Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Профилирование бактериального сообщества ферментируемого винограда сорта Traminette во время производства вина с использованием метагеномного ампликонного секвенирования

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65598
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

Summary

Здесь мы представляем протокол для описания метагеномики ампликона для определения бактериального сообщества винограда сорта Траминет, бродящего винограда и конечного вина.

Abstract

Достижения в технологии секвенирования и относительно легкий доступ к использованию инструментов биоинформатики для профилирования структур микробных сообществ способствовали лучшему пониманию как культивируемых, так и некультивируемых микробов в винограде и вине. Во время промышленной ферментации микробы, известные и неизвестные, часто ответственны за развитие продукта и неприятный привкус. Таким образом, профилирование бактерий от винограда до вина может позволить легко понять микробную динамику in situ . В этом исследовании бактерии винограда сорта Траминетт должны подвергаться ферментации, а конечное вино подвергалось экстракции ДНК, которая давала от 15 нг/мкл до 87 нг/мкл. Был секвенирован ампликон 16S гипервариабельной области области V4, относительно распространенных бактерий, состоящих из типов Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota, за которыми следуют Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota и Acidobacteriota. Анализ диаграммы Венна общих уникальных таксономических единиц (OTU) показал, что 15 типов бактерий были общими как для виноградного сусла, так и для стадии брожения и конечного вина. С помощью секвенирования ампликонов 16S были обнаружены такие типы, о которых ранее не сообщалось, а также такие роды, как Enterobacteriaceae и Lactobacillaceae. Исследованы различия в использовании органических питательных веществ в вине и их влияние на бактерии; Резервуар Traminette R , содержащий Fermaid O и Traminette L , стимулированный Stimula Sauvignon Blanc + Fermaid O. Альфа-разнообразие с помощью критерия Краскела-Уоллиса определяло степень равномерности. Бета-разнообразие указывало на сдвиг бактерий на стадии брожения для двух обработок, и окончательные винные бактерии выглядели одинаково. Исследование подтвердило, что секвенирование ампликонов 16S может быть использовано для мониторинга изменений бактерий во время производства вина для поддержания качества и лучшего использования виноградных бактерий во время производства вина.

Introduction

Виноград сорта Траминетт характеризуется производством вина превосходного качества, а также заметной урожайностью и частичной устойчивостью к нескольким грибковым инфекциям 1,2,3. Естественное брожение винограда зависит от связанных с ним микроорганизмов, среды производства вина и бродильных сосудов 4,5. Часто многие винодельни полагаются на дикие дрожжи и бактерии для брожения, производства спирта, сложных эфиров, развития аромата и вкуса.

Целью данного исследования является изучение бактериального состава винограда и мониторинг его динамики во время брожения. Тем не менее, современное использование заквасочных культур, таких как Saccharomyces cerevisiae, для первичного брожения, где производится алкоголь, является общим для различных стилей вина7. Кроме того, вторичное брожение, при котором яблочная кислота декарбоксилируется Oenococcus oeni до молочной кислоты, улучшает органолептический и вкусовой профиль вина и снижает кислотность вина 8,9. Благодаря недавним достижениям в использовании методов, не зависящих от культуры, теперь можно определить различные микробы, связанные с винным виноградом и видами, которые переносятся в сусло и участвуют в брожении в разное время вплоть до конечного продукта10.

Роль и динамика диких бактерий из разных сортов винограда, переносимых в сусло во время брожения вина, плохо изучены. Таксономия многих из этих бактерий даже неизвестна, или их фенотипические свойства не охарактеризованы. Это делает их применение в ферментации в кокультуре все еще слабо используемым. Тем не менее, микробиологический культуральный анализ был использован для определения бактериальной популяции, ассоциированной с виноградом и вином10. Широко известно, что селективное культуральное покрытие утомительно, подвержено контаминации, имеет низкую воспроизводимость, а выход может быть сомнительным; Он также пропускает виды бактерий, чьи потребности в росте неизвестны. Предыдущие исследования показывают, что методологии, основанные на генах 16S рРНК, не зависящие от культуры, предлагают более надежный и экономически эффективный подход к характеристике сложных микробных сообществ11. Например, секвенирование гипервариабельных участков гена 16S рРНК было успешно использовано для изучения бактерий в виноградных листьях, ягодах и вине 12,13,14. Исследования показали, что для исследований микробиома подходит использование метабаркодирования 16S рРНК или полнометагеномного секвенирования15. Появляется информация о возможной связи бактериального разнообразия с их метаболическими свойствами во время производства вина, что может помочь в определении энологических свойств и терруара16.

Подчеркнута необходимость максимального использования преимуществ метагеномных инструментов, использующих секвенирование нового поколения (NGS) для изучения микробной экологии винограда и вина16,17. Кроме того, использование культурно-независимых методов, основанных на высокопроизводительном секвенировании, для профилирования микробного разнообразия пищевой и ферментационной экосистемы стало очень актуальным и ценным для многих лабораторий и рекомендовано для промышленного использования18,19. Это дает преимущество в обнаружении и таксономическом профилировании существующих микробных популяций и вклада микробов окружающей среды, их относительной многочисленности и альфа- и бета-разнообразия20. Секвенирование вариабельной области 16S-области стало важным геном выбора и использовалось в различных микробных экологических исследованиях.

В то время как многие исследования сосредоточены на грибах, особенно дрожжах, во время брожения вина21, в этом исследовании сообщалось о секвенировании ампликона 16S и биоинформатических инструментах, используемых для изучения бактерий во время ферментации винограда Traminette для производства вина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Экспериментальное производство вина

  1. Получите виноград Traminnette из вина Dynamis Estate в Джонсвилле, Северная Каролина, очистите от гребней и измельчите, чтобы выпустить сусло в два отдельных ферментера с открытым верхом объемом 600 л и оставить на кожице примерно на 4 дня с закрытыми крышками.
  2. Пробивайте крышки один раз в день, чтобы кожа оставалась влажной и ограничивала выработку летучих кислот (VA).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идея заключается в том, что многие ароматические предшественники (монотерпены) находятся в кожице и оставляют сок в контакте с кожурой, чтобы увеличить ароматический потенциал вина.
  3. Через 4 дня Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Эти дрожжи были выбраны, так как они являются сильным ферментатором и связаны с усилением сортового характера вина из винограда.
  4. В один резервуар, Traminette R, добавьте 20 г/ч Fermaid O, когда Brix составляет 17,7, и 20 г/ч, Fermaid O и 12,5 г/ч, Fermaid K при 13,1 г/ч, чтобы достичь безопасности ферментации, в то время как другой резервуар Traminette L, добавьте 40 г/ч Stimula Sauvignon Blanc, когда Brix достигнет 17,1. Также добавьте 20 г/ч Fermaid O, когда градус Брикса достигнет 13,4, чтобы усилить сортовой характер вина.
  5. Возьмите дубликаты образцов сусла (1-й день), дрожжей (4-й день), ферментированного сусла (15-й день) и готового вина (30-й день) и храните при -20 °C перед экстракцией ДНК и метагеномным анализом.

2. Выделение ДНК для метагеномики

  1. Все дубликаты образцов, полученные выше, храните на льду до первого центрифугирования.
  2. Перелейте 20 мл ферментированного образца в стерильную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 мл.
  3. Добавьте 10 мл холодной воды и гомогенизируйте (вмешайте). Центрифугу в течение 1 мин при 800 x g при 4 °C и перелейте надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе из образца удаляются твердые частицы.
  4. Повторите шаг 2.3 два раза и смешайте надосадочную жидкость в той же пробирке.
  5. Центрифуга надосадочная жидкость при 3 000 x g при 4 °C в течение 20 мин для гранулирования клеток. Выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS, переложите в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл и центрифугируйте при 14 000 x g в течение 2 минут. Выполните еще две стирки с помощью PBS.
  7. На этом этапе заморозьте гранулы при -20°C или выполните шаг 2.8. Важно, чтобы все образцы обрабатывались одинаково.
  8. Добавьте 978 мкл натрий-фосфатного буфера. Приготовьте натрийфосфатный буфер, добавьте 3,1 г2PO4· Н2Ои 10,9 гNa2HPO4 (безводный) в дистиллированномH2O, чтобы получить объем 1 л, и довести рН до 7,4.
  9. Добавьте 122 мкл буфера ДНК (набор для спина ДНК) и вмешайте.
  10. Дать постоять в холодильнике (4 °C) от 45 мин до 1 ч. Перемешивайте образцы каждые 15 минут. Этот шаг можно оставить на ночь (но/н) или до тех пор, пока вы не будете готовы продолжить использование набора для спина ДНК.
  11. Перелейте 1 мл образца в пробирку с раствором лизиса 1 (набор для спина ДНК) и закрутите колпачок (напишите номер образца на боковой стороне пробирки, а не на крышке; реагенты набора удалят все, что написано на крышке).
  12. Гомогенизируйте образец в шлифовальной машине для взбивания шариков (6,5 м/с, CY: 24 x 2) в течение 60 с три раза. Если в шлифовальной машине для взбивания бисера есть устройство для кладки льда, положите под трубочки 50 г сухого льда. Если нет, держите образцы на мокром льду в течение 5 минут между каждым этапом гомогенизации.
  13. Центрифуга Lysing Matrix E пробирки (набор для спина ДНК) в течение 1 мин при 16800 x g (или максимальной скорости).
  14. Перелейте надосадочную жидкость в чистую микропробирку. После этого добавьте 250 мкл реагента для осаждения белкового раствора (PPS) (набор для отжима ДНК) и перемешайте, встряхнув пробирку вручную 10 раз.
  15. Центрифугу в течение 5 мин при 16800 х г до гранулирования осадка.
  16. Перелейте надосадочную жидкость в стерильную пробирку объемом 15 мл. Добавьте в надосадочную жидкость 1 мл суспензии связывающего матрикса (набор для спина ДНК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием ресуспендируйте суспензию связывающей матрицы до тех пор, пока она не станет однородной.
  17. Переверните пробирки вручную в течение 2 минут, затем дайте пробиркам постоять на решетке в течение 3 минут (для оседания кремнеземной матрицы).
  18. Осторожно удалите 1 мл надосадочной жидкости. Ресуспендируйте матрицу в оставшейся надосадочной жидкости.
  19. Перелейте 600 мкл смеси в пробирку со спиновым фильтром (ДНК-спин-набор) и центрифугу в течение 1 мин при 14500 x g.
  20. Добавьте оставшуюся смесь и центрифугу.
  21. Сцедите проточный и добавьте 500 мкл промывочного раствора (набор для отжима ДНК) в трубку со спиновым фильтром и центрифугу в течение 1 мин при 14500 x g (обязательно добавьте EtOH в промывочный раствор; см. Руководство по продукту). Сцедите проточную жидкость и повторите стирку еще два раза (всего 3 стирки).
  22. Декантируйте проточную и центрифугу еще на 2 мин при 14 500 x g , чтобы высушить матрицу остаточного промывочного раствора.
  23. Снимите спин-фильтр и поместите его в свежую улавливающую пробирку (набор для отжима ДНК). Высушите отжимной фильтр на воздухе в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
  24. Нагрейте воду без ДНК (набор для отжима ДНК) до 55 °C в течение 5 минут. Добавьте 50 мкл воды, не содержащей ДНК, и осторожно перемешайте матрицу на мембране фильтра наконечником пипетки для эффективного элюирования ДНК. Дайте образцам постоять при RT в течение 1 минуты, затем центрифугируйте в течение 1 минуты при 14500 x g для элюирования ДНК.
  25. Поместите образцы на лед. Загрузите смесь образцов (2 мкл образца + 2 мкл воды + 1 мкл загрузочного буфера) в гель. Измерьте концентрацию ДНК.
  26. Хранят образцы при температуре -20 °C.
  27. Используйте спектрофотометр для количественного определения извлеченной ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем ДНК в 1 мкл был отброшен и количественно определен, и качество ДНК было отмечено в соотношении A260/A280.

3. ДНК-электрофорез

  1. Приготовьте 1% агарозный гель в буфере 0,5 трис/борат/ЭДТА (КЭ) (20 мл для мини-геля, 70-100 мл для среднего геля). Взвесьте агарозу + буфер, вскипятите в микроволновой печи, чтобы агароза расплавилась, повторно взвесьте и добавьте dH2O к исходному весу. Раствор агарозы охладить до 55-60 °С и перелить в гелеобразователь с гребенчатым сбором. Оставьте гель застыть.
  2. Добавьте 1 мкл 10-кратного буфера для загрузки геля к образцу (10 мкл) и загрузите на гель рядом с маркером молекулярной массы. Прогоните от отрицательного (черный) к положительному (красный) давлению 100-115 В (большой гель) или 90 В (мини-гель) до тех пор, пока синий краситель не окажется у дна.
  3. Окрасьте гель в течение 30 минут бромидом этидия объемом 1 мкл/мл или зеленым цветом SYBR (необходимы нитриловые перчатки и защитные очки), промойте в воде и просмотрите под источником ультрафиолетового (УФ) света. Из дубликатов образцов выберите наибольший выход для дальнейшей переработки.

4. Высокопроизводительное секвенирование

  1. Амплифицируют гипервариабельную область V4 гена 16S рРНК с помощью специфических праймеров 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') и 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Установите условия полимеразной цепной реакции (ПЦР) на 94 °C в течение 2 мин, 30 циклов по 94 °C в течение 20 с, 58 °C в течение 20 с, 65 °C в течение 1 мин и 65 °C в течение 10 мин (окончательное продление).
  2. Проводите ПЦР-реакции с помощью высокоточной мастер-смеси ПЦР (таблица материалов).
  3. Создавайте библиотеки с помощью набора для подготовки библиотеки ДНК, а затем секвенируйте с помощью секвенирования с парными концами на платформе секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь библиотеки, сгенерированные с помощью NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit, были секвенированы с помощью секвенирования с парным концом Illumina (2 × 250.н.) на платформе novaseq6000.
  4. Выполните следующие действия:
    1. Шаг 1: Разрезайте ДНК с помощью фермента, обычно методом, который отбирает общий размер.
      1. Добавьте 3,5 мкл буфера для секвенирования и 1,5 мкл смеси ферментов к 25 мкл ДНК (около 1 мкг), перемешайте 10 раз пипеткой и быстро отжимите.
      2. Поместите в амплификатор со следующими условиями: предварительно нагрейте крышку до 75 °C, (1) 30 минут для 20 °C, (2) 30 минут для 65 °C, (3) держать при 4 °C.
    2. Шаг 2: Добавьте адаптеры с помощью лигирования
      1. Добавьте пипеткой 15 мкл мастер-смеси для лигирования, 1,25 мкл адаптера, 0,5 мкл усилителя лигирования и 30 мкл смеси ДНК для препирования концов.
      2. Инкубируют при 20 °C в течение 15 мин в амплификаторе, а затем добавляют 1,5 мкл фермента урацил-специфического эксцизионного реагента (USER) в смесь для лигирования до получения в общей сложности 48,26 мкл. Инкубируют при 37 °C в течение 15 мин.
      3. Добавьте 43,5 мкл магнитных шариков к ДНК для лигирования адаптера, перемешайте 20 раз пипеткой и инкубируйте в течение 5 мин при RT. Отделите шарики с помощью магнитного штатива, затем инкубируйте в течение 5-10 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
      4. Промойте гранулу 100 мкл 80% этилового спирта, высушите в течение 30 с и снова промойте. Элюируют гранулы и гранулы в 8,5 мкл 10 мМ Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, смешивают с пипеткой и инкубируют при RT в течение 2 мин.
      5. Инкубируют в магнитной стойке и удаляют 7,5 мкл элюированной ДНК в качестве надосадочной жидкости. Поместите элют в новую пробирку и проведите этап ПЦР.
      6. Во-первых, добавьте 12,5 мкл мастер-смеси, 2,5 мкл индексного праймера i7 и 2,5 мкл универсального праймера ПЦР/праймера i5 к 7,5 мкл ДНК, лигированной адаптером, чтобы получить 25 мкл реакционной смеси ПЦР. Используйте следующие условия ПЦР: предварительно нагрейте крышку до 103 °C. 98 °C в течение 30 с, 98 °C в течение 10 с, 65 °C в течение 75 с, 65 °C в течение 5 мин и держать при 4 °C после 10 циклов.
      7. Очистите амплифицированную ДНК объемом 25 мкл. Добавьте 22,5 мкл магнитных шариков и перемешайте 20 раз. Инкубируют при РТ в течение 5 мин и удаляют 50 мкл надосадочной жидкости. Вымойте шарики 100 мкл 80% этанола и удалите весь этанол, аккуратно высушив шарики в течение 30 с.
      8. Суспендируйте темно-коричневые шарики в 16 мкл воды, 20 раз перемешайте пипеткой и поместите в магнитную стойку на 30-60 с. Перелейте 15 мкл в новую пробирку.
      9. Определите концентрацию ДНК с помощью флуориметра. Смешайте 90 мкл буфера + 1 мкл красителя + 2 мкл библиотечного образца ДНК и считайте концентрацию. Разбавляют ДНК до 2 нМ, загружают 27-30 мкл в проточную ячейку и помещают в секвенатор.
    3. Шаг 3: Секвенирование адаптеров, гибридизация сгенерированных выше библиотек с матрицей проточной ячейки и захват ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Используйте его в качестве шаблона для второго синтеза.
      1. Затем амплифицируйте вторую прядь в клональный кластер. Линеаризуйте кластер и заблокируйте активные сайты. Добавьте праймер по секвенированию, чтобы обеспечить место для секвенирования путем синтеза в последовательности в соответствии с протоколом производителя.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Химически модифицированные нуклеотиды связываются с матричной цепью ДНК, используя естественную комплементарность. Каждый нуклеотид имеет флуоресцентную метку и обратимый терминатор, блокирующий включение следующего основания. Поэтому наличие флуоресцентного сигнала указывает на то, какой нуклеотид вставлен, а терминатор расщепляется для связывания следующего основания.
    4. Шаг 4: Усилите односвязанную цепь, чтобы получить кластеры последовательностей, которые секвенируются в тандеме с помощью синтеза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры дают более яркий сигнал, чем одноцепочечный, благодаря двунаправленному сканированию и двухканальному химическому секвенированию. Программное обеспечение для виртуализации автоматически передает файлы базовых вызовов (*.cbcl) в указанное расположение выходной папки для анализа данных.

5. Биоинформатика

  1. Сгенерируйте данные последовательности в виде файлов FASTQ. Проанализируйте, чтобы включить следующие части.
    1. Часть I:
      1. Сохраните файлы FASTQ, полученные из секвенсора, нажмите, чтобы открыть файл электронной таблицы, и создайте файлы сопоставления и метаданных.
      2. Откройте веб-сайт Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), загрузите файлы FASTQ, ознакомьтесь с контролем качества, фильтрацией и обрезкой в QIIME222. Депонирование необработанных последовательностей в виде архива чтения последовательностей (SRA) и GenBank в NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. Часть II: Перейдите на веб-сайт Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), выполните демультиплексное чтение на парных концах, замену фильтров и ошибки химеры, а затем выполните слияние с помощью DADA223. Используйте упрощенный байесовский классификатор, обученный на базе данных Silva версии 132 99% OTU, для выполнения таксономического присвоения бактерий при сходстве 97%24.
    3. Часть III: Откройте веб-сайт MicrobiomeDB, нажмите, чтобы загрузить файлы, и сгенерируйте кривые альфа-разнообразия, бета-разнообразия, относительной распространенности и разрежения OTU (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. Часть IV: Откройте электронную таблицу и перенесите данные для создания тепловых карт, диаграмм Венна и линейного дискриминантного анализа Размер эффекта (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Статистический анализ

  1. Откройте QIIME222 и определите значимые различия в альфа-разнесении между группами с помощью сценария значимости альфа-группы. При этом также будет выполнен тест Краскела-Уоллиса.
  2. Определите различия в бета-разнообразии между группами с помощью метода PERMANOVA, включая попарный тест25.
  3. Получить значимые различия в структуре бактериального сообщества между группами с помощью MicrobiomeDB. p-значение ≤0,05 считалось статистически значимым.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сначала определяли количество и качество ДНК, извлеченной из виноградного сусла, бродящего вина и конечного вина; количественное значение колеблется в пределах 15-87 нг/мкл (табл. 1).

Секвенирование и биоинформатика
Высокопроизводительный секвенсор Illumina сгенерировал файл FASTQ, который был импортирован в Nephele и просмотрен на платформе QIIME 226. Во-первых, для проверки качества последовательности использовалось программное обеспечение FastQC. Затем его обрезали на 5'- и 3'-концах, чтобы удалить нуклеотиды низкого качества, шумообразовали, слили и обеднили химерными последовательностями перед кластеризацией в ОТУ (рабочее определение вида) с помощью шумоподавителя DADA223. Они были сопоставлены с таксонами бактерий с использованием базы данных SILVA v138.1. Последовательности были сгруппированы в OTU на основе 99% сходства нуклеотидных последовательностей. На рисунке 1 показаны кривые разрежения DADA2 для OTU; Он достиг плато. Это указывает на то, что было охвачено достаточное количество последовательностей, чтобы указать на большую часть микробного разнообразия. Повторный анализ последовательностей не выявил каких-либо существенных различий.

Тепловая карта, основанная на относительном обилии бактерий при различных режимах от виноградного сусла до вина, показана на рисунке 2. Наиболее доминирующие типы, обозначенные красным цветом, состоят из Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota, а за ними Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota и Acidobacteriota. Наименее распространенные бактерии были обозначены синим цветом. Многие из этих групп присутствовали в сусле при добавлении дрожжей, но отсутствовали во время брожения, особенно Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaettota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota и Elusimicrobiota. Относительная численность также была определена на уровне рода, и результаты показали важные роды, такие как Enterobacteriaceae и Lactobacillaceae, как показано на рисунке 3. Анализ диаграммы Венна общего уникального OTU показал, что от виноградного сусла до готового вина присутствовало 15 бактерий (рис. 4). Результаты секвенирования ампликонов на основе вариабельной области V4 также показали альфа-разнообразие в двух Traminette R и L. На рисунке 4 показана равномерность видов как признак распределения, которая отличается между двумя методами питания. Данные показали, что сдвиг разнообразия в Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O был ниже 1 при 13,4 градусах Брикса, а равномерность приближается к нулю по мере изменения относительной численности. Данные также были проанализированы на бета-разнообразие; На рисунке 5 показана разница между двумя ферментациями Traminette R и L; Бактерии были похожи на стадии добавления сусла и дрожжей. На стадии брожения для двух обработок произошел сдвиг в бактериях, и в конечном вине он выглядит аналогично (Рисунок 6).

Figure 1
Рисунок 1: Графики разрежения наблюдаемых ОТУ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Тепловая карта относительного изобилия. Тепловая карта относительной численности на уровнях R и L типов достоверно не отличалась (р ≤0,05). Строка условных обозначений указывает ключевую оценку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Относительное обилие первых десяти таксонов. Относительная численность на уровне рода первой десятки таксонов, ранжированных по средствам массовой информации с помощью критерия ранговой суммы Вилкоксона (p ≤0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Диаграмма Венна. Уникальные и общие бактерии среди сусла, добавленных дрожжей, брожения и вина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Альфа-разнесение Traminette R и Traminette L. Альфа-разнообразие индекса Хирша Шеннона двух питательных сортов Fermaid O и Stimula Sauvignon Blanc и Fermaid O (Dunn > 0,05) на основе анализа критерия Краскела-Уоллиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Анализ главных компонент. Анализ главных компонент данных бета-разнообразия 16S рРНК на основе Брея-Кертиса двух питательных сортов Fermaid O и Stimula Sauvignon Blanc и Fermaid O на разных стадиях производства вина. Синий круг представляет собой скопление стадий добавления сусла и дрожжей. Красный круг указывает на конечное вино, а черный круг - на стадию брожения в двух процессах. Оси 1 и 2 являются вариациями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дата отбора проб Образец А260/А280 Концентрация нг/мкл Traminette R А260/А280 Концентрация нг/мкл Traminette L
8/30/21 Виноград 1.762 37 1.75 28
8/31/31 Должен 1.769 23 1.818 20
09-02-2021 Отдых 1.667 15 -1 1
09-04-2021 Добавлены дрожжи 2.185 59 1.968 61
09-06-2021 Ферментирующий 2.023 87 2.048 43
09-09-2021 Ферментирующий 3.4 17 2.048 43
9/14/21 Готовое вино 2.143 30 2.042 49

Таблица 1: Количество и качество ДНК, извлеченной из виноградного сусла, бродящего вина и конечного вина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол метагеномики начинается с отбора проб виноградного сусла, а при добавлении в сусло дрожжей - бродящего вина и окончательных образцов вина. За этим последовало выделение дубликатов ДНК, которое было успешно извлечено из этих образцов. Полученные количества варьировали в концентрации от 15 нг/мкл до 87 нг/мкл. Это показывает, что протокол экстракции ДНК эффективен для метагеномных исследований вина. Хотя качество ДНК в A260/A280 варьируется, это может быть связано с различными параметрами, которые могут повлиять на экстракцию, такими как концентрация спирта и других метаболитов ферментации, которые образуются во время и после ферментации, а также другие органические растительные материалы, которые могут ингибировать экстракцию генома. В предыдущих исследованиях сообщалось об аналогичном наблюдении за метагеномным растительным материалом27. Тем не менее, ДНК, выделенная в описанном протоколе, достигла количества, достаточного для следующего этапа анализа. Штрих-кодирование ПЦР, необходимое для метагеномных исследований, особенно с использованием платформы секвенирования Illumina, требует, чтобы минимальное количество ДНК было установлено на уровне 1 нг/л. Секвенирован участок V4, а определение бактериального разнообразия требует использования секвенирования гена 16S рРНК; этот ген имеет различные вариабельные участки от V1-V923. В общей сложности было прочитано 6 393 443 последовательности с парными концами, в среднем 399590,1875 ± 138442,6148 из ДНК, извлеченной из различных образцов. V4 широко используется, и его называют гипервариабельной областью гена, которая хороша для бактериального таксономического анализа и анализа разнообразия. Во время секвенирования было сгенерировано парное секвенирование Illumina около 200-300.н. Существуют различные платформы, используемые для секвенирования ДНК, выделенной из пищевых продуктов и ферментированных напитков28. Причины использования платформы Illumina следующие: (1) Illumina — это платформа секвенирования 2-го второго поколения с превосходной производительностью, а ее химический состав обеспечивает низкий уровень ошибок и профиль. Он также доступен по цене по сравнению с имеющимися коммерческими наборами для подготовки к библиотеке, а его относительно короткие чтения идеально подходят для дифференциального выражения. Заключительным этапом протокола стала биоинформатика, важный компонент использования секвенирования ампликона 16 для определения микробного разнообразия. Проверка качества последовательностей, полученных файлом FASTQ, была очень хорошей, а ОТУ, полученные из QIIME, привели к таксономическому анализу, показанному в результатах относительной численности, альфа- и бета-разнообразия.

Секвенирование нового поколения (NGS) стало важным инструментом для профилирования бактерий различных микробных сообществ ферментации. В этом исследовании классификация ампликонов 16S была впервые проведена на уровне типа, и во время брожения виноградного вина была замечена более разнообразная группа бактерий, чем сообщалосьранее; Кроме того, было выявлено 15 типов, о чем свидетельствует анализ результатов исследования Венна. Кроме того, анализ на уровне рода показал наличие важных родов, таких как Enterobacteriaceae и Lactobacillaceae, которые были более многочисленны в аквариуме Traminette R. Мы ограничили наш анализ таксономией на уровне рода; Существуют исследования, в которых этот метод использовался для идентификации на таксономии на уровне видов с помощью вывода выборки с высоким разрешением23. Одним из ограничений секвенирования ампликонов является то, что данные о последовательностях не могут определить таксономию на уровне штамма из-за короткой длины последовательности 16S рРНК. Еще одним ограничением является обнаружение хлоропластов и митохондрий. Желательно, чтобы биоинформатическая процедура была использована для устранения этих последовательностей, так как они являются загрязняющими веществами виноградных растений. Тем не менее, протокол амплификации с использованием зажимов ПНК-ДНК для максимального загрязнения хлоропластов и митохондрий29. Высокое содержание Firmicute в винограде во время брожения и окончательного вина согласуется с предыдущими исследованиями винного винограда30. Результаты анализа альфа-разнообразия показали равномерность бактерий при каждой ферментационной питательной обработке; По-видимому, питательное вещество Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O породило более разнообразную бактерию. Кроме того, данные о бета-разнообразии показали сдвиг бактерий на стадии ферментации; Динамические изменения указывают на то, что стадия ферментации является очень важным периодом, когда изменения в питании влияют на бактериальный отбор. Этот метод может быть адаптирован и использован промышленными предприятиями для мониторинга брожения и улучшения качества и консистенции28. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять влияние органических питательных веществ на микробное разнообразие во время брожения вина.

Это исследование является первым, в котором изучается разнообразие бактерий во время ферментации винограда и вина Traminette с использованием секвенирования штрих-кода ампликона 16S для определения изменений бактерий. Это подтвердило разнообразие бактерий на уровне типов и родов. Протеобактерии, за которыми следовали Firmicutes, были наиболее многочисленны по мере того, как брожение прогрессировало до конечного вина. Многие типы, о которых ранее не сообщалось, были обнаружены с помощью секвенирования ампликонов 16S, и это подтвердило, что метод может быть использован для мониторинга производства вина. Альфа-разнообразие показало роль изменений в питании; Он повлиял на ферментационные бактерии, в то время как бета-разнообразие указывает на изменения на стадии ферментации. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы изучить функциональную роль, которую многие из описанных типов и родов играют в брожении вина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Acknowledgments

Выражаем признательность за финансирование в виде гранта Исследовательского совета Аппалачского государственного университета (URC) и стипендии CAPES Print Travel, которая поддержала визит ФАО в Университет Сан-Паулу, Рибейран-Прету - Сан-Паулу, Бразилия. Это исследование было частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Финансовый код 001. ECPDM благодарит за грант CAPES Print Travel, который поддержал ее визит в Аппалачский государственный университет. ECPDM является научным сотрудником 2 из Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Бразилия (CNPq).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel  Promega, Madison, WI USA V3121 Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil  MP Biomedicals, Solon, OH USA 116560-200 DNA extraction 
FastQC software Babraham Institute, United Kingdom Bioinformatics 
Fermaid O Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix  New England Biolabs, USA F630S Polymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext Ultra New England Biolabs, USA NEB #E7103 DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS) Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
Novaseq6000 platform  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
QuiBit Thermoscientific, Waltham, MA, USA DNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer  Molecular device, San Jose, CA, USA DNA quantification 
Sodium Phosphate  Sigma Aldrich 342483 DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
  2. Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
  3. Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
  4. Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
  5. Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
  6. Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
  7. Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
  8. Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
  9. Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
  10. Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
  11. Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
  12. Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
  13. Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
  14. Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
  15. Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
  16. Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
  17. Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
  18. Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
  19. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).
  20. Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
  21. Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
  22. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
  23. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  24. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  25. Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
  26. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  27. Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
  28. van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
  29. Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
  30. Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).

Tags

Биология выпуск 202
Профилирование бактериального сообщества ферментируемого винограда сорта Traminette во время производства вина с использованием метагеномного ампликонного секвенирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goppold, A., Conradie, L., Almeida,… More

Goppold, A., Conradie, L., Almeida, O. G. G. d., De Martinis, E. C. P., Oguntoyinbo, F. A. Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (202), e65598, doi:10.3791/65598 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter