Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65772
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4
1Refeyn Ltd., 2Adaptix Ltd., 3Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, University of Oxford, 4The Kavli Institute for Nanoscience Discovery, University of Oxford

Summary

Dieses Protokoll kombiniert Massenphotometrie mit einem neuartigen Mikrofluidik-System, um Protein-Protein-Wechselwirkungen mit geringer Affinität zu untersuchen. Dieser Ansatz basiert auf der schnellen Verdünnung hochkonzentrierter Komplexe in Lösung, was Messungen mit geringer Affinität ermöglicht und die Anwendbarkeit der Massenphotometrie erweitert.

Abstract

Die Massenphotometrie ist eine vielseitige Massenmesstechnologie, die die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen und der Komplexbildung in Lösung ohne Markierung ermöglicht. Die Massenphotometrie eignet sich im Allgemeinen für die Analyse von Proben im Konzentrationsbereich von 100 pM bis 100 nM. In vielen biologischen Systemen ist es jedoch notwendig, konzentriertere Proben zu messen, um schwache oder transiente Wechselwirkungen zu untersuchen. Hier demonstrieren wir eine Methode, die den Bereich der Probenkonzentrationen, die durch Massenphotometrie analysiert werden können, effektiv von nanomolar auf Dutzende von Mikromolaren erweitert.

In diesem Protokoll wird die Massenphotometrie mit einem neuartigen Mikrofluidiksystem kombiniert, um die Bildung von Proteinkomplexen in Lösung im mikromolaren Konzentrationsbereich zu untersuchen. Mit dem Mikrofluidik-System können Benutzer eine Probe in einer gewünschten höheren Konzentration halten, gefolgt von einer Verdünnung in den nanomolaren Bereich - einige Millisekunden vor der Massenphotometrie-Messung. Aufgrund der Geschwindigkeit der Verdünnung werden Daten erhalten, bevor sich das Gleichgewicht der Probe verschoben hat (d.h. Dissoziation des Komplexes).

Die Technik wird angewendet, um Wechselwirkungen zwischen einem Immunglobulin G (IgG)-Antikörper und dem neonatalen Fc-Rezeptor zu messen, wobei die Bildung von Komplexen höherer Ordnung gezeigt wird, die mit statischen Massenphotometrie-Messungen nicht quantifizierbar waren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Massenphotometrie und Mikrofluidik die Charakterisierung von Proben im mikromolaren Konzentrationsbereich ermöglicht und in der Lage ist, biomolekulare Wechselwirkungen mit schwächeren Affinitäten zu messen. Diese Fähigkeiten können in einer Reihe von Kontexten eingesetzt werden - einschließlich der Entwicklung und des Designs von Biotherapeutika - und ermöglichen eine gründliche Charakterisierung verschiedener Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Introduction

Protein-Protein-Wechselwirkungen unterstreichen die meisten zellulären Funktionen, von der Immunregulation über die DNA-Replikation bis hin zur Translation. Infolgedessen besteht in den Lebenswissenschaften ein grundlegender Bedarf, ein breites Spektrum an Wechselwirkungen zwischen verschiedenen heterogenen Komplexen zu untersuchen, die häufig gebildet werden. Ihre Erkennung, Charakterisierung und Quantifizierung sind jedoch oft eine Herausforderung, insbesondere bei Wechselwirkungen mit geringer Affinität1.

Immunpräzipitationsassays werden häufig zum Nachweis von Wechselwirkungen mit hoher Affinität verwendet, aber bei Wechselwirkungen mit niedriger Affinität und transienten Wechselwirkungen ist ein Nachweis weitgehend nicht möglich2. Fluoreszenztechniken können ebenfalls verwendet werden, erfordern jedoch die potenziell störende Zugabe von Fluoreszenzmarkierungen2. Kryo-EM kann eine strukturelle Momentaufnahme und eine Ensemble-Auslesung der gebildeten Proteinkomplexe mit hoher räumlicher Auflösung liefern, erfordert aber in der Regel auch die Arbeit mit Konzentrationen, die für die Abbildung von Wechselwirkungen mit geringer Affinität zu niedrig sind. Die Kryo-EM bringt auch Herausforderungen in Bezug auf Kosten, Zugänglichkeit, Probenvorbereitung und Analysezeitmit sich 3.

Darüber hinaus hat sich die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) zu einer beliebten Methode zur Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen entwickelt, obwohl sie eine Proteinimmobilisierung erfordert, die das Bindungsgleichgewicht beeinträchtigen und zu variablen On-Raten führen kann, wodurch die Messgenauigkeit verringertwird 4,5. Es umfasst auch mehrere Analyseschritte vor der Datenerfassung und -analyse6.

Die Massenphotometrie ist eine Einzelmolekültechnik, die zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde 5,6,7. Es misst die Masse einzelner Moleküle oder Komplexe auf der Grundlage des Lichts, das sie streuen, wenn sie auf der Oberfläche eines Glasdeckglases8 landen. Massenphotometrische Messungen wurden verwendet, um die Bindungsaffinitäten aus der relativen Häufigkeit der Bindungspartner und den von ihnen gebildeten Komplexen zu quantifizieren5. Wie bei anderen Einzelmolekültechniken sollte die Konzentration der zu messenden Probe jedoch in der Regel weniger als 100 nM betragen. Ist die Konzentration höher, überlappen sich die Moleküle, die auf der Glasoberfläche landen, räumlich, was zu einer schlechten Datenqualität führt7. Folglich können schwächere Wechselwirkungen (KD ~ Mikromolaren), die bei diesen niedrigeren Konzentrationen dissoziieren, nicht zuverlässig gemessen werden, da es nicht möglich ist, die notwendige Mischung aus ungebundenen und gebundenen Spezieszu beobachten 5.

Hier beschreiben wir einen Ansatz, der diese Einschränkung auf der Grundlage eines neuen gekoppelten Mikrofluidik-Massenphotometriegeräts überwindet. Konkret wird ein Mikrofluidik-System in Kombination mit dem Massenphotometer eingesetzt, um den Bereich der Wechselwirkungen, die durch Massenphotometrie quantifiziert werden können, effektiv zu erweitern. Es hat sich gezeigt, dass die Mikrofluidik eine Reihe von Möglichkeiten zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bietet, einschließlich einer schnellen Verdünnung zum Nachweis schwacher Wechselwirkungen 1,9. Das hierin beschriebene System funktioniert, indem es die Probe auf einem mikrofluidischen Chip schnell bis zu 10.000-fach verdünnt und sie sofort über den Beobachtungsbereich des Chips fließen lässt, wodurch die Massenphotometriemessung innerhalb von 50 ms nach dem Zeitpunkt beginnen kann, an dem die Moleküle den Verdünnungsprozess10 begonnen haben. Die Verdünnung tritt auf, wenn die Probe und der Puffer in einem umgekehrten Tesla-Ventilmischer auf dem Chip kombiniert werden, wobei die relativen Durchflussraten der beiden Lösungen die Menge der auftretenden Verdünnung bestimmen (siehe Protokollschritt 8). Die Durchflussmenge ist mit der mikrofluidischen Steuerungssoftware steuerbar. Eine Änderung der Durchflussrate kann die relative Population der Spezies verändern, da sie die Anzahl der Landeereignisse auf der Oberfläche des Glases beeinflussen kann, die vom Massenphotometer gemessen wird.

Die Geschwindigkeit des Prozesses ist schnell genug, um die Messung abzuschließen, bevor die Integrität der Wechselwirkung gestört wurde (für weitere Details siehe auch die Diskussion). Dies kann durch einen kurzen Blick auf die Theorie der Reaktionen erster Ordnung verstanden werden, wobei Equation 1. Die Vorwärts-(Assoziations-)Geschwindigkeitskonstante ist kf, die Rückwärts-Ratenkonstante (Dissoziations-) ist kb und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) ist definiert als

KD= kb/ kf

Für die Proteinbindung ist kfim Allgemeinen durch die Diffusion11 der Reaktanten begrenzt und daher auf den Bereich von 106-10 7 M-1·s-1 beschränkt. Da der Bereich von begrenzt ist, wird eine Reaktion mit niedriger Affinität (KD~Mikromolaren) kb≈ 1 s-1 aufweisen. Das heißt, kb= kf · KD= (106 M-1·s-1) (10-6 M) = 1 s-1, mit einer Halbwertszeit des Komplexes von etwa 0,7 s11,12.

Unser Beispielsystem ist die Bindung des monoklonalen IgG-Antikörpers Trastuzumab an die lösliche Domäne des neonatalen IgG-Fc-Rezeptors (FcRn), die als Interaktionspartner bekannt sind13. Zuvor veröffentlichte Daten, die allein mit konventioneller Massenphotometrie (d.h. mit manueller Verdünnung der Proben) gewonnen wurden, zeigten, dass die Proteine mehrere Spezies bilden. FcRn-Monomere, FcRn-Dimere und ungebundenes IgG waren deutlich sichtbar, während IgG-FcRn-Komplexe (im Verhältnis 1:1 und 1:2) ebenfalls nachgewiesen wurden (bei pH 5,0), jedoch nur mit sehr geringer Häufigkeit5. Diese Beobachtung wirft die Frage auf, ob die Bildung des IgG-FcRn-Komplexes deutlicher nachgewiesen werden kann, wenn sie in einer höheren Konzentration gemessen wird. Tatsächlich lieferte die Kombination von Massenphotometrie mit einem hier beschriebenen gekoppelten Ansatz der schnellen Verdünnung einen robusteren Beweis für die Komplexbildung durch eine Zunahme ihrer gemessenen Partikel.

Das hier beschriebene Protokoll der Massenphotometrie und Mikrofluidik ermöglicht es, die Bildung von Komplexen mit einem KD bis in den mikromolaren Bereich zu charakterisieren. Eine empirische Bestimmung der KD erfordert weitere Verbesserungen der Genauigkeit des Durchflusssensors, der Pumpenstabilität, der Span-zu-Chip-Variationen und des Messortes innerhalb des Beobachtungsfensters, da all diese Faktoren die Zeit von der Verdünnung der Probe bis zur Messung beeinflussen würden.

Der gleiche Ansatz könnte angewendet werden, um die Bindung zwischen löslichen Proteinen zu untersuchen, vorausgesetzt, sie haben unterschiedliche Molekulargewichte (mindestens 25 kDa getrennt), die in den für die Analyse mit einem Massenphotometer geeigneten Bereich (30 kDa bis 6 MDa) fallen. Die gewonnenen Erkenntnisse könnten für Studien in einer Reihe von Kontexten hilfreich sein - vom mechanistischen Verständnis zellulärer Funktionen bis hin zum Design neuer biotherapeutischer Medikamente.

Protocol

1. Vorbereiten der Geräte und Starten der Software

  1. Schalten Sie das Massenphotometer ein und lassen Sie es mindestens 1 Stunde lang eingeschaltet, bevor Sie mit den Messungen beginnen.
    HINWEIS: Dies liegt daran, dass das Gerät eine konstante Temperatur erreichen muss. Wenn das Massenphotometer 1 h lang nicht eingeschaltet bleibt, kann dies zu einer Massenverschiebung und damit zu ungenauen Ergebnissen führen.
  2. Schalten Sie den Vibrationstisch ein, indem Sie das Gerät einschalten und die Isolationstaste (unter dem Massenphotometer) drücken. Vibrationen schränken die Leistung des Massenphotometrie-Instruments ein, daher ist der Anti-Vibrations-Tisch wichtig, um eine maximale Empfindlichkeit des Instruments zu gewährleisten. Schalten Sie die Mikrofluidik-Box ein.
  3. Starten Sie die Datenerfassungssoftware und die Mikrofluidik-Steuerungssoftware. Schalten Sie den Luftkompressor ein.

2. Vorbereitung von Proteinproben, Puffer und Reinigungslösungen

  1. Geben Sie 200 mL PBS (pH 7,4) Puffer in eine saubere 200 mL Flasche und 200 mL PBS (pH 5,0) Puffer in eine zweite 200 mL Flasche.
    HINWEIS: Die 200-ml-Flaschen müssen in den nächsten Schritten an den "L"-Durchflusssensor angeschlossen werden. Verwenden Sie einen pH 7,4 PBS-Puffer für die Kalibrierungsmessung und einen pH 5,0 PBS-Puffer für die Probenmessung.
  2. Mischen Sie in einem 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen IgG (2 μM) und FcRn (20 μM) im Verhältnis 1:10 für ein Gesamtvolumen von 60 μl.
    1. Die Stammlösungen für FcRn und IgG betragen 91,9 μM bzw. 13,5 μM. Bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie 9 μl Stamm-IgG + 13 μl Stamm-FcRn + 38 μl PBS (pH 5,0, Raumtemperatur [RT]) in einem Zentrifugenröhrchen zu einem Gesamtvolumen von 60 μl mischen. Die endgültigen Konzentrationen für die beiden Reaktanten betrugen 2 μM für IgG und 20 μM für FcRn. Halten Sie alle Proteinvorräte während des gesamten Prozesses auf Eis.
  3. In einem weiteren 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen werden 20 μl des β-Amylase-Kalibrants in einer Konzentration von 20 μM abgegeben.
    1. Um beispielsweise das hier verwendete β-Amylase-Kalibrant herzustellen, gehen Sie wie in 2.3.1.1-2.3.1.2 beschriebenes Verfahren vor.
      1. 20 mg β-Amylase-Pulver in der Durchstechflasche in 3,57 ml PBS (5 % Glycerin) resuspendieren, was 5,6 mg/ml und einer molaren Konzentration von 100 μM entspricht (da das Molekulargewicht 56 kDa beträgt).
      2. Zur Verdünnung auf 20 μM werden 200 μl des 100 μM-Stammmaterials mit 800 μl PBS (pH 7,4, RT) in einem 1-ml-Zentrifugenröhrchen kombiniert.
  4. Inkubieren Sie die Proben mindestens 30 Minuten lang bei RT.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Proben- und Kalibrierungsverdünnungen, nachdem Sie das Massenphotometer eingeschaltet haben. Für dieses Experiment wurden die Proben 120 Minuten lang inkubiert.
  5. In drei 50-ml-Zentrifugenröhrchen aliquot: 50 mL PBS (pH 7,4) - Reinigungslösung 1 (CS1), 50 mL mit 0,5 M NaOH - Reinigungslösung 2 (CS2) und 50 mL mit 100% IPA - Reinigungslösung 3 (CS3).

3. Versuchsaufbau

  1. Um die Probe und das Kalibriermittel zu laden, platzieren Sie das Kalibrierungszentrifugenröhrchen an Position 4 und das Probenzentrifugenröhrchen an Position 5 der Mikrofluidikbox (Abbildung 1).
  2. Um die Reinigungslösungen zu laden, platzieren Sie CS1, CS2 und CS3 an den Positionen 1, 2 und 3 der Mikrofluidikbox (Abbildung 1).
    HINWEIS: Die Probe, das Kalibriermittel und die Reinigungslösungen sind an den Multischalter (M-Schalter) angeschlossen. Der m-switch ist mit dem Durchflusssensor der Durchflusseinheit "S" verbunden.
  3. Schrauben Sie die Kappe, die mit der Pufferleitung verbunden ist, auf die 200 mL (pH 7,4) Pufferflasche.
    HINWEIS: Die Pufferleitung ist mit einem Absperrventil verbunden, das mit dem Sensor der Durchflusseinheit "L" verbunden ist. Das Absperrventil verhindert Absaugeffekte, die bei einem Stopp des Pufferflusses auftreten können. Das Absaugen kann dazu führen, dass der Puffer durch die verdünnte Restflüssigkeit, die in den Pufferbehälter zurückkehrt, verunreinigt wird.
  4. Legen Sie den Mikrofluidik-Chip auf eine Vorbereitungsplatte.
    Schieben Sie das andere Rohrende des "S"-Durchflusseinheitssensors in den "Probeneinlass" des ersten Kanals im Mikrofluidik-Chip (Abbildung 1). Die Stichprobenlinie ist fertig.
  5. Schieben Sie das andere Rohrende des "L"-Durchflusseinheitssensors in den "Puffereinlass" des ersten Kanals im Mikrofluidik-Chip (Abbildung 1). Die Pufferzeile ist fertig.
  6. Um den Abfluss aufzufangen, schieben Sie einen Schlauch zum "Auslass" des ersten Kanals im Mikrofluidik-Chip. Positionieren Sie das andere Ende so, dass es in einen Abfallbehälter oder ein Becherglas abläuft (Abbildung 1).

4. Grundierung der Proben- und Pufferlinien mit Puffer

  1. Öffnen Sie das manuelle Absperrventil an der Pufferleitung.
  2. Stellen Sie in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware die Durchflussrate der Pufferleitung auf 1000 μl/min ein und stellen Sie sicher, dass der Druck der Pufferleitung 110 mbar nicht überschreitet (Abbildung 2). Der Fluss wird automatisch in der Pufferzeile gestartet (Abbildung 1).
    HINWEIS: Wenn der Druck der Pufferleitung 110 mbar überschreitet, kann dies daran liegen, dass Luft durch den Durchflusssensor strömt. Wenn der Druck nicht innerhalb weniger Sekunden wieder normal ist, kann es zu einer Verstopfung kommen (normalerweise aufgrund von eingeklemmten Schläuchen an den Anschlüssen). Stoppen Sie in diesem Fall den Durchfluss und überprüfen Sie die Anschlüsse in der Pufferleitung, beginnend am Absperrventil.
  3. Wählen Sie in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware die Position 1 des m-Schalters (entsprechend dem PBS-Puffer), stellen Sie dann die Durchflussrate der Probenleitung auf 8 μl/min ein und stellen Sie sicher, dass der Druck der Probenleitung 350 mbar nicht überschreitet. Die Strömung beginnt automatisch in der Probenleitung (Abbildung 1).
  4. Verwenden Sie eine Pipettenspitze (oder eine andere weiche Kunststoffkomponente), um leichten Druck von oben in der Nähe der im Chip eingeschlossenen Blase(n) auszuüben, um Luftblasen zu entfernen und sicherzustellen, dass sie durch den Auslass entfernt werden.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie alle Blasen in den Bereichen "Mixer" und "Beobachtungsbereich" (Abbildung 1) des verwendeten Kanals entfernen. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu drücken, da dies den Chip beschädigen könnte.

5. Platzieren des Mikrofluidik-Chips auf dem Massenphotometer und Ermitteln des Fokus

  1. Tragen Sie einen Tropfen Mikroskop-Immersionsöl auf das Objektiv des Massenphotometers auf.
  2. Setzen Sie den Mikrofluidik-Chip mit dem "Probeneinlass" nach oben auf die Halterung des Massenphotometers und halten Sie ihn an den Tischklemmen fest (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass alle Schlauchverbindungen befestigt bleiben.
  3. Verschieben Sie mit der Datenerfassungssoftware den Tisch, um sicherzustellen, dass der "Beobachtungsbereich" von Kanal 1 mit dem Ziel ausgerichtet ist (Abbildung 1).
  4. Schließen Sie den Deckel des Massenphotometers und drücken Sie die Option Tröpfchenverdünnung Fokus finden in der Datenerfassungssoftware.
  5. Überprüfen Sie den weißen Fokusring in der unteren linken Ecke der Datenerfassungssoftware (Abbildung 3). Lücken im Ring weisen auf das Vorhandensein einer Luftblase im Immersionsöl hin; Entfernen Sie diese, indem Sie die Tischgeschwindigkeit auf das Maximum erhöhen und den Tisch sanft seitlich bewegen.
  6. Nachdem die Fokussierung abgeschlossen ist, warten Sie 2-3 Minuten, bevor Sie die erste Aufnahme machen. Drücken Sie dann auf Aufnahme , um eine 1-minütige Messung aufzuzeichnen, und stellen Sie (durch Beobachten der Messung) sicher, dass keine Verunreinigungen auftreten.
    HINWEIS: Verunreinigungen können sich auf der Glasoberfläche oder im Puffer befinden. Der Schärfewert in der Datenerfassungssoftware sollte über 4,5 % liegen.

6. Kalibrierung der Massenphotometrie

  1. Schalten Sie in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware den m-Schalter auf Position 4 (entsprechend dem Kalibrant) und stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate der Probenleitung auf 8 μl/min eingestellt ist und der Druck der Probenleitung 350 mbar nicht überschreitet (Abbildung 2).
    1. Der Kalibrant beginnt mit dem Durchfluss durch den Chip. Warten Sie ca. 1,5 bis 2,5 Minuten (oder bis der Kalibrant auf der Datenerfassungssoftware konsistent angezeigt wird). Die Zeit kann je nach Länge der Probenleitung variieren.
  2. Sobald der Kalibrant konsistent gesehen wird (d. h. die Anzahl der Ereignisse ist für eine genaue Massenphotometrie-Messung ausreichend), reduzieren Sie die Durchflussrate in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware auf 0,5 μl/min - das Zielverdünnungsniveau für dieses Experiment.
    HINWEIS: Wenn Sie mit einer höheren Durchflussrate beginnen, verkürzt sich einfach die Zeit, die der Kalibrant benötigt, um den Chip zu erreichen.
  3. Achten Sie darauf, dass nicht "zu wenige" oder "zu viele" Moleküle auf der Messoberfläche landen (Abbildung 4).
    1. Wenn die Dichte des Landeereignisses nicht "ideal" ist (Abbildung 4), ändern Sie die Durchflussrate in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware. Wenn die Ereignisdichte zu niedrig ist, erhöhen Sie die Probenflussrate, bis gut getrennte Landeereignisse beobachtet werden (jedoch nicht mehr als 8 μl/min). Wenn er zu hoch ist, reduzieren Sie den Probendurchfluss (aber nicht unter 0,1 μl/min).
    2. Wenn das Kalibriermittelvolumen im Probenröhrchen zur Neige geht, ändern Sie die Position des m-Schalters auf die PBS pH 7,4-Leitung (Position 1), um das Einspritzen von Luft zu vermeiden.
  4. Drücken Sie die Aufnahmetaste und führen Sie eine 60-s-Messung durch. Speichern Sie die Datei in einem ausgewählten Ordner.
    HINWEIS: Die Datenerfassungssoftware erzeugt Dateien mit der Erweiterung .mp.

7. Reinigen der Probenleitung und Stoppen des Durchflusses

  1. Schalten Sie in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware auf Position 2 des m-Schalters und ändern Sie den Probendruck auf 800 mbar (Abbildung 2). Spülen Sie das System 4 Minuten lang mit CS2 (NaOH).
  2. Schalten Sie auf Position 3 des m-Schalters und spülen Sie das System für 4 min mit CS3 (IPA).
  3. Schalten Sie auf Position 1 des m-Schalters und spülen Sie das System für 4 min mit CS1 (PBS).
  4. Stoppen Sie in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware den gesamten Durchfluss, indem Sie den Druck der Probenleitung und der Pufferleitung auf 0 setzen und das Pufferventil schließen.
  5. Trennen Sie den Chip vom Tisch und legen Sie ihn wieder auf die Vorbereitungsplatte. Trennen Sie alle Schläuche und legen Sie das Ende des Probenschlauchs in eine Abfallflasche. Reinigen Sie das Objektiv mit Isopropanol und Tüchern.

8. Messen der massenphotometrischen Probe

  1. Schrauben Sie den Verschluss ab, der mit der 200 mL (pH 7,4) Pufferflasche verbunden ist, und schrauben Sie ihn an die 200 mL (pH 5,0) Pufferflasche.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-5.6, aber verwenden Sie den zweiten Kanal des Chips anstelle des ersten.
  3. Schalten Sie in der Mikrofluidik-Steuerungssoftware den m-Schalter auf Position 5 (entsprechend der Probe), stellen Sie die Durchflussrate der Probenleitung auf 8 μl/min ein und stellen Sie sicher, dass der Druck der Probenleitung 350 mbar nicht überschreitet (Abbildung 2).
  4. Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.4, um die Probe zu messen.
    1. Um die zu verwendenden Durchflussraten zu berechnen, stellen Sie sicher, dass die Faltdifferenz der Durchflussrate dem gewünschten Probenverdünnungsfaktor entspricht. Um hier z.B. die Verdünnung von 2000x zu erreichen, unterscheiden sich die Durchflussraten um den Faktor 2000; Die Pufferflussrate beträgt 1000 μl/min und die Probendurchflussrate 0,5 μl/min. Lassen Sie die Linien am Ende eines Experiments immer sauber, indem Sie das Reinigungsprotokoll befolgen.

9. Datenanalyse

  1. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, starten Sie die Datenanalysesoftware (Abbildung 5).
  2. Klicken Sie auf das Plus-Symbol (+) oben links und wählen Sie die .mp-Calibrant-Datei aus. Die Software beginnt mit der Analyse der geladenen Datei. Je nach Größe und Anzahl der Messungen kann dies einige Minuten dauern
    1. Analysieren Sie keine .mp-Dateien in der Datenanalysesoftware, während Sie Daten mit einer Datenerfassungssoftware erfassen, da dies die Qualität der erfassten Daten beeinträchtigen kann.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Massenkalibrierung erstellen (unten rechts). Es öffnet sich ein Dialogfeld mit einer Tabelle, die mit den Kontrastwerten der angepassten Peaks gefüllt ist.
  4. Ändern Sie die Werte in die bekannten Massenwerte für die angepassten Peaks (für β-Amylase sind diese Werte 56 kDa, 112 kDa und 224 kDa) und drücken Sie Speichern. Die neu erstellte Kalibrierungsdatei (Erweiterung .mc) wird im Bereich "Massenkalibrierung " (unten links in der Datenanalysesoftware) angezeigt (Abbildung 6).
  5. Klicken Sie oben links auf das Pluszeichen (+) und wählen Sie die .mp-Beispieldatei aus.
  6. Um ein Massenhistogramm zu erstellen, wie in Abbildung 5 dargestellt, wechseln Sie zur Registerkarte Analyse , wählen Sie den Modus Histogramm und dann die Option Massendiagramm aus. Passen Sie die Bin-Breite, die Massengrenzen und andere Parameter nach Bedarf an.
  7. Passen Sie den Plot auf der Registerkarte "Abbildungen " bei Bedarf weiter an, bevor Sie Abbildungen exportieren und/oder den gesamten Arbeitsbereich als .dmp Datei speichern.

Representative Results

Die Massenphotometrie wurde verwendet, um die Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen IgG-Antikörper Trastuzumab und der löslichen Domäne des IgG-neonatalen Fc-Rezeptors (FcRn) zu messen. Eine 1:10-Mischung der beiden Proteine (bei 2 μM für IgG und 20 μM für FcRn) wurde manuell auf 10 nM bzw. 20 nM in PBS verdünnt.

Der Verdünnungsschritt ist notwendig, da die Massenphotometrie, eine Einzelmolekül-Massenmesstechnik, nur Proben im Bereich von 100 pM bis 100 nM analysieren kann. Der Versuch, Proben mit Konzentrationen außerhalb dieses Bereichs zu messen, kann die Genauigkeit der Ergebnisse gefährden (Abbildung 4). Dieser Versuch ist nicht in diesem Protokoll enthalten, da er bereits beschrieben wurde 5,6.

In den Massenhistogrammen, die in einem Massenphotometrie-Experiment erstellt wurden, wird die Stärke des Streusignals (oder "Kontrast") für jedes Landeereignis auf der x-Achse aufgetragen und über den Schritt der Massenkontrastkalibrierung in Molekülmasse umgewandelt. Die y-Achse zeigt die Anzahl der Moleküle an, die mit einer bestimmten Masse (oder einem bestimmten Kontrast) gezählt werden. Daher zeigt ein Peak das Vorhandensein einer Population von Molekülen innerhalb des auf der x-Achse angezeigten Bereichs von Molekulargewichten an. Die Anzahl der Ereignisse (Anzahl), aus denen sich der Spitzenwert zusammensetzt, spiegelt die Größe dieser Grundgesamtheit wider.

Die massenphotometrische Messung mit manueller Verdünnung führte zu einem Massenhistogramm, bei dem die beiden größten Peaks, basierend auf den erwarteten Molekulargewichten der Proteine, ungebundenen FcRn-Monomeren (~50 kDa) und IgG-Antikörpermonomeren (~150 kDa) entsprachen (Abbildung 7). Ähnlich wie bei den zuvor veröffentlichten Massenphotometrie-Daten5 waren die ungebundenen Spezies prominent, während Peaks in den Massenbereichen, die Komplexen entsprechen würden, viel weniger offensichtlich waren.

Das Experiment wurde mit einem Mikrofluidiksystem mit schneller Verdünnung wiederholt, um das Gemisch unmittelbar vor der Massenphotometrie-Messung auf die erforderliche Konzentration zu verdünnen. Dieser Ansatz ermöglichte den Nachweis zusätzlicher Komplexe mit geringer Affinität, die während des manuellen Verdünnungsschritts dissoziiert worden sein könnten. Um den gleichen 2000-fachen Verdünnungsfaktor zu erreichen, der während des manuellen Verdünnungsexperiments verwendet wurde, wurde das Probengemisch im Verhältnis 1:10 (bei einer Konzentration von 2 μM für IgG und 20 μM für FcRn) mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μl/min auf den Mikrofluidik-Chip geleitet, zusammen mit PBS-Puffer (pH 5,0) mit einer Flussrate von 1 ml/min. Um sicherzustellen, dass die Proteine zum Zeitpunkt der Messung nicht abgebaut wurden, wurden IgG (2 μM) und FcRn (20 μM) nach 120 Minuten Inkubation der Proben unter Fluss mit dem Mikrofluidik-System gemessen. Einzelne Kontrollmessungen zeigten keinen Proteinabbau (Ergänzende Abbildung 1)

Für die Probe, die einer schnellen Verdünnung unterzogen wurde, konnten erneut die Peaks beobachtet werden, die den FcRn-Monomeren (53 kDa), den FcRn-Dimeren (97 kDa) und den IgG-Monomeren (148 kDa) entsprechen. Außerdem wurden zwei zusätzliche Peaks bei 196 kDa und 251 kDa deutlich beobachtet, was IgG-FcRn-Komplexen mit 1:1 und 1:2 Stöchiometrien entspricht (Abbildung 7). Die erwarteten Massen für diese beiden Komplexe betrugen 200 kDa bzw. 250 kDa. Die Variabilität bei der Massenmessung liegt innerhalb des Messfehlers für das in dieser Studie verwendete Massenphotometer beträgt ±5%14 (2% für den 1:1-Komplex und 0,4% für den 1:2-Komplex).

Das Vorhandensein dieser Komplexe nur in der schnell verdünnten Probe stimmt mit der Vorstellung überein, dass sie dazu neigen, bei niedrigeren Konzentrationen zu dissoziieren, und zwar mit einer Rate, die im Vergleich zu einem manuellen Verdünnungsprozess schnell, aber im Vergleich zu dem Prozess der schnellen Verdünnung, der mit dem Mikrofluidiksystem15 erreicht wird, langsam ist.

Figure 1
Abbildung 1: Kombination von Mikrofluidik mit Massenphotometrie. (A,B) Die in diesem Protokoll verwendete Mikrofluidik-Box, von der Vorderseite (A) und (B) von oben. Die Reinigungslösungen werden in den Positionen 1-3 und die Proben und Kalibranten in den Positionen 4-6 platziert. Alle Lösungen werden mit dem m-switch verbunden, der mit dem Sensor der Durchflusseinheit "Small" verbunden ist. (C) Überblick über das gesamte System. Der Computer (oben links) ist mit der Mikrofluidik-Box (neben dem Puffer und den Probenröhrchen abgebildet) und dem Massenphotometer (unten rechts) verbunden, wo sich der Mikrofluidik-Chip befindet. Der Small Flow Rate Monitor (FRMS) überwacht den Durchfluss durch die Probenleitung, während der Large Flow Rate Monitor (FRML) den Pufferfluss überwacht. Der Proben- und Pufferleitungsschlauch wird mit einem Kanal auf dem Mikrofluidik-Chip verbunden, der sich im Inneren des Massenphotometers befindet. (D) Jeder Chip hat drei Kanäle. Das FRMS wird mit dem Probeneingang und das FRML mit dem Puffereinlass verbunden. Der Mischerbereich ist der Ort, an dem die schnelle Probenverdünnung stattfindet, während der Beobachtungsbereich der Ort ist, an dem die Massenphotometriemessungen durchgeführt werden. Der Auslass wird durch einen zusätzlichen Durchflusssensor überwacht, um sicherzustellen, dass es keine Lecks im Chip gibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Steuerungssoftware für die Mikrofluidik. Mit dieser Software können Sie die Durchflussmengen, die Druckleitungen des Mikrofluidiksystems und die Position des Multischalters (m-switch) einstellen und überwachen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Identifizierung des Vorhandenseins von Blasen im Öl. Die Beispiele aus der Datenerfassungssoftware zeigen einen klaren, ununterbrochenen Fokusring (links) und einen "gebrochenen" Ring, der auf das Vorhandensein von Luftblasen im Immersionsöl hinweist (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Beispiele für Probenkonzentrationen, bei denen die Anzahl der Moleküllandungsereignisse zu gering, ideal oder zu viele ist. Moleküle, die auf der Oberfläche des Beobachtungsbereichs im Mikrofluidik-Chip landen, erscheinen als dunkle Flecken in der ratiometrischen Ansicht des Massenphotometriebildes. Optimalerweise sollte die gewünschte Konzentration eine ideale Dichte an Landeereignissen während der Datenerfassung ermöglichen (Mitte). Wenn die Dichte des Landeereignisses zu niedrig ist (oben, "Zu wenige"), kann eine genaue statistische Analyse der Massenphotometriedaten nicht abgeschlossen werden. Wenn sie zu hoch ist (unten, "Zu viele"), überlappen sich die landenden Moleküle räumlich, was zu einer schlechten Datenqualität führt. Diese Bilder wurden mit der Datenerfassungssoftware unter Verwendung eines Massenphotometers aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Ein Screenshot der Datenanalysesoftware für die Massenphotometrie. Hier können die aus der Datenerfassungssoftware exportierten .mp-Dateien geladen werden, um die Daten zu analysieren. Aus den aufbereiteten Daten können Zahlen generiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Ein Screenshot der Massenkontrastkalibrierung für dieses Experiment. Das verwendete Kalibrant war β-Amylase, von der bekannt ist, dass sie drei Spezies bildet: Monomer (56 kDa), Dimer (112 kDa) und Tetramer (224 kDa). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Massenhistogramme zeigen die Komplexbildung erst nach schneller Probenverdünnung. Massenhistogramme und entsprechende Best-Fit-Gauß-Verteilungen sind für Messungen von IgG- und FcRn-haltigen Proben nach manueller Verdünnung (orange) oder schneller Verdünnung über das MikrofluidikHC-System (blau) dargestellt. Die Massenbeschriftungen geben an, dass die Mittelwerte aus den Gaußschen Kurven mit den Massenhistogrammen übereinstimmen, die nach der schnellen Verdünnung gemessen wurden. Nach manueller Verdünnung wurden Peaks beobachtet, die den FcRn-Monomeren (52 kDa, gemessen bei manueller Verdünnung) und den IgG-Monomeren (152 kDa) entsprachen. Nach schneller Verdünnung wurden neben den FcRn- und IgG-Monomeren auch Peaks deutlich beobachtet, die den FcRn-Dimeren und IgG-FcR-Komplexen mit 1:1- und 1:2-Stöchiometrie entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Daten Abbildung 1: Massenphotometrische Messungen von Kontrollproben nach schneller Verdünnung zeigen keinen Proteinabbau. (A) Massenhistogramm und Best-Fit-Gauß-Verteilung für die reine FcRn-Stichprobe. Die anfängliche Probenkonzentration vor der schnellen Verdünnung betrug 20 μM und die Flussrate wurde auf 0,5 μl/min eingestellt. Es konnten Massenpeaks beobachtet werden, die den FcRn-Monomeren (53 kDa) und FcRn-Dimeren (97 kDa) entsprechen. (B) Massenhistogramm und Best-Fit-Gauß-Verteilung für die IgG-Stichprobe (Herceptin). Die anfängliche Probenkonzentration vor der schnellen Verdünnung betrug 2 μM und die Flussrate wurde auf 1 μl/min eingestellt. Es konnte ein einzelner Massenpeak beobachtet werden, der dem IgG-Monomer (155 kDa) entspricht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Das hier skizzierte Protokoll bietet eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit geringer Affinität. Es verwendet ein Massenphotometer, das mit einem Mikrofluidiksystem mit schneller Verdünnung gekoppelt ist. Die Massenphotometrie ist ein markierungsfreies, bioanalytisches Werkzeug, mit dem die Molekülmasse in Lösung für Biomoleküle16 zuverlässig gemessen werden kann, für solche im Bereich von 30 kDa bis 6 MDa. Da es sich bei der Massenphotometrie um eine Einzelmolekültechnik handelt, bei der Proben einzeln analysiert werden, ist sie im Allgemeinen auf Proben im Konzentrationsbereich von 100 pM bis 100 nM beschränkt. Oberhalb dieses Bereichs überlappen sich die Moleküle, die auf der Glasoberfläche landen, räumlich, was zu einer schlechten Datenqualität führt. Unterhalb dieses Bereichs werden zu wenige Daten für eine robuste Analyse gewonnen7. Eine wichtige Konsequenz ist, dass die Untersuchung von Proteininteraktionen auf solche beschränkt werden kann, die innerhalb dieses Bereichs eine Mischung aus gebundenen und ungebundenen Spezies bilden.

Hier haben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Verwendung eines Mikrofluidiksystems mit schneller Verdünnung beschrieben, um den Bereich der Probenkonzentrationen, die für die Massenphotometrie geeignet sind, effektiv zu erweitern. Indem die Probe auf dem mikrofluidischen Chip verdünnt und dann innerhalb von 50 ms über das Beobachtungsfenster des Detektors geleitet wird, erfasst das System die in der unverdünnten Probe vorhandenen Komplexe, bevor sich das Wechselwirkungsgleichgewicht verschiebt. Die Probe wird während einzelner Messungen kontinuierlich dem Detektor zugeführt. Unter diesen Bedingungen bleiben 95 % des Komplexes intakt, wenn die Probe gemessen wird, selbst bei Wechselwirkungen mit geringer Affinität - mit einem KD in der Größenordnung von Mikromolaren und Dissoziationsraten von nur 1 s-1.

Dies kann wie folgt berechnet werden: Für eine Reaktion Equation 1 mit einer Vorwärtsrate kfund einer Rückwärtsrate kb

Equation 2

Im Gleichgewicht bleiben die Konzentrationen aller drei Spezies (A, B und der Komplex AB) konstant, also Equation 3 und Equation 4. Unter der konservativen Annahme, dass die Störung (in diesem Fall Verdünnung) dazu führen kann, dass der Komplex dissoziiert, die Vorwärtsreaktion (Assoziationsreaktion) jedoch nicht abläuft, kann der Term kf [A] [B] als vernachlässigbar behandelt werden, und es kann die folgende Vereinfachung vorgenommen werden:

Equation 6

Die Integration ergibt den folgenden Ausdruck für die Konzentration des Komplexes zum Zeitpunkt nach der Störung des Gleichgewichts:

Equation 7

Der Anteil des Komplexes, der zum Zeitpunkt t nach der Gleichgewichtsstörung noch gebunden bleibt, ist also:

Equation 8

Bei = 50 ms beträgt für eine Reaktion mit kb≈ 1 s-1 die gebundene Fraktion 0,95 oder 95%11,12.

Die Massenphotometrie wurde hier und zuvor5 eingesetzt, um die Bindung des monoklonalen IgG-Antikörpers Trastuzumab an die lösliche Domäne des FcRn zu untersuchen. Es wurde berichtet, dass die beiden Bindungspartner bei saurem pH17 mit nanomolarer Affinität binden. Die Massenphotometrie wurde verwendet, um die Häufigkeit der gebildeten Komplexe qualitativ zu beurteilen, während die Bindungspartner einen pH-Wert von 5,0 hatten, und die Proben wurden durch ein zusätzliches mikrofluidisches System schnell verdünnt. Das Verfahren wurde auf der Grundlage der zuvor berichteten Ergebnisse für die jeweilige Protein-Protein-Interaktion optimiert5. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um andere Wechselwirkungen zu untersuchen, vorausgesetzt, die Benutzer verfügen über Vorkenntnisse oder optimieren die experimentellen Bedingungen für das betreffende System, z. B. welche Puffer verwendet werden sollen, die anfängliche Proteinkonzentration, die erwartete Stöchiometrie und die Menge an Inkubation, die erforderlich ist, damit die Interaktion ein Gleichgewicht erreicht.

Wenn das IgG-FcRn-Gemisch manuell verdünnt wurde, war es schwierig, das Vorhandensein von IgG-FcR-Komplexen nachzuweisen, obwohl bekannt ist, dass diese Proteine interagieren5. Diese Arbeit zeigt, dass der Ansatz der schnellen Verdünnung zu einer deutlich erhöhten Menge dieser Komplexe führt. Bei derselben Probe wurden bei Verwendung einer Schnellverdünnung sowohl 1:1 FcRn-IgG-Komplexe als auch 2:1 FcRn-IgG-Komplexe deutlich beobachtet. Diese Unterschiede in der Komplexbildung zeigen, wie wichtig es ist, biomolekulare Interaktionssysteme über einen breiten Konzentrationsbereich hinweg zu untersuchen.

Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse auch, dass es einfach ist, Mikrofluidik mit Einzelmolekülanalyse zu verwenden, um schwache Wechselwirkungen zu erfassen - und damit eine bedeutende Lücke in der Methode zu schließen. Die Kombination der Mikrofluidik mit der Massenphotometrie bietet aufgrund der Vorteile der Massenphotometrie als Analysetechnik attraktive Vorteile. Das heißt, die Massenphotometrie erfordert keine Markierungen, erfordert nur eine minimale Probenvorbereitung und die Messungen werden in Lösung durchgeführt. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Massenphotometrie für dieses Protokoll ist ihre Fähigkeit, alle gebildeten Spezies zu unterscheiden und zu quantifizieren (vorausgesetzt, sie haben eine ausgeprägte Masse von >30 kDa). Dies steht im Gegensatz zur SPR, die beispielsweise die Bindungs- und Entbindungsraten messen kann, aber keine Stöchiometrie-Informationen liefern kann8.

Sowohl für dieses Protokoll als auch für Massenphotometrie-Experimente im Allgemeinen sind mehrere Überlegungen hilfreich. Zunächst sollte die endgültige Proteinkonzentration innerhalb der Grenze dessen liegen, was die Massenphotometrie messen kann (100 pM-100 nM). Die Anfangsinkubationskonzentration sollte ebenfalls innerhalb des Bereichs des mikrofluidischen Systems (bis zu 90 μM) liegen und theoretisch über dem tatsächlichen KD der Wechselwirkung10 liegen. Der empfohlene Ausgangspunkt ist ein Konzentrationsmischungsverhältnis von 1:1 zwischen den wechselwirkenden Spezies bei μM-Konzentration. Das Verhältnis könnte dann auf 1:2, 1:5 oder, wie im Fall dieser Wechselwirkung, 1:10 variiert werden. Wenn es keine vorherigen Informationen über die Proteininteraktionen gibt, müsste der Benutzer das Experiment optimieren, beginnend mit einer hohen Konzentration (empfohlen 20 μM) für jeden Partner, um festzustellen, ob die Affinität der Komponenten innerhalb des Konzentrationsbereichs liegt, der durch die vorgestellte Methode aufrechterhalten wird (d. h. es bilden sich Komplexe). Die Optimierung kann auch die Wahl anderer Pufferbedingungen beinhalten, um die Wechselwirkungen zu fördern, oder die Titration einer der Wechselwirkungskomponenten, um das richtige Mischungsverhältnis zu bestimmen. Sobald diese bestimmt sind, ist es möglich, Konzentrationen und Durchflüsse zu optimieren, um optimale Bedingungen für die Studie und die Methode zu schaffen, z. B. die Konzentrationen zu verringern, um eine bessere Peakauflösung zu ermöglichen.

Zweitens, um dieses Experiment erfolgreich zu replizieren, sollten Verunreinigungen minimiert werden. Zu den häufigsten Quellen von Verunreinigungen, von denen bekannt ist, dass sie sich negativ auf Massenphotometriemessungen auswirken, gehören andere Proteine oder zelluläre Trümmer, die nach der Reinigung zurückbleiben, ungefilterte Puffer, mizellenbildende Detergenzien (wenn sie in zu hoher Konzentration vorhanden sind) und Puffer, die hohe Konzentrationen von Salz, Glycerin oder anderen Komponenten enthalten. Wie im obigen Protokoll beschrieben, sollten Blasen im Mikrofluidiksystem entfernt werden. Blasen können sich im Schlauchsystem bilden oder wenn Proben eine hohe Oberflächenspannung aufweisen und zur Schaumbildung neigen. Auch im Immersionsöl können sich Blasen bilden, die am Fokusring erkennbar sind (Abbildung 3). Wenn Blasen mit den im Protokoll beschriebenen Schritten nicht entfernt werden können, besteht eine andere Lösung darin, die Probe mit einem Exsikkator und einer Vakuumpumpe zu entgasen und die Probe einige Minuten lang unter reduziertem Druck zu belassen. Das Vortexen oder Schütteln hochkonzentrierter Proteinlösungen wird nicht empfohlen, da diese Maßnahmen die Blasenbildung fördern können.

Während hier die Messung einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion demonstriert wird, kann das gleiche Protokoll ohne signifikante Modifikation auf andere Protein-Protein-Interaktionssysteme angewendet werden. Eine weitere zukünftige Richtung dieses Protokolls wäre es, die Messungen zur Berechnung von KD-Werten für die identifizierten Komplexe zu verwenden, wie dies an anderer Stelle im Rahmen der Massenphotometrie beschrieben wurde 5,7. Während in den vorangegangenen Studien Daten aus Experimenten mit manueller Verdünnung und stärkeren Wechselwirkungen verwendet wurden, könnte das Analyseprinzip in diesem Zusammenhang leicht angewendet werden - vorausgesetzt, es werden weitere Verbesserungen in der mikrofluidischen Vorrichtung implementiert (z. B. erhöhte Genauigkeit des Durchflusssensors und Pumpenstabilität).

Über Protein-Protein-Wechselwirkungen hinaus wird es wahrscheinlich breitere Anwendungen für die kombinierte Massenphotometrie und die Schnellverdünnungs-Mikrofluidik geben. Die Massenphotometrie kann zur Beurteilung der Reinheit, Aggregation und Homogenität von Proben verwendet werden18,19; Untersuchung der Proteinoligomerisierung20, der makromolekularen Assemblierung21 oder der Polymerisation22; und in anderen Bereichen. Die massenphotometrische Analyse geht auch über Proteine hinaus. Es wurde verwendet, um Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen23, Viruspartikeln24 und Nanopartikeln25 zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt somit eine wichtige Anwendung eines kombinierten Massenphotometrie-Mikrofluidik-Systems - es ermöglicht die direkte Messung schwacher Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Ebene einzelner Moleküle und Komplexe. Der Wert der vorliegenden Anwendung ist hoch, da sie die Möglichkeit eröffnet, Wechselwirkungen, die im Allgemeinen schwer zu untersuchen waren, einfach zu charakterisieren - mit Relevanz in kritischen therapeutischen Bereichen. Dieser kombinierte Ansatz könnte auch als Grundlage für ein breiteres Spektrum von Untersuchungen für Proben mit Konzentrationen bis zu einem Dutzend Mikromolaren dienen.

Disclosures

Myndert Claasen und Zornitsa Kofinova sind Mitarbeiter der Refeyn GmbH, die das Massenphotometer und das Mikrofluidiksystem herstellt, das in diesem Artikel verwendet wird. Weston Struwe ist Anteilseigner und Berater von Refeyn Ltd.

Acknowledgments

W.S. wird durch ein UKRI Future Leaders Fellowship [MR/V02213X/1] unterstützt. Der Text und die Grafiken des Manuskripts wurden mit Unterstützung von Mitgliedern des wissenschaftlichen Kommunikationsteams von Refeyn (Panagiota Paganopoulou, Neus Torres Tamarit und Catherine Lichten) erstellt. Wir danken auch für wertvolles Feedback von Camille Hetez, Sofia Ferreira und Matthias Langhorst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol (Isopropanol) VWR International LLC 20880.320
Data acquisition software Refeyn AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software Refeyn DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag Sigma SRP0624
Herceptin (IgG)  Cambridge Bioscience HY-P9907-1mg
Mass photometer Refeyn TwoMP
Microfluidics box Refeyn MassFluidix HC system
Microfluidics chip Refeyn MassFluidix HC chip
Microfluidics control software Fluigent OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure VWR International LLC K812
Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma S2770
β-Amylase, from sweet potato Sigma A8781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
  2. Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  3. Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).
  4. Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
  5. Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
  6. Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).
  7. Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
  8. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  9. Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  10. Refeyn Ltd. MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. , https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023).
  11. Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  12. Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264 (2020).
  13. Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).
  14. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation. , https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022).
  15. Lai, S. -H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211 (2021).
  16. Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
  17. Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
  18. Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).
  19. Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
  20. Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
  21. Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
  22. Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).
  23. Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521 (2021).
  24. Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
  25. Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

Tags

Ausgabe 203 Mikrofluidik Massenphotometrie Protein-Protein-Wechselwirkungen mit geringer Affinität IgG-Antikörper neonataler Fc-Rezeptor
Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino,… More

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino, M., Struwe, W. B. Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry. J. Vis. Exp. (203), e65772, doi:10.3791/65772 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter