Vertikal immobiliseringsmetode for time-lapse-mikroskopianalyse i trådformede cyanobakterier

Summary

Vi presenterer en enkel og tilgjengelig metode for trådformet cyanobakteriell visualisering i XY-planet. En agarosematrise med lavt smeltepunkt ble brukt, noe som muliggjorde oppkjøp av bilder av proteiner involvert i divisjonen, i vertikal orientering. Derfor kan denne metoden brukes på enhver filamentøs organisme og forskjellige typer proteiner.

Abstract

En hovedhendelse i bakteriell celledeling er septasjonsprosessen, hvor proteinet FtsZ er nøkkelelementet. FtsZ polymeriserer og danner en ringlignende struktur (Z-ring) i midten av cellen som tjener som et stillas for andre delingsproteiner. Superoppløsningsmikroskopi i bakteriemodeller Escherichia coli og Bacillus subtilis viste at Z-ringen er diskontinuerlig, mens levende cellebildestudier viste at FtsZ beveger seg langs ringen ved en mekanisme kjent som tredemølle. For å studere dynamikken til FtsZ in vivo, er en spesiell celleplassering i vertikal stilling nødvendig for avbildning av ringens komplette struktur i XY-planet. Når det gjelder FtsZ-avbildning i flercellede cyanobakterier, som Anabaena sp. PCC7120, er det utfordrende å opprettholde filamentene i vertikal stilling på grunn av størrelsen på cellene og filamentens lengde. I denne artikkelen beskriver vi en metode som tillater vertikal immobilisering av Anabaena sp. PCC 7120-filamenter ved bruk av agarose og sprøyter med lavt smeltepunkt, for å registrere Z-ringen i en mutant som uttrykker et FtsZ-sfGFP-fusjonsprotein. Denne metoden er en rask og billig måte å registrere proteindynamikk på divisjonsstedet ved hjelp av konfokalmikroskopi.

Introduction

Bakteriell celledeling er prosessen der en morcelle genererer to datterceller, i de fleste tilfeller av mekanismen kjent som binær fisjon. En av de tidligste hendelsene i septasjonsprosessen er lokaliseringen av FtsZ i midten av cellen¹. Dette proteinet, som er strukturelt homologt med tubulin², er konservert og bredt fordelt i de fleste bakterier, og polymerisasjonen genererer en kontraktil struktur kjent som Z-ring³. Denne ringen fungerer som et stillas for andre delingsproteiner, og sammen danner de et molekylært maskineri kalt et divisom. Flere studier har vist at Z-ringen er svært dynamisk og at FtsZ-protofilamenter beveger seg ved tredemølle ^4,5,6. For å studere Z-ringen i time-lapse-eksperimenter, anbefales det å registrere divisjonsstedet i XY-planet for bedre oppløsning og rask prøvetaking. For å oppnå dette er det nødvendig å utvikle vertikale celleimmobiliseringsmetoder som vanligvis inkluderer nanofabrikasjon av mikrohullcellefeller og komplekse mikrofluidiske enheter⁷.

Cyanobakterier er fotosyntetiske mikroorganismer som er klassifisert som gram-negative ved deres cellulære morfologi. Imidlertid er de fylogenetisk nærmere gram-positive bakterier⁸. Disse organismene har celledelingsgener som er vanlige i gram-positive og gram-negative bakterier, men deres divisome inneholder også unike elementer⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (heretter Anabaena sp.) er trådformede cyanobakterier med ett divisjonsplan og er en modell for studier av celledeling i flercellede cyanobakterier. I denne stammen har det vært mulig å bestemme plasseringen av FtsZ i midten av cellene¹⁰. Likevel er det ingen studier som viser in vivo-dynamikken til FtsZ i denne modellen. I vårt laboratorium, gjennom triparental parring og homolog rekombinasjon, oppnådde vi en helt segregert mutant av Anabaena sp. som uttrykker FtsZ-proteinet fusjonert til sfGFP, som erstattet det komplette endogene ftsZ-genet. Vi utviklet en rask og enkel celleimmobiliseringsmetode som favoriserer den vertikale orienteringen av mutantstammefilamentene for time-lapse-eksperimenter for å visualisere delingsproteinene i filamentøse cyanobakterier. Denne metoden trenger ikke mikrofluidiske enheter som kan være dyre og vanskelige å utvikle. Som et eksempel brukte vi denne protokollen til å visualisere Z-ringen i FtsZ-sfGFP-mutanten ved konfokalmikroskopi.

Protocol

1. Vurderinger og valg av mobilmodell MERK: Cyanobakterier har en sterk autofluorescens på grunn av tilstedeværelsen av fotosyntetiske pigmenter. Dette signalet er i den røde delen av spekteret, derfor er fluorescerende proteiner egnet for avbildning i cyanobakterier de som langt fra den røde utslippet. For eksempel GFP, YFP, Venus, Turkis og BFP. Velg en divisomkomponent som finnes i målfilamentøs cyanobakteriestamme. For forsøkene er det nødvendig å konstr…

Representative Results

Visualisering av Z-ringen i Anabaena sp. ved bruk av den vertikale immobiliseringsmetodenFor å studere dynamikken til Z-ringkomponenter i bakterier, er det nødvendig å skaffe bilder i vertikalt orienterte celler. I denne posisjonen er det mulig å visualisere Z-ringen og hovedproteinene i divisomet for å overvåke proteindynamikken ved time-lapse-mikroskopi. Det klassiske prøvepreparatet for bakterier virker ikke for filamentøse cyanobakterier. Når det gjelder Anabaena sp., e…

Discussion

Studien av dynamikken til divisomproteiner er uten tvil en utfordring. Spesielt i trådformede cyanobakterier er en utfordring visualiseringen Z-ringen i horisontalplanet, for hvilken cellene må være vertikalt orientert. Metoden vi beskrev her tillater posisjonering av Z-ringen i XY-planet for å utføre de forskjellige analysene. Dette er den første enkle metoden for trådformede cyanobakterier som muliggjør fullstendig visualisering av Z-ringen.

Selv om denne protokollen er enkel og ras…

Materials

1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	–	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	–	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	–	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.