फिलामेंटस सायनोबैक्टीरिया में टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि
Summary
हम एक्सवाई विमान में फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक सरल और सुलभ विधि प्रस्तुत करते हैं। एक कम-गलनांक एगारोस मैट्रिक्स का उपयोग किया गया था, जिससे विभाजन में शामिल प्रोटीन की छवियों के अधिग्रहण की अनुमति मिलती है, एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में। इसलिए, इस पद्धति को किसी भी फिलामेंटस जीव और विभिन्न प्रकार के प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
बैक्टीरियल सेल डिवीजन में एक मुख्य घटना सेप्टेशन प्रक्रिया है, जहां प्रोटीन एफटीएसजेड प्रमुख तत्व है। एफटीएसजेड कोशिका के बीच में एक अंगूठी जैसी संरचना (जेड-रिंग) बनाने के लिए पॉलीमराइज़ करता है जो अन्य डिवीजन प्रोटीन के लिए मचान के रूप में कार्य करता है। बैक्टीरियल मॉडल एस्चेरिचिया कोलाई और बैसिलस सब्टिलिस में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि जेड-रिंग असंतुलित है, जबकि लाइव सेल इमेजिंग अध्ययनों से पता चला है कि एफटीएसजेड ट्रेडमिलिंग नामक तंत्र द्वारा रिंग के साथ चलता है। विवो में एफटीएसजेड की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक्सवाई विमान में अंगूठी की पूरी संरचना की इमेजिंग के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिति में एक विशेष सेल प्लेसमेंट आवश्यक है। बहुकोशिकीय साइनोबैक्टीरिया में एफटीएसजेड इमेजिंग के मामले में, जैसे कि एनाबेना एसपी PCC7120, कोशिकाओं के आकार और फिलामेंट्स की लंबाई के कारण ऊर्ध्वाधर स्थिति में फिलामेंट्स को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है। इस लेख में, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो कम गलनांक एग्रोज और सिरिंज का उपयोग करके एनाबेना एसपी पीसीसी 7120 फिलामेंट्स के ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण की अनुमति देता है, जो एक उत्परिवर्ती में जेड-रिंग को रिकॉर्ड करता है जो एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करता है। यह विधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डिवीजन साइट पर प्रोटीन गतिशीलता को पंजीकृत करने का एक तेज़ और सस्ता तरीका है।
Introduction
बैक्टीरियल सेल डिवीजन वह प्रक्रिया है जिसमें एक मां कोशिका दो बेटी कोशिकाओं को उत्पन्न करती है, ज्यादातर मामलों में द्विआधारी विखंडन के रूप में जाना जाने वाला तंत्र। सेप्टेशन प्रक्रिया में शुरुआती घटनाओं में से एक सेल1 के बीच में एफटीएसजेड का स्थानीयकरण है। यह प्रोटीन, जो संरचनात्मक रूप से ट्यूबुलिन2 के समरूप है, अधिकांश बैक्टीरिया में संरक्षित और व्यापक रूप से वितरित किया जाता है, और इसका पोलीमराइजेशन एक सिकुड़ा हुआ संरचना उत्पन्न करता है जिसे जेड-रिंग3 के रूप में जाना जाता है। यह अंगूठी अन्य डिवीजन प्रोटीन के लिए एक मचान के रूप में कार्य करती है और साथ में वे एक आणविक मशीनरी बनाते हैं जिसे डिविसोम कहा जाता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि जेड-रिंग अत्यधिक गतिशील है और एफटीएसजेड प्रोटोफिलामेंट्स 4,5,6 ट्रेडमिलिंग द्वारा चलते हैं। टाइम-लैप्स प्रयोगों में जेड-रिंग का अध्ययन करने के लिए, बेहतर रिज़ॉल्यूशन और तेजी से नमूने के लिए एक्सवाई विमान में डिवीजन साइट को रिकॉर्ड करना उचित है। इसे प्राप्त करने के लिए, ऊर्ध्वाधर सेल स्थिरीकरण विधियों को विकसित करना आवश्यक है जिसमें आमतौर पर माइक्रोहोल सेल ट्रैप और जटिल माइक्रोफ्लुइडिकउपकरणों के नैनोफैब्रिकेशन शामिल हैं।
सायनोबैक्टीरिया प्रकाश संश्लेषक सूक्ष्मजीव हैं जिन्हें उनके सेलुलर आकृति विज्ञान द्वारा ग्राम-नकारात्मक के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। हालांकि, फाइटोलैनेटिक रूप से वे ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया8 के करीब हैं। इन जीवों में कोशिका विभाजन जीन होते हैं जो ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के भीतर आम होते हैं, लेकिन उनके विभाजन मेंअद्वितीय तत्व भी होते हैं। पीसीसी 7120 (इसके बाद एनाबेना एसपी) एक डिवीजन प्लेन के साथ फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया है और बहुकोशिकीय साइनोबैक्टीरिया में कोशिका विभाजन के अध्ययन के लिए एक मॉडल है। इस तनाव में, कोशिकाओं10 के बीच में एफटीएसजेड की स्थिति निर्धारित करना संभव हो गया है। फिर भी, इस मॉडल में एफटीएसजेड की विवो गतिशीलता दिखाने वाले कोई अध्ययन नहीं हैं। हमारी प्रयोगशाला में, त्रि-अभिभावकीय संभोग और समरूप पुनर्संयोजन के माध्यम से, हमने एनाबेना एसपी का एक पूरी तरह से अलग उत्परिवर्ती प्राप्त किया जो एसएफजीएफपी से जुड़े एफटीएसजेड प्रोटीन को व्यक्त करता है, जिसने पूर्ण अंतर्जात एफटीएसजेड जीन को बदल दिया। हमने एक तेजी से और सरल सेल स्थिरीकरण विधि विकसित की है जो फिलामेंटस सायनोबैक्टीरिया में विभाजन प्रोटीन की कल्पना करने के लिए समय-चूक प्रयोगों के लिए उत्परिवर्ती तनाव फिलामेंट्स के ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास का समर्थन करती है। इस विधि को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की आवश्यकता नहीं है जो महंगे और विकसित करने में मुश्किल हो सकते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हमने कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी उत्परिवर्ती में जेड-रिंग की कल्पना करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिविसोम प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन निस्संदेह एक चुनौती है। विशेष रूप से, फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया में, चुनौतियों में से एक क्षैतिज विमान में जेड-रिंग का विज़ुअलाइज़ेशन है, जिसके लिए कोशिकाओं को ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वित्तपोषण के लिए राष्ट्रीय डॉक्टरेट छात्रवृत्ति (एएनआई 21211333; 21191389) के आभारी हैं। ग्रांट फोन्डेसाइट 1161232।
यह काम उन्नत माइक्रोस्कोपी सुविधा उमा यूसी द्वारा समर्थित था।
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
