Vertikal immobiliseringsmetod för time-lapse mikroskopianalys i filamentösa cyanobakterier

Summary

Vi presenterar en enkel och tillgänglig metod för filamentös cyanobakteriell visualisering i XY-planet. En agarosmatris med låg smältpunkt användes, vilket möjliggjorde förvärv av bilder av proteiner som är involverade i uppdelningen, i vertikal orientering. Därför kan denna metod tillämpas på alla filamentösa organismer och olika typer av proteiner.

Abstract

En viktig händelse i bakteriell celldelning är septationsprocessen, där proteinet FtsZ är nyckelelementet. FtsZ polymeriserar och bildar en ringliknande struktur (Z-ring) i mitten av cellen som fungerar som en ställning för andra delningsproteiner. Superupplösningsmikroskopi i bakteriemodellerna Escherichia coli och Bacillus subtilis visade att Z-ringen är diskontinuerlig, medan levande cellavbildningsstudier visade att FtsZ rör sig längs ringen genom en mekanism som kallas löpband. För att studera dynamiken hos FtsZ in vivo är en speciell cellplacering i vertikalt läge nödvändig för att avbilda ringens fullständiga struktur i XY-planet. När det gäller FtsZ-avbildning i flercelliga cyanobakterier, såsom Anabaena sp. PCC7120, är det utmanande att hålla filamenten i vertikalt läge på grund av cellernas storlek och filamentens längd. I den här artikeln beskriver vi en metod som möjliggör vertikal immobilisering av Anabaena sp. PCC 7120-filament med användning av agaros och sprutor med låg smältpunkt för att registrera Z-ringen i en mutant som uttrycker ett FtsZ-sfGFP-fusionsprotein. Denna metod är ett snabbt och billigt sätt att registrera proteindynamik på delningsstället med hjälp av konfokalmikroskopi.

Introduction

Bakteriell celldelning är den process där en modercell genererar två dotterceller, i de flesta fall genom mekanismen som kallas binär fission. En av de tidigaste händelserna i septationsprocessen är lokaliseringen av FtsZ i mitten av cell¹. Detta protein, som är strukturellt homologt med tubulin², bevaras och distribueras i stor utsträckning i de flesta bakterier, och dess polymerisation genererar en kontraktil struktur som kallas Z-ring³. Denna ring fungerar som en byggnadsställning för andra delningsproteiner och tillsammans bildar de ett molekylärt maskineri som kallas en divisome. Flera studier har visat att Z-ringen är mycket dynamisk och att FtsZ-protofilament rör sig genom^{att löpa 4,5,6}. För att studera Z-ringen i time-lapse-experiment är det lämpligt att registrera delningsstället i XY-planet för bättre upplösning och snabb provtagning. För att uppnå detta är det nödvändigt att utveckla vertikala cellimmobiliseringsmetoder som vanligtvis inkluderar nanofabrikation av mikrohålscellfällor och komplexa mikrofluidiska anordningar⁷.

Cyanobakterier är fotosyntetiska mikroorganismer som klassificeras som gramnegativa av deras cellulära morfologi. Men fylogenetiskt är de närmare grampositiva bakterier⁸. Dessa organismer har celldelningsgener som är vanliga inom grampositiva och gramnegativa bakterier, men deras divisome innehåller också unika element⁹. PCC 7120 (nedan kallad Anabaena sp.) är filamentösa cyanobakterier med ett delningsplan och är en modell för studier av celldelning i flercelliga cyanobakterier. I denna stam har det varit möjligt att bestämma placeringen av FtsZ i mitten av cellerna¹⁰. Ändå finns det inga studier som visar in vivo-dynamiken hos FtsZ i denna modell. I vårt laboratorium, genom triparental parning och homolog rekombination, erhöll vi en helt segregerad mutant av Anabaena sp. som uttrycker FtsZ-proteinet smält till sfGFP, som ersatte den fullständiga endogena ftsZ-genen . Vi utvecklade en snabb och enkel cellimmobiliseringsmetod som gynnar den vertikala orienteringen av de muterade töjningsfilamenten för time-lapse-experiment för att visualisera delningsproteinerna i filamentösa cyanobakterier. Denna metod behöver inte mikrofluidiska enheter som kan vara dyra och svåra att utveckla. Som ett exempel använde vi detta protokoll för att visualisera Z-ringen i FtsZ-sfGFP-mutanten genom konfokalmikroskopi.

Protocol

1. Överväganden och val av mobilmodell OBS: Cyanobakterier har en stark autofluorescens på grund av närvaron av fotosyntetiska pigment. Denna signal är i den röda delen av spektrumet, därför är de fluorescerande proteinerna som är lämpliga för avbildning i cyanobakterier de som långt ifrån den röda emissionen. Till exempel GFP, YFP, Venus, Turquoise och BFP. Välj en divisomkomponent som finns i målfilamentös cyanobakteriestam. För experimenten är …

Representative Results

Visualisering av Z-ringen i Anabaena sp. med hjälp av vertikal immobiliseringsmetodFör att studera dynamiken hos Z-ringkomponenter i bakterier är det nödvändigt att förvärva bilder i vertikalt orienterade celler. I denna position är det möjligt att visualisera Z-ringen och huvudproteinerna i divisomen för att övervaka proteindynamiken genom time-lapse-mikroskopi. Den klassiska provberedningen för bakterier fungerar inte för filamentösa cyanobakterier. När det gäller Anaba…

Discussion

Studiet av dynamiken hos divisomproteiner är utan tvekan en utmaning. Särskilt i filamentösa cyanobakterier är en av utmaningarna visualiseringen av Z-ringen i horisontalplanet, för vilken cellerna måste vara vertikalt orienterade. Metoden vi beskrev här gör det möjligt att placera Z-ringen i XY-planet för att utföra de olika analyserna. Detta är den första enkla metoden för filamentösa cyanobakterier som möjliggör fullständig visualisering av Z-ringen.

Även om detta protok…

Materials

1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	–	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	–	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	–	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.