNA של מגוון בטא בהתבסס על Bray-Curtis של שני Fermaid O ו- Stimula Sauvignon Blanc ו- Fermaid O בשלבים שונים של ייצור יין. העיגול הכחול מייצג מקבץ של שלבי חיבור חובה ושמרים. העיגול האדום מציין את היין הסופי והעיגול השחור הוא שלב התסיסה בשני הטיפולים. ציר 1 וציר 2 הם וריאציות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תאריך הדגימה לדוגמה A260/A280 ריכוז ng/μL Traminette R A260/A280 ריכוז ng/μL Traminette L
8/30/21 ענבה 1.762 37 1.75 28
8/31/31 חייב 1.769 23 1.818 20
09-02-2021 מנוחה 1.667 15 -1 1
09-04-2021 שמרים נוספים 2.185 59 1.968 61
09-06-2021 תסיסה 2.023 87 2.048 43
09-09-2021 תסיסה 3.4 17 2.048 43
9/14/21 יין סופי 2.143 30 2.042 49

טבלה 1: כמות ואיכות הדנ"א המופק מענבים חייבים, יין מותסס ויין סופי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול המטגנומיקה מתחיל מדגימת הענב, וכאשר מוסיפים שמרים לחובה, היין המתסיס ודגימות היין הסופיות. לאחר מכן בוצע מיצוי דנ"א כפול שהופק בהצלחה מדגימות אלה. הכמויות שהתקבלו השתנו בריכוז מ 15 ng / μL ל 87 ng / μL. זה מראה כי פרוטוקול מיצוי DNA יעיל למחקרים מטאגנומיים של יין. למרות שאיכות הדנ"א ב-A260/A280 משתנה, ניתן לייחס זאת לפרמטרים שונים שעשויים להשפיע על המיצוי, כגון ריכוז אלכוהול ומטבוליטים אחרים של תסיסה שהתפתחו במהלך התסיסה ולאחריה, כמו גם חומרים צמחיים אורגניים אחרים שעלולים לעכב את מיצוי הגנום. מחקרים קודמים דיווחו על תצפית דומה על החומר הצמחי המטאגנומי27. עם זאת, הדנ"א שהופק בפרוטוקול המתואר השיג כמות שהספיקה לשלב הבא של הניתוח. ברקוד ה-PCR הדרוש למחקרים מטא-גנומיים, במיוחד באמצעות פלטפורמת ריצוף Illumina, דורש שכמות ה-DNA המינימלית תוגדר על 1 ng/L. אזור V4 רוצף, וקביעת מגוון החיידקים דורשת שימוש בריצוף גנים 16S rRNA; לגן זה יש אזורים משתנים שונים מ V1-V923. בסך הכל 6,393,443 קריאות רצף זוגי, עם ממוצע של 399590.1875 ± 138442.6148 מהדנ"א שהופק מהדגימות השונות. V4 נמצא בשימוש נפוץ, והוא מכונה האזור ההיפר-משתנה של הגן שטוב לניתוח טקסונומיה ומגוון חיידקי. במהלך הריצוף נוצרו רצפי אילומינה זוגיים של 200-300 bp. ישנן פלטפורמות שונות המשמשות לריצוף דנ"א המופק ממזון ומשקאות מותססים28. הסיבות לשימוש בפלטפורמת Illumina הן כדלקמן: (1) Illumina היא פלטפורמת ריצוף מהדור השני עם תפוקה מצוינת, והכימיה שלה נותנת שיעור שגיאות ופרופיל נמוכים. הוא גם זול בהשוואה לערכות מסחריות זמינות להכנת ספרייה, והקריאות הקצרות יחסית שלו אידיאליות לביטוי דיפרנציאלי. השלב האחרון של הפרוטוקול היה ביואינפורמטיקה, מרכיב חשוב בשימוש בריצוף אמפליקון 16 לקביעת מגוון מיקרוביאלי. בדיקת האיכות של הרצפים שקובץ FASTQ השיג הייתה טובה מאוד, וה- OTUs שהתקבלו מ- QIIME הביאו לניתוח טקסונומי שהוצג בתוצאות של שפע יחסי, אלפא ומגוון בטא.

ריצוף הדור הבא (NGS) הפך לכלי חשוב ליצירת פרופיל של חיידקים בקהילות מיקרוביאליות שונות של תסיסה. במחקר זה, סיווג האמפליקון 16S נעשה לראשונה ברמת הפילום ונצפתה קבוצה מגוונת יותר של חיידקים מאשר דווח בעבר12 במהלך תסיסה של יין ענבים; 15 פילות שותפו גם כן, כפי שעולה מניתוח תוצאת Venn. כמו כן, ניתוח ברמת הסוג הראה נוכחות של סוגים חשובים, כגון Enterobacteriaceae ו Lactobacillaceae שהיו נפוצים יותר במיכל Traminette R. הגבלנו את הניתוח שלנו לטקסונומיה ברמת הסוג; ישנם מחקרים שבהם השיטה שימשה לזיהוי בטקסונומיה ברמת המין באמצעות הסקה דגמית ברזולוציה גבוהה23. אחת המגבלות של ריצוף אמפליקון היא שנתוני הרצף אינם יכולים לקבוע טקסונומיה ברמת הזן בגלל אורכו הקצר של רצף ה-rRNA 16S. מגבלה נוספת היא זיהוי כלורופלסט ומיטוכונדריה. רצוי אם ניתן להשתמש בהליך הביואינפורמטי כדי לחסל רצפים אלה מכיוון שהם מזהמים של צמחי ענבים. עם זאת, פרוטוקול הגברה המשתמש במהדקי PNA-DNA כדי למקסם את זיהום הכלורופלסט והמיטוכונדריה29. השפע הגבוה של פירמיחמוד בענבים חייב, במהלך התסיסה והיין הסופי, להסכים עם המחקרים הקודמים על ענבי יין30. תוצאות ניתוח מגוון אלפא הצביעו על אחידות החיידקים בכל טיפול תזונתי בתסיסה; נראה כי חומר מזין Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O יצר חיידק מגוון יותר. בנוסף, נתוני מגוון הבטא הראו את השינוי בחיידקים בשלב התסיסה; שינויים דינמיים מצביעים על כך ששלב התסיסה הוא תקופה חשובה מאוד שבה השינויים התזונתיים משפיעים על בחירת החיידקים. הטכניקה ניתנת להתאמה ולשימוש על ידי תעשיות כדי לפקח על התסיסה ולשפר את האיכות והעקביות28. עם זאת, יהיה צורך במחקרים נוספים כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של חומרים מזינים אורגניים על מגוון החיידקים במהלך תסיסה של יין.

מחקר זה הוא הראשון שבחן את מגוון החיידקים במהלך התסיסה של ענבי טרמינט ויין באמצעות ריצוף ברקוד אמפליקון 16S כדי לקבוע את השינויים בחיידקים. זה אישר את מגוון החיידקים ברמת הפילום והסוג. פרוטאובקטריה, ואחריה פירמיקוטים, היו הנפוצים ביותר ככל שהתסיסה התקדמה ליין הסופי. פילות רבות שלא דווחו קודם לכן זוהו באמצעות ריצוף אמפליקון 16S, וזה אישר כי השיטה יכולה לשמש לניטור ייצור יין. מגוון אלפא הראה את התפקיד של שינוי תזונתי; זה השפיע על חיידקי התסיסה, בעוד מגוון בטא מציין את השינויים בשלב התסיסה. מחקרים נוספים נדרשים כדי לחקור את התפקידים הפונקציונליים שרבים מהפילות והסוגים המתוארים ממלאים בתסיסה של יין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

מימון ממענק מועצת המחקר של אוניברסיטת מדינת האפלצ'ים (URC) ומלגת CAPES Print Travel שתמכו בביקור של ארגון המזון והחקלאות של האו"ם באוניברסיטת סאו פאולו, ריבייראו פרטו - סאו פאולו, ברזיל, זוכים להכרת תודה. מחקר זה מומן בחלקו על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. ECPDM אסירת תודה על מענק CAPES Print Travel שתמך בביקורה באוניברסיטת מדינת האפלצ'ים. ECPDM הוא עמית מחקר 2 מה- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel  Promega, Madison, WI USA V3121 Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil  MP Biomedicals, Solon, OH USA 116560-200 DNA extraction 
FastQC software Babraham Institute, United Kingdom Bioinformatics 
Fermaid O Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix  New England Biolabs, USA F630S Polymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext Ultra New England Biolabs, USA NEB #E7103 DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS) Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
Novaseq6000 platform  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
QuiBit Thermoscientific, Waltham, MA, USA DNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer  Molecular device, San Jose, CA, USA DNA quantification 
Sodium Phosphate  Sigma Aldrich 342483 DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
  2. Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
  3. Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
  4. Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
  5. Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
  6. Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
  7. Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
  8. Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
  9. Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
  10. Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
  11. Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
  12. Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
  13. Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
  14. Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
  15. Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
  16. Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
  17. Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
  18. Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
  19. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).
  20. Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
  21. Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
  22. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
  23. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  24. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  25. Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
  26. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  27. Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
  28. van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
  29. Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
  30. Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 202
יצירת פרופיל של אוכלוסיית החיידקים של תסיסה של ענבי טרמינט במהלך ייצור היין באמצעות ריצוף אמפליקון מטאגנומי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goppold, A., Conradie, L., Almeida,… More

Goppold, A., Conradie, L., Almeida, O. G. G. d., De Martinis, E. C. P., Oguntoyinbo, F. A. Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (202), e65598, doi:10.3791/65598 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter