Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

मास फोटोमेट्री के साथ माइक्रोफ्लुइडिक्स को युग्मित करके माइक्रोमोलर सांद्रता में प्रोटीन कॉम्प्लेक्स गठन का विश्लेषण

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65772
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4
1Refeyn Ltd., 2Adaptix Ltd., 3Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, University of Oxford, 4The Kavli Institute for Nanoscience Discovery, University of Oxford

Summary

यह प्रोटोकॉल कम आत्मीयता प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए एक उपन्यास माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम के साथ बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री को जोड़ती है। यह दृष्टिकोण समाधान में अत्यधिक केंद्रित परिसरों के तेजी से कमजोर पड़ने पर आधारित है, जो कम-आत्मीयता माप को सक्षम बनाता है और बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री की प्रयोज्यता को व्यापक बनाता है।

Abstract

मास फोटोमेट्री एक बहुमुखी द्रव्यमान माप तकनीक है जो लेबल के बिना समाधान में बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन और जटिल गठन के अध्ययन को सक्षम बनाती है। मास फोटोमेट्री आम तौर पर 100 पीएम-100 एनएम एकाग्रता रेंज में नमूनों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल है। हालांकि, कई जैविक प्रणालियों में, कम-आत्मीयता या क्षणिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए अधिक केंद्रित नमूनों को मापना आवश्यक है। यहां, हम एक ऐसी विधि का प्रदर्शन करते हैं जो प्रभावी रूप से नमूना सांद्रता की सीमा का विस्तार करती है जिसका विश्लेषण नैनोमोलर से दसियों माइक्रोमोलर तक बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री द्वारा किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री को माइक्रोमोलर एकाग्रता रेंज में समाधान में प्रोटीन परिसरों के गठन की जांच करने के लिए एक उपन्यास माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रणाली के साथ जोड़ा जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रणाली के साथ, उपयोगकर्ता एक वांछित उच्च सांद्रता पर एक नमूना बनाए रख सकते हैं, जिसके बाद नैनोमोलर रेंज को कमजोर करना - बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री माप से पहले कई मिलीसेकंड। कमजोर पड़ने की गति के कारण, नमूने के संतुलन को स्थानांतरित करने से पहले डेटा प्राप्त किया जाता है (यानी, परिसर का पृथक्करण)।

तकनीक को एक इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) एंटीबॉडी और नवजात एफसी रिसेप्टर के बीच बातचीत को मापने के लिए लागू किया जाता है, जो उच्च-क्रम परिसरों के गठन को दर्शाता है जो स्थिर द्रव्यमान फोटोमेट्री माप के साथ मात्रात्मक नहीं थे।

अंत में, बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री और माइक्रोफ्लुइडिक्स का संयोजन माइक्रोमोलर एकाग्रता रेंज में नमूनों को चिह्नित करना संभव बनाता है और कमजोर समानता के साथ बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन को मापने में कुशल है। इन क्षमताओं को कई संदर्भों में लागू किया जा सकता है - बायोथेरेप्यूटिक्स के विकास और डिजाइन सहित - विविध प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के गहन लक्षण वर्णन को सक्षम करना।

Introduction

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन प्रतिरक्षा विनियमन से डीएनए प्रतिकृति और अनुवाद तक अधिकांश सेलुलर कार्यों को रेखांकित करते हैं। नतीजतन, आमतौर पर बनने वाले विविध विषम परिसरों में बातचीत की एक विशाल श्रृंखला की जांच करने के लिए पूरे जीवन विज्ञान में एक मौलिक आवश्यकता है। हालांकि, उनकी पहचान, लक्षण वर्णन, और मात्रा का ठहराव अक्सर चुनौतीपूर्ण होते हैं, विशेष रूप से कम आत्मीयता बातचीत1 के लिए.

इम्यूनोप्रिपिटेशन परख का उपयोग अक्सर उच्च-आत्मीयता इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए किया जाता है, लेकिन कम-आत्मीयता और क्षणिक बातचीत के लिए, पता लगाना काफी हद तक अव्यवहार्य है2. प्रतिदीप्ति तकनीक भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन फ्लोरोसेंट लेबल2 के संभावित विघटनकारी जोड़ की आवश्यकता है. क्रायो-ईएम एक संरचनात्मक स्नैपशॉट और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ गठित प्रोटीन परिसरों का एक पहनावा रीडआउट प्रदान कर सकता है, लेकिन आमतौर पर कम आत्मीयता बातचीत की इमेजिंग के लिए बहुत कम सांद्रता पर काम करने की आवश्यकता होती है। क्रायो-ईएम लागत, पहुंच, नमूना तैयार करने और विश्लेषण समय से संबंधित चुनौतियां भी लाताहै।

इसके अतिरिक्त, सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करने का एक लोकप्रिय तरीका बन गया है, हालांकि इसके लिए प्रोटीन स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है, जो बाध्यकारी संतुलन को प्रभावित कर सकता है और परिणामस्वरूप परिवर्तनीय ऑन-दरों में परिणाम हो सकता है, इस प्रकार माप सटीकता 4,5 को कम कर सकता है। यह भी डेटा संग्रह और विश्लेषण 6 से पहले कई परख कदम शामिलहै.

मास फोटोमेट्री एक एकल अणु तकनीक है जिसका उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन 5,6,7का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। यह एकल अणुओं या परिसरों के द्रव्यमान को मापने के द्वारा काम करता है, जब वे एक ग्लास कवरस्लिप8 की सतह पर उतरते हैं, तो वे बिखरते हैं। मास फोटोमेट्री माप का उपयोग बाध्यकारी भागीदारों के सापेक्ष बहुतायत और उनके द्वारा बनाएगए परिसरों से बाध्यकारी समानता को निर्धारित करने के लिए किया गया है। फिर भी, अन्य एकल-अणु तकनीकों की तरह, मापा जाने वाला नमूना की एकाग्रता आमतौर पर 100 एनएम से कम होनी चाहिए। यदि एकाग्रता अधिक है, तो कांच की सतह पर उतरने वाले अणु स्थानिक रूप से ओवरलैप करेंगे, जिसके परिणामस्वरूप खराब डेटा गुणवत्ता7. नतीजतन, कमजोर बातचीत (केडी ~ माइक्रोमोलर्स), जो इन कम सांद्रता पर अलग हो जाती है, को मज़बूती से मापा नहीं जा सकता है क्योंकि अनबाउंड और बाउंड प्रजातियों के आवश्यक मिश्रण का निरीक्षण करना संभव नहींहै 5.

यहां, हम एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो एक नए युग्मित माइक्रोफ्लुइडिक्स मास फोटोमेट्री डिवाइस के आधार पर इस सीमा पर काबू पाता है। विशेष रूप से, एक माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग मास फोटोमीटर के संयोजन में किया जाता है ताकि बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री द्वारा निर्धारित की जा सकने वाली बातचीत की सीमा को प्रभावी ढंग से विस्तारित किया जा सके। माइक्रोफ्लुइडिक्स को प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए संभावनाओं की एक श्रृंखला की पेशकश करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें कमजोर इंटरैक्शन 1,9का पता लगाने के लिए तेजी से कमजोर पड़ने शामिल है। इस के साथ साथ साथ वर्णित प्रणाली तेजी से एक microfluidic चिप पर 10,000 गुना तक नमूना पतला और तुरंत चिप के अवलोकन क्षेत्र भर में यह प्रवाहित करने के लिए अणुओं कमजोर पड़ने की प्रक्रिया10 शुरू कर दिया जब अणुओं से 50 एमएस के भीतर शुरू करने के लिए बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री माप को सक्षम करने, संचालित संचालित करता है. कमजोर पड़ने तब होता है जब नमूना और बफर चिप पर एक रिवर्स टेस्ला वाल्व मिक्सर में संयुक्त होते हैं, दो समाधानों के सापेक्ष प्रवाह दर के साथ कमजोर पड़ने की मात्रा निर्धारित होती है (प्रोटोकॉल चरण 8 देखें)। प्रवाह दर microfluidic नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रणीय है. प्रवाह दर को बदलने से प्रजातियों की सापेक्ष आबादी बदल सकती है क्योंकि यह कांच की सतह पर लैंडिंग घटनाओं की संख्या को प्रभावित कर सकती है, जिसे द्रव्यमान फोटोमीटर द्वारा मापा जाता है।

बातचीत की अखंडता बाधित होने से पहले माप पूरा करने के लिए प्रक्रिया की गति काफी तेज है (अधिक जानकारी के लिए, चर्चा भी देखें)। इसे प्रथम-क्रम प्रतिक्रियाओं के सिद्धांत पर एक संक्षिप्त नज़र के माध्यम से समझा जा सकता है, जहां Equation 1। अग्र (संघ) दर स्थिरांक kf है, पश्चगामी (पृथक्करण) दर स्थिरांक kb है, और संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (KD) को किस रूप में परिभाषित किया गया है?

केडी = केबी /

प्रोटीन बाइंडिंग के लिए, kfआम तौर पर अभिकारकों के प्रसार11 द्वारा सीमित होता है और इसलिए 10 6-107 M-1·s-1 की सीमा तक सीमित होता है। क्योंकि की सीमा सीमित है, एक कम-आत्मीयता (KD ~ माइक्रोमोलर्स) प्रतिक्रिया में kb≈ 1 s-1 होगा। अर्थात्, kb = kf  · KD= (106 M-1·s-1) (10-6 M) = 1 s-1, कॉम्प्लेक्स का आधा जीवन लगभग 0.7 s11,12 के साथ।

हमारी उदाहरण प्रणाली आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ट्रास्टुज़ुमाब को आईजीजी नवजात एफसी रिसेप्टर (एफसीआरएन) के घुलनशील डोमेन के लिए बाध्य करती है, जो इंटरैक्टिंग पार्टनर13 के रूप में जानी जाती हैं। अकेले पारंपरिक द्रव्यमान फोटोमेट्री (यानी, नमूनों के मैनुअल कमजोर पड़ने के साथ) का उपयोग करके प्राप्त पहले प्रकाशित आंकड़ों से पता चला है कि प्रोटीन कई प्रजातियां बनाते हैं। FcRn मोनोमर्स, FcRn डिमर, और अनबाउंड IgG स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, जबकि IgG-FcRn कॉम्प्लेक्स (1:1 और 1:2 अनुपात पर) का भी पता चला (पीएच 5.0 पर) लेकिन केवल बहुत कम बहुतायत5 के साथ। यह अवलोकन इस सवाल का संकेत देता है कि क्या आईजीजी-एफसीआरएन जटिल गठन को अधिक स्पष्ट रूप से पता लगाया जा सकता है यदि उच्च एकाग्रता पर मापा जाता है। दरअसल, यहां वर्णित एक युग्मित तेजी से कमजोर पड़ने वाले दृष्टिकोण के साथ बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री के संयोजन ने उनके मापा कणों में वृद्धि से जटिल गठन के अधिक मजबूत सबूत प्रदान किए।

यहां वर्णित मास फोटोमेट्री और माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रोटोकॉल माइक्रोमोलर रेंज तक केडी के साथ परिसरों के गठन को चिह्नित करना संभव बनाता है। केडी के एक अनुभवजन्य निर्धारण के लिए प्रवाह संवेदक सटीकता, पंप स्थिरता, चिप-टू-चिप विविधताओं और अवलोकन विंडो के अंदर माप स्थान पर और सुधार की आवश्यकता होगी, क्योंकि ये सभी कारक उस समय को प्रभावित करेंगे जब नमूना पतला हो जाता है मापा जा रहा है।

किसी भी घुलनशील प्रोटीन के बीच बंधन की जांच करने के लिए एक ही दृष्टिकोण लागू किया जा सकता है, बशर्ते उनके पास अलग-अलग आणविक भार (कम से कम 25 केडीए से अलग) हों जो द्रव्यमान फोटोमीटर (30 केडीए से 6 एमडीए) के साथ विश्लेषण के लिए उपयुक्त सीमा में आते हैं। प्राप्त अंतर्दृष्टि कई संदर्भों में अध्ययन के लिए सहायक हो सकती है - सेलुलर कार्यों की यंत्रवत समझ प्राप्त करने से लेकर नई बायोथेरेप्यूटिक दवाओं के डिजाइन तक।

Protocol

1. उपकरण तैयार करना और सॉफ्टवेयर लॉन्च करना

  1. बड़े पैमाने पर फोटोमीटर पर मुड़ें और किसी भी माप शुरू करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए यह पर छोड़ दें.
    नोट: ऐसा इसलिए है क्योंकि उपकरण को एक स्थिर तापमान तक पहुंचने की आवश्यकता होती है। 1 घंटे के लिए द्रव्यमान फोटोमीटर को नहीं छोड़ने से बड़े पैमाने पर बदलाव हो सकता है और इसलिए, गलत परिणाम हो सकते हैं।
  2. पावर चालू करके और आइसोलेशन बटन (मास फोटोमीटर के नीचे) दबाकर एंटी-वाइब्रेशन टेबल चालू करें। कंपन बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री उपकरण के प्रदर्शन को सीमित करते हैं, इसलिए अधिकतम उपकरण संवेदनशीलता सुनिश्चित करने के लिए विरोधी कंपन तालिका महत्वपूर्ण है। माइक्रोफ्लुइडिक्स बॉक्स चालू करें।
  3. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। एयर कंप्रेसर चालू करें।

2. प्रोटीन के नमूने, बफर और सफाई समाधान तैयार करना

  1. एक साफ 200 एमएल बोतल के लिए पीबीएस (पीएच 7.4) बफर के 200 एमएल और पीबीएस (पीएच 5.0) बफर के 200 एमएल को दूसरी 200 एमएल बोतल में जोड़ें।
    नोट: 200 एमएल बोतलों को अगले चरणों में "एल" फ्लो यूनिट सेंसर से जोड़ने की आवश्यकता होगी। अंशांकन माप के लिए पीएच 7.4 पीबीएस बफर और नमूना माप के लिए पीएच 5.0 पीबीएस बफर का उपयोग करें।
  2. 0.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 60 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए 1:10 अनुपात में आईजीजी (2 माइक्रोन) और एफसीआरएन (20 माइक्रोन) मिलाएं।
    1. FcRn और IgG के लिए स्टॉक समाधान क्रमशः 91.9 माइक्रोन और 13.5 माइक्रोन हैं। 60 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्टॉक आईजीजी + स्टॉक एफसीआरएन के 13 माइक्रोन + पीबीएस (पीएच 5.0, कमरे के तापमान [आरटी]) के 38 माइक्रोन को मिलाकर प्रतिक्रिया तैयार करें। दो अभिकारकों के लिए अंतिम सांद्रता आईजीजी के लिए 2 माइक्रोन और एफसीआरएन के लिए 20 माइक्रोन थी। इस प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर सभी प्रोटीन स्टॉक रखें।
  3. एक और 0.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 20 माइक्रोन एकाग्रता पर β-एमाइलेज कैलिब्रेंट के 20 माइक्रोन फैलाएं।
    1. एक उदाहरण के रूप में, यहां उपयोग किए जाने वाले β-एमाइलेज कैलिब्रेंट को तैयार करने के लिए, 2.3.1.1-2.3.1.2 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें।
      1. पीबीएस (5% ग्लिसरॉल) के 3.57 एमएल में शीशी में 20 मिलीग्राम β-एमाइलेज पाउडर को फिर से निलंबित करें, जो 5.6 मिलीग्राम/एमएल और 100 माइक्रोन की दाढ़ एकाग्रता (आणविक भार 56 केडीए के रूप में) के अनुरूप है।
      2. 20 माइक्रोन को पतला करने के लिए, 1 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में पीबीएस (पीएच 7.4, आरटी) के 800 माइक्रोन के साथ 100 माइक्रोन स्टॉक के 200 माइक्रोन को मिलाएं।
  4. कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं.
    नोट: मास फोटोमीटर चालू करने के बाद नमूना और कैलिब्रेंट कमजोर पड़ने की तैयारी शुरू करें। इस प्रयोग के लिए, नमूने 120 मिनट के लिए ऊष्मायन थे.
  5. तीन 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में, विभाज्य: पीबीएस के 50 एमएल (पीएच 7.4) - सफाई समाधान 1 (सीएस 1), 0.5 एम एनएओएच के 50 एमएल - सफाई समाधान 2 (सीएस 2), और 100% आईपीए के 50 एमएल - सफाई समाधान 3 (सीएस 3)।

3. प्रायोगिक सेट-अप

  1. नमूना और अंशांकन लोड करने के लिए, कैलिब्रेंट अपकेंद्रित्र ट्यूब को स्थिति 4 पर रखें और नमूना अपकेंद्रित्र ट्यूब को माइक्रोफ्लुइडिक्स बॉक्स(चित्रा 1)के स्थिति 5 पर रखें।
  2. सफाई समाधान लोड करने के लिए, CS1, CS2, और CS3 को माइक्रोफ्लुइडिक्स बॉक्स(चित्रा 1)के 1, 2 और 3 की स्थिति में रखें।
    नोट: नमूना, अंशांक, और सफाई समाधान मल्टी-स्विच (एम-स्विच) से जुड़े हैं। एम-स्विच "एस" फ्लो यूनिट सेंसर से जुड़ा है।
  3. टोपी है कि 200 एमएल (पीएच 7.4) बफर बोतल पर बफर लाइन से जोड़ता पेंच.
    नोट: बफर लाइन एक शट-ऑफ वाल्व से जुड़ी है, जो "एल" फ्लो यूनिट सेंसर से जुड़ी है। शट-ऑफ वाल्व किसी भी साइफनिंग प्रभाव को रोकता है जो बफर प्रवाह बंद होने पर हो सकता है। साइफनिंग से बफर जलाशय में लौटने वाले पतला अवशिष्ट तरल पदार्थ से बफर का संदूषण हो सकता है।
  4. माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप को तैयारी की प्लेट पर रखें।
    माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप (चित्रा 1) में पहले चैनल के "नमूना इनलेट" में "एस" प्रवाह इकाई सेंसर के अन्य ट्यूब अंत पुश. नमूना लाइन पूरा हो गया है।
  5. माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप (चित्रा 1) में पहले चैनल के "बफर इनलेट" में "एल" प्रवाह इकाई सेंसर के दूसरे ट्यूब अंत को पुश करें। बफर लाइन पूरी हो गई है।
  6. बहिर्वाह इकट्ठा करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप में पहले चैनल के "आउटलेट" के लिए एक ट्यूब को धक्का दें; दूसरे छोर की स्थिति ताकि यह एक बेकार ग्रहणशील फ्लास्क या बीकर (चित्रा 1) में निकल जाए।

4. बफर के साथ नमूना और बफर लाइनों को भड़काना

  1. बफर लाइन पर मैनुअल शट-ऑफ वाल्व खोलें।
  2. माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, बफर लाइन प्रवाह दर को 1000 माइक्रोन/मिनट पर सेट करें और सुनिश्चित करें कि बफर लाइन दबाव 110 एमबार(चित्रा 2)से अधिक न हो। प्रवाह स्वचालित रूप से बफर लाइन (चित्रा 1) में शुरू हो जाएगा.
    नोट: यदि बफर लाइन का दबाव 110 एमबार से अधिक है, तो यह प्रवाह संवेदक से गुजरने वाली हवा के कारण हो सकता है। यदि दबाव कुछ सेकंड के भीतर सामान्य पर वापस नहीं जाता है, तो संभावित रूप से एक रुकावट होती है (आमतौर पर कनेक्शन पर चुटकी टयूबिंग के कारण)। उस स्थिति में, प्रवाह को रोकें और शट-ऑफ वाल्व से शुरू होने वाली बफर लाइन में कनेक्शन की जांच करें।
  3. माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, एम-स्विच (पीबीएस बफर के अनुरूप) की स्थिति 1 का चयन करें, फिर नमूना लाइन प्रवाह दर को 8 माइक्रोन/मिनट पर सेट करें और सुनिश्चित करें कि नमूना लाइन दबाव 350 एमबार से अधिक नहीं है। प्रवाह स्वचालित रूप से नमूना लाइन (चित्रा 1) में शुरू हो जाएगा.
  4. हवा के बुलबुले को उखाड़ फेंकने के लिए चिप में फंसे बुलबुले (ओं) के पास ऊपर से कोमल दबाव लागू करने के लिए एक विंदुक टिप (या अन्य नरम प्लास्टिक घटक) का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि वे आउटलेट के माध्यम से हटा दिए जाते हैं।
    नोट: उपयोग में चैनल के 'मिक्सर' और 'अवलोकन क्षेत्र' (चित्रा 1) वर्गों में सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें. ध्यान रखें कि बहुत जोर से धक्का न दें, क्योंकि इससे चिप को नुकसान हो सकता है।

5. माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप को मास फोटोमीटर पर रखना और फोकस ढूंढना

  1. मास फोटोमीटर के उद्देश्य पर माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल की एक बूंद लागू करें।
  2. माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप को बड़े पैमाने पर फोटोमीटर के धारक पर "नमूना इनलेट" का सामना करना पड़ रहा है और इसे मंच क्लैंप (चित्रा 1) से जुड़ा हुआ है। सुनिश्चित करें कि सभी टयूबिंग कनेक्शन संलग्न रहते हैं।
  3. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, यह सुनिश्चित करने के लिए मंच को स्थानांतरित करें कि चैनल 1 का "अवलोकन क्षेत्र" उद्देश्य (चित्रा 1) के साथ गठबंधन किया गया है।
  4. मास फोटोमीटर ढक्कन बंद करें और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में ड्रॉपलेट-कमजोर पड़ने फोकस खोजें विकल्प दबाएं।
  5. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (चित्रा 3) के निचले बाएं कोने में सफेद फोकस अंगूठी की जाँच करें. अंगूठी में अंतराल विसर्जन तेल में हवा के बुलबुले की उपस्थिति का संकेत देता है; अधिकतम करने के लिए मंच की गति बढ़ाने और धीरे बाद में मंच चलती द्वारा इस निकालें.
  6. ध्यान केंद्रित पूरा होने के बाद, पहली रिकॉर्डिंग लेने से पहले 2-3 मिनट प्रतीक्षा करें. फिर, 1 मिनट माप रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्ड दबाएं और सुनिश्चित करें (माप को देखकर) कि कोई अशुद्धियाँ दिखाई नहीं देती हैं।
    नोट: अशुद्धियाँ कांच की सतह पर या बफर में हो सकती हैं। डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में तीक्ष्णता मूल्य 4.5% से ऊपर होना चाहिए।

6. मास फोटोमेट्री अंशांकन

  1. माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, एम-स्विच को स्थिति 4 (अंशांकन के अनुरूप) पर स्विच करें और सुनिश्चित करें कि नमूना लाइन प्रवाह दर 8 माइक्रोन/मिनट पर सेट है और नमूना लाइन दबाव 350 एमबार(चित्रा 2)से अधिक नहीं है।
    1. कैलिब्रेंट चिप के माध्यम से प्रवाह शुरू कर देगा। लगभग 1.5-2.5 मिनट प्रतीक्षा करें (या जब तक अंशशोधक डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर लगातार देखा जाता है). नमूना लाइन टयूबिंग लंबाई के आधार पर समय भिन्न हो सकते हैं.
  2. एक बार कैलिब्रेंट लगातार देखा जाता है (यानी, घटनाओं की संख्या एक सटीक जन फोटोमेट्री माप के लिए पर्याप्त है), माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, प्रवाह दर को 0.5 माइक्रोन / मिनट तक कम करें - इस प्रयोग के लिए लक्ष्य कमजोर पड़ने का स्तर।
    नोट: एक उच्च प्रवाह दर के साथ शुरुआत बस चिप तक पहुँचने के लिए कैलिब्रेंट के लिए आवश्यक समय कम कर देता है.
  3. सुनिश्चित करें कि माप सतह (चित्रा 4) पर लैंडिंग "बहुत कम" या "बहुत सारे" अणु नहीं हैं।
    1. यदि लैंडिंग घटना घनत्व "आदर्श" (चित्रा 4) नहीं है, तो माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रवाह दर बदलें। यदि घटना घनत्व बहुत कम है, नमूना प्रवाह दर में वृद्धि जब तक अच्छी तरह से अलग लैंडिंग घटनाओं मनाया जाता है (लेकिन 8 माइक्रोन / मिनट से अधिक नहीं है). यदि यह बहुत अधिक है, तो नमूना प्रवाह दर को कम करें (लेकिन 0.1 माइक्रोन/मिनट से कम न जाएं)।
    2. यदि नमूना ट्यूब में कैलिब्रेंट वॉल्यूम कम चल रहा है, तो हवा को इंजेक्ट करने से बचने के लिए एम-स्विच स्थिति को पीबीएस पीएच 7.4 लाइन (स्थिति 1) में बदलें।
  4. रिकॉर्ड दबाएं और 60 एस माप लें। फ़ाइल को किसी चुने हुए फ़ोल्डर में सहेजें।
    नोट: डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर एक्सटेंशन के रूप में .mp के साथ फ़ाइलों का उत्पादन करता है।

7. नमूना लाइन की सफाई और प्रवाह को रोकना

  1. माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, एम-स्विच की स्थिति 2 पर स्विच करें और नमूना दबाव को 800 एमबार(चित्रा 2)में बदलें। 4 मिनट के लिए CS2 (NaOH) के साथ प्रणाली फ्लश.
  2. एम-स्विच की स्थिति 3 पर स्विच करें और सिस्टम को 4 मिन के लिए CS3 (IPA) के साथ फ्लश करें।
  3. एम-स्विच की स्थिति 1 पर स्विच करें और सिस्टम को 4 मिन के लिए CS1 (पीबीएस) के साथ फ्लश करें।
  4. माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, नमूना लाइन और बफर लाइन दबाव को 0 पर सेट करके सभी प्रवाह को रोकें और बफर वाल्व को बंद कर दें।
  5. चिप को मंच से डिस्कनेक्ट करें और इसे वापस तैयारी की प्लेट पर रखें। सभी टयूबिंग डिस्कनेक्ट और एक अपशिष्ट बोतल में नमूना टयूबिंग अंत जगह है. उद्देश्य को आइसोप्रोपेनॉल और वाइप्स से साफ करें।

8. बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री नमूने को मापना

  1. 200 एमएल (पीएच 7.4) बफर बोतल से जुड़ी टोपी को खोलना और इसे 200 एमएल (पीएच 5.0) बफर बोतल में पेंच करें।
  2. चरण 3.4-5.6 दोहराएं, लेकिन पहले वाले के बजाय चिप के दूसरे चैनल का उपयोग करें।
  3. माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, एम-स्विच को स्थिति 5 (नमूने के अनुरूप) पर स्विच करें, नमूना लाइन प्रवाह दर को 8 माइक्रोन/मिनट पर सेट करें, और सुनिश्चित करें कि नमूना लाइन दबाव 350 एमबार(चित्रा 2)से अधिक नहीं है।
  4. नमूना को मापने के लिए 6.2-6.4 कदम दोहराएँ.
    1. उपयोग करने के लिए प्रवाह दरों की गणना करने के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रवाह दर में गुना अंतर वांछित नमूना कमजोर पड़ने कारक से मेल खाता है। उदाहरण के लिए, यहां 2000x के कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए, प्रवाह दर 2000 के कारक से भिन्न होती है; बफर प्रवाह दर 1000 माइक्रोन/मिनट है, और नमूना प्रवाह दर 0.5 माइक्रोन/मिनट है। एक प्रयोग के अंत में, हमेशा सफाई प्रोटोकॉल का पालन करके लाइनों को साफ छोड़ दें।

9. डेटा विश्लेषण

  1. एक बार डेटा का अधिग्रहण समाप्त हो गया है, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 5) लॉन्च करें।
  2. ऊपर बाईं ओर प्लस (+) आइकन पर क्लिक करें और .mp कैलिब्रेंट फ़ाइल चुनें। सॉफ्टवेयर लोड की गई फ़ाइल का विश्लेषण करना शुरू कर देगा। माप के आकार और संख्या के आधार पर, इसमें कुछ मिनट लग सकते हैं
    1. डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के साथ डेटा प्राप्त करते समय डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में .mp फ़ाइलों का विश्लेषण न करें क्योंकि ऐसा करने से प्राप्त किए जा रहे डेटा की गुणवत्ता कम हो सकती है।
  3. बड़े पैमाने पर अंशांकन बनाएँ बटन दबाएँ (नीचे दाएं). एक संवाद फिट चोटियों के कंट्रास्ट मूल्यों के साथ आबादी वाली तालिका दिखा खुल जाएगा.
  4. फिट चोटियों के लिए ज्ञात द्रव्यमान मूल्यों के लिए मान बदलें (β-amylase के लिए ये मान 56 kDa, 112 kDa, और 224 kDa हैं) और सहेजें दबाएँ. नव निर्मित अंशांकन फ़ाइल (.mc एक्सटेंशन) मास अंशांकन पैनल (डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के नीचे बाएं) (चित्रा 6) पर दिखाई देगा.
  5. ऊपर बाईं ओर प्लस (+) आइकन पर क्लिक करें और .mp नमूना फ़ाइल चुनें.
  6. एक बड़े पैमाने पर हिस्टोग्राम बनाने के लिए, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है, विश्लेषण टैब पर जाएँ, हिस्टोग्राम मोड और मास प्लॉट विकल्प का चयन करें . आवश्यकतानुसार बिन चौड़ाई, मास लिमिट और अन्य मापदंडों को समायोजित करें।
  7. आंकड़े निर्यात करने और/या पूरे कार्यक्षेत्र को .dmp फ़ाइल के रूप में सहेजने से पहले वांछित होने पर चित्र टैब में प्लॉट को और अनुकूलित करें।

Representative Results

मास फोटोमेट्री का उपयोग आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ट्रास्टुज़ुमाब और आईजीजी नवजात एफसी रिसेप्टर (एफसीआरएन) के घुलनशील डोमेन के बीच बातचीत को मापने के लिए किया गया था। दो प्रोटीनों का 1:10 मिश्रण (आईजीजी के लिए 2 माइक्रोन और एफसीआरएन के लिए 20 माइक्रोन पर) क्रमशः पीबीएस में मैन्युअल रूप से 10 एनएम और 20 एनएम तक पतला था।

कमजोर पड़ने कदम आवश्यक है क्योंकि बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री, एक एकल अणु द्रव्यमान माप तकनीक, केवल 100 पीएम -100 एनएम रेंज में नमूनों का विश्लेषण कर सकती है। इस सीमा के बाहर सांद्रता के साथ नमूनों को मापने का प्रयास परिणामों की सटीकता को खतरे में डाल सकता है (चित्र 4)। यह प्रयोग इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, के रूप में यह पहले 5,6 वर्णित किया गया है.

एक बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री प्रयोग में उत्पादित द्रव्यमान हिस्टोग्राम में, प्रत्येक लैंडिंग घटना के लिए बिखरने वाले संकेत (या 'कंट्रास्ट') की ताकत एक्स-अक्ष पर प्लॉट की जाती है, और इसे द्रव्यमान-विपरीत अंशांकन चरण के माध्यम से आणविक द्रव्यमान में परिवर्तित किया जाता है। इस बीच, y-अक्ष किसी दिए गए द्रव्यमान (या कंट्रास्ट) के साथ गिने गए अणुओं की संख्या को इंगित करता है। इसलिए, एक शिखर एक्स-अक्ष पर दिखाए गए आणविक भार की सीमा के भीतर अणुओं की आबादी की उपस्थिति को इंगित करता है। चोटी बनाने वाली घटनाओं (गणना) की संख्या उस आबादी के आकार को दर्शाती है।

मैनुअल कमजोर पड़ने के साथ बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री माप के परिणामस्वरूप एक बड़े पैमाने पर हिस्टोग्राम हुआ जहां प्रोटीन के अपेक्षित आणविक भार के आधार पर दो सबसे बड़ी चोटियां, अनबाउंड एफसीआरएन मोनोमर्स (~ 50 केडीए) और आईजीजी एंटीबॉडी मोनोमर्स (~ 150 केडीए) (चित्रा 7) के अनुरूप थीं। पहले प्रकाशित मास फोटोमेट्री डेटा5 के समान, अनबाउंड प्रजातियां प्रमुख थीं, जबकि बड़े पैमाने पर श्रेणियों में चोटियां जो परिसरों के अनुरूप होंगी, बहुत कम स्पष्ट थीं।

प्रयोग को तेजी से कमजोर पड़ने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करके दोहराया गया था ताकि मिश्रण को द्रव्यमान फोटोमेट्री माप से तुरंत पहले आवश्यक एकाग्रता में पतला किया जा सके। इस दृष्टिकोण ने अतिरिक्त कम-आत्मीयता परिसरों का पता लगाने में सक्षम किया, जो मैनुअल कमजोर पड़ने के चरण के दौरान अलग हो सकते हैं। मैनुअल कमजोर पड़ने प्रयोग के दौरान इस्तेमाल किया एक ही 2000x कमजोर पड़ने कारक को प्राप्त करने के लिए, 1:10 नमूना मिश्रण (आईजीजी के लिए 2 माइक्रोन एकाग्रता और एफसीआरएन के लिए 20 माइक्रोन पर) पीबीएस बफर (पीएच 5.0) के साथ 0.5 माइक्रोन/मिनट की दर से माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर प्रवाहित किया गया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माप के समय प्रोटीन को नीचा नहीं किया गया था, आईजीजी (2 माइक्रोन) और एफसीआरएन (20 माइक्रोन) को नमूनों के इनक्यूबेशन के 120 मिनट के बाद माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम के साथ प्रवाह के तहत मापा गया था। व्यक्तिगत नियंत्रण माप ने कोई प्रोटीन गिरावट नहीं दिखाई(अनुपूरक चित्रा 1)

तेजी से कमजोर पड़ने वाले नमूने के लिए, FcRn मोनोमर्स (53 kDa), FcRn डिमर (97 kDa), और IgG मोनोमर्स (148 kDa) के अनुरूप चोटियों को फिर से देखा जा सकता है। इसके अलावा, दो अतिरिक्त चोटियों को 196 केडीए और 251 केडीए पर स्पष्ट रूप से देखा गया था, जो आईजीजी-एफसीआरएन परिसरों के अनुरूप 1:1 और 1:2 स्टोइकोमेट्री(चित्रा 7)के साथ था। इन दो परिसरों के लिए अपेक्षित द्रव्यमान क्रमशः 200 केडीए और 250 केडीए थे। बड़े पैमाने पर माप में परिवर्तनशीलता इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए द्रव्यमान फोटोमीटर के लिए माप त्रुटि के भीतर है ±5% 14 (1: 1 परिसर के लिए 2% और 1: 2 परिसर के लिए 0.4%)।

केवल तेजी से पतला नमूना में इन परिसरों की उपस्थिति विचार है कि वे कम सांद्रता पर अलग करने के लिए करते हैं, एक दर है कि तेजी से एक मैनुअल कमजोर पड़ने की प्रक्रिया के सापेक्ष है, लेकिन तेजी से कमजोर पड़ने की प्रक्रिया के सापेक्ष धीमी गति से microfluidics प्रणाली15 के साथ हासिल के अनुरूप है.

Figure 1
चित्रा 1: मास फोटोमेट्री के साथ माइक्रोफ्लुइडिक्स का संयोजन। (ए, बी) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स बॉक्स, जैसा कि (ए) सामने और (बी) शीर्ष से देखा गया है। सफाई समाधान 1-3 की स्थिति में रखे जाते हैं, और नमूने और अंशांकन 4-6 की स्थिति में होते हैं। सभी समाधान एम-स्विच से जुड़े हैं, जो "स्मॉल" फ्लो यूनिट सेंसर से जुड़ा है। (सी) पूरे सिस्टम का अवलोकन। कंप्यूटर (ऊपर बाएं) माइक्रोफ्लुइडिक्स बॉक्स (बफर और नमूना ट्यूबों के निकट दिखाया गया है) और द्रव्यमान फोटोमीटर (नीचे दाएं) से जुड़ा है, जहां माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप स्थित है। छोटे प्रवाह दर मॉनिटर (FRMS) नमूना लाइन के माध्यम से प्रवाह पर नज़र रखता है, जबकि बड़े प्रवाह दर मॉनिटर (FRML) बफर प्रवाह पर नज़र रखता है. नमूना और बफर लाइन टयूबिंग माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप पर एक चैनल से जुड़ते हैं, जिसे बड़े पैमाने पर फोटोमीटर के अंदर रखा जाता है। (D) प्रत्येक चिप में तीन चैनल होते हैं। FRMS नमूना इनलेट और FRML बफर इनलेट से जुड़ा है। मिक्सर क्षेत्र वह जगह है जहां तेजी से नमूना कमजोर पड़ने लगता है, जबकि अवलोकन क्षेत्र वह जगह है जहां बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री माप किया जाता है। आउटलेट की निगरानी एक अतिरिक्त प्रवाह संवेदक द्वारा की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चिप में कोई लीक नहीं है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोफ्लुइडिक्स नियंत्रण सॉफ्टवेयर। इस सॉफ्टवेयर के साथ, प्रवाह दर, माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम की दबाव रेखाओं और मल्टी-स्विच (एम-स्विच) की स्थिति को सेट और मॉनिटर करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: तेल में बुलबुले की उपस्थिति की पहचान करना। डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के उदाहरण एक स्पष्ट, अखंड फोकस रिंग (बाएं) और एक 'टूटी हुई' अंगूठी दिखाते हैं, जो विसर्जन तेल (दाएं) में हवा के बुलबुले की उपस्थिति का संकेत देता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नमूना सांद्रता के प्रतिनिधि उदाहरण जहां अणु लैंडिंग घटनाओं की संख्या बहुत कम, आदर्श या बहुत अधिक है। माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप में अवलोकन क्षेत्र की सतह पर उतरने वाले अणु द्रव्यमान फोटोमेट्री छवि के अनुपातमितीय दृश्य में काले धब्बे के रूप में दिखाई देंगे। बेहतर रूप से, वांछित एकाग्रता को डेटा अधिग्रहण (मध्य) के दौरान लैंडिंग घटनाओं का एक आदर्श घनत्व सक्षम करना चाहिए। यदि लैंडिंग घटना घनत्व बहुत कम है (शीर्ष, 'बहुत कम'), तो बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री डेटा का सटीक सांख्यिकीय विश्लेषण पूरा नहीं किया जा सकता है। यदि यह बहुत अधिक है (नीचे, 'बहुत अधिक'), तो लैंडिंग अणु स्थानिक रूप से ओवरलैप करेंगे, जिसके परिणामस्वरूप खराब डेटा गुणवत्ता होगी। इन छवियों को एक बड़े पैमाने पर फोटोमीटर का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ कैप्चर किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक स्क्रीन कैप्चर। यहां, डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से निर्यात की गई .mp फ़ाइलों को डेटा का विश्लेषण करने के लिए लोड किया जा सकता है। संसाधित डेटा से आंकड़े उत्पन्न किए जा सकते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: इस प्रयोग के लिए बड़े पैमाने पर विपरीत अंशांकन का एक स्क्रीन कैप्चर. इस्तेमाल किया गया कैलिब्रेंट β-एमाइलेज था, जिसे तीन प्रजातियों के रूप में जाना जाता है: मोनोमर (56 केडीए), डिमर (112 केडीए), और टेट्रामर (224 केडीए)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: मास हिस्टोग्राम तेजी से नमूना कमजोर पड़ने के बाद ही जटिल गठन प्रकट करते हैं। मास हिस्टोग्राम और इसी सबसे अच्छा फिट गाऊसी वितरण मैनुअल कमजोर पड़ने (नारंगी) या microfluidicsHC प्रणाली (नीला) के माध्यम से तेजी से कमजोर पड़ने के बाद IgG और FcRn युक्त नमूनों के माप के लिए दिखाया गया है. द्रव्यमान लेबल इंगित करते हैं कि गाऊसी घटता से औसत मूल्य तेजी से कमजोर पड़ने के बाद मापा द्रव्यमान हिस्टोग्राम फिट होते हैं। मैनुअल कमजोर पड़ने के बाद, FcRn मोनोमर्स (52 केडीए, मैनुअल कमजोर पड़ने के साथ मापा जाता है) और आईजीजी मोनोमर्स (152 केडीए) के अनुरूप चोटियों को देखा गया। तेजी से कमजोर पड़ने के बाद, FcRn और IgG मोनोमर्स के अलावा, 1: 1 और 1: 2 स्टोइकोमेट्री के साथ FcRn डिमर और IgG-FcRn परिसरों के अनुरूप चोटियों को भी स्पष्ट रूप से देखा गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक डेटा चित्रा 1: तेजी से कमजोर पड़ने के बाद नियंत्रण नमूनों के मास फोटोमेट्री माप कोई प्रोटीन गिरावट दिखाते हैं। (ए) मास हिस्टोग्राम और एफसीआरएन-केवल नमूने के लिए सबसे अच्छा फिट गाऊसी वितरण। तेजी से कमजोर पड़ने से पहले प्रारंभिक नमूना एकाग्रता 20 माइक्रोन थी, और प्रवाह दर 0.5 माइक्रोन / मिनट पर सेट की गई थी। FcRn मोनोमर्स (53 kDa) और FcRn डिमर्स (97 kDa) के अनुरूप द्रव्यमान चोटियों को देखा जा सकता है। (बी) आईजीजी (हर्सेप्टिन) के लिए मास हिस्टोग्राम और सबसे उपयुक्त गाऊसी वितरण केवल नमूना। तेजी से कमजोर पड़ने से पहले प्रारंभिक नमूना एकाग्रता 2 माइक्रोन थी, और प्रवाह दर 1 माइक्रोन/मिनट पर सेट की गई थी। आईजीजी मोनोमर (155 केडीए) के अनुरूप एक एकल द्रव्यमान शिखर देखा जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित का पता लगाने और कम आत्मीयता प्रोटीन प्रोटीन बातचीत यों यों के लिए एक विधि प्रदान करता है. यह एक बड़े पैमाने पर फोटोमीटर का उपयोग करता है जो एक तेजी से कमजोर पड़ने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम से जुड़ा होता है। मास फोटोमेट्री एक लेबल-मुक्त, जैव-विश्लेषणात्मक उपकरण है जो 30 केडीए से 6 एमडीए की सीमा के भीतर उन लोगों के लिए बायोमोलेक्यूल्स16 के समाधान में आणविक द्रव्यमान को मज़बूती से माप सकता है। चूंकि मास फोटोमेट्री एक एकल-अणु तकनीक है जो एक-एक करके नमूनों का विश्लेषण करती है, यह आम तौर पर 100 पीएम-100 एनएम एकाग्रता सीमा में नमूनों तक सीमित होती है। इस सीमा से ऊपर, कांच की सतह पर उतरने वाले अणु स्थानिक रूप से ओवरलैप करेंगे, जिसके परिणामस्वरूप खराब डेटा गुणवत्ता होगी; इस सीमा के नीचे, मजबूत विश्लेषण करने के लिए बहुत कम डेटा प्राप्त किया जाताहै 7. एक महत्वपूर्ण परिणाम यह है कि यह प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच को उन लोगों तक सीमित कर सकता है जो उस सीमा के भीतर बाध्य और अनबाउंड प्रजातियों का मिश्रण बनाते हैं।

यहां, हमने बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री के लिए उत्तरदायी नमूना सांद्रता की सीमा को प्रभावी ढंग से विस्तारित करने के लिए तेजी से कमजोर पड़ने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल विस्तृत किया है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर नमूना पतला करके और फिर इसे 50 एमएस के भीतर डिटेक्टर अवलोकन खिड़की में प्रवाहित करके, सिस्टम इंटरैक्शन संतुलन शिफ्ट होने से पहले undiluted नमूने में मौजूद परिसरों को पकड़ लेता है। नमूना लगातार व्यक्तिगत माप के दौरान डिटेक्टर को दिया जाता है। इन शर्तों के तहत, नमूना मापा जाता है जब परिसर का 95% बरकरार रहेगा, यहां तक कि कम आत्मीयता बातचीत के लिए - माइक्रोमोलर के आदेश पर एक केडी के साथ और पृथक्करण दर 1 एस -1 के रूप में तेजी से।

इसकी गणना निम्नानुसार की जा सकती है: आगे की दर kfऔर पश्चगामी दर kb के साथ प्रतिक्रिया Equation 1 के लिए,

Equation 2

संतुलन पर, सभी तीन प्रजातियों (ए, बी, और जटिल एबी) की सांद्रता स्थिर रहती है, इसलिए Equation 3 और Equation 4। रूढ़िवादी धारणा के तहत कि गड़बड़ी (कमजोर पड़ने, इस मामले में) जटिल को अलग करने का कारण बन सकती है, लेकिन आगे (एसोसिएशन) प्रतिक्रिया आगे नहीं बढ़ती है, शब्द केएफ [ए] [बी] को नगण्य माना जा सकता है, और निम्नलिखित सरलीकरण किया जा सकता है:

Equation 6

एकीकरण संतुलन के गड़बड़ी के बाद समय पर जटिल की एकाग्रता के लिए निम्नलिखित अभिव्यक्ति देता है:

Equation 7

संकुल का वह अंश जो साम्यावस्था के विक्षोभ के बाद समय t पर आबद्ध रहता है, इस प्रकार है:

Equation 8

= 50 एमएस पर, केबी≈ 1 एस-1 के साथ प्रतिक्रिया के लिए, अंश बाध्य 0.95, या 95%11,12 है।

मास फोटोमेट्री का उपयोग यहां और पहले5 में किया गया था ताकि IgG मोनोक्लोनल एंटीबॉडी trastuzumab को FcRN के घुलनशील डोमेन में बांधने की जांच की जा सके। दो बाध्यकारी भागीदारों अम्लीय पीएच17 पर nanomolar आत्मीयता के साथ बाँध करने के लिए सूचित किया गया है. मास फोटोमेट्री का उपयोग गुणात्मक रूप से गठित परिसरों की प्रचुरता का आकलन करने के लिए किया गया था, जबकि बाध्यकारी साझेदार पीएच 5.0 पर थे, और नमूनों को एक अतिरिक्त माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली के माध्यम से तेजी से पतला किया गया था। प्रक्रिया पहले से रिपोर्ट किए गए परिणामों के आधार पर विशेष प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत के लिए अनुकूलित किया गया था5. एक ही प्रक्रिया अन्य बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते उपयोगकर्ताओं को पूर्व ज्ञान है या इस तरह के बफर का उपयोग करने के लिए जो बफर, प्रारंभिक प्रोटीन एकाग्रता, अपेक्षित stoichiometry, और इनक्यूबेशन की राशि के लिए आवश्यक है एक संतुलन तक पहुँचने के लिए बातचीत की अनुमति देने के लिए की जरूरत है.

जब आईजीजी-एफसीआरएन मिश्रण को मैन्युअल रूप से पतला किया गया था, तो आईजीजी-एफसीआरएन परिसरों की उपस्थिति का पता लगाना मुश्किल था, भले ही इन प्रोटीनों को5 बातचीत करने के लिए जाना जाता है। इस पत्र से पता चलता है कि तेजी से कमजोर पड़ने के दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप इन परिसरों की उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई है। एक ही नमूने के लिए, जब तेजी से कमजोर पड़ने का उपयोग किया गया था, 1: 1 FcRn-IgG परिसरों और 2: 1 FcRn-IgG परिसरों दोनों को स्पष्ट रूप से देखा गया था। जटिल गठन में ये अंतर सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन सिस्टम का अध्ययन करने के महत्व को प्रदर्शित करते हैं।

इसके अतिरिक्त, इन परिणामों से यह भी पता चलता है कि कमजोर इंटरैक्शन को पकड़ने के लिए एकल-अणु विश्लेषण के साथ माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करना सीधा है - विधि में एक महत्वपूर्ण अंतर को भरना। बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री के साथ तेजी से कमजोर पड़ने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स का संयोजन एक विश्लेषणात्मक तकनीक के रूप में बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री के फायदों के कारण आकर्षक लाभ प्रदान करता है। यही है, बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री को लेबल की आवश्यकता नहीं होती है, इसमें न्यूनतम नमूना तैयार करना शामिल होता है, और माप समाधान में किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री का एक और महत्वपूर्ण लाभ यह है कि सभी प्रजातियों को अलग करने और मात्रा निर्धारित करने की क्षमता है (बशर्ते उनके पास >30 केडीए का एक अलग द्रव्यमान हो)। यह एसपीआर के विपरीत है, उदाहरण के लिए, जो बाध्यकारी और अनबाइंडिंग की दरों को माप सकता है लेकिन आसानी से स्टोइकोमेट्री जानकारी 8 प्रदान नहीं कर सकताहै।

इस प्रोटोकॉल के लिए, साथ ही बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री प्रयोगों अधिक आम तौर पर, कई विचार सहायक होते हैं. सबसे पहले, अंतिम प्रोटीन एकाग्रता उस सीमा के भीतर होनी चाहिए जो द्रव्यमान फोटोमेट्री माप सकती है (100 पीएम-100 एनएम)। प्रारंभिक इनक्यूबेशन एकाग्रता भी माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम (90 माइक्रोन तक) की सीमा के भीतर होनी चाहिए और बातचीत10 के वास्तविककेडी से ऊपर होने के लिए सिद्धांतित होना चाहिए। अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु माइक्रोन एकाग्रता पर बातचीत करने वाली प्रजातियों के बीच 1: 1 एकाग्रता मिश्रण अनुपात है। अनुपात तब 1: 2, 1: 5, या, इस बातचीत के मामले में, 1:10 के लिए भिन्न हो सकता है। यदि प्रोटीन इंटरैक्शन के बारे में कोई पिछली जानकारी नहीं है, तो उपयोगकर्ता को प्रयोग का अनुकूलन करना होगा, प्रत्येक साथी के लिए उच्च एकाग्रता (अनुशंसित 20 माइक्रोन) से शुरू करके यह निर्धारित करने के लिए कि घटकों की आत्मीयता एकाग्रता सीमा के भीतर है प्रस्तुत विधि द्वारा निरंतर (यानी, परिसरों का गठन किया जाता है)। अनुकूलन भी बातचीत या सही मिश्रण अनुपात निर्धारित करने के लिए बातचीत घटकों में से एक के अनुमापन को बढ़ावा देने के लिए अन्य बफर शर्तों को चुनने शामिल हो सकते हैं. एक बार जब ये निर्धारित हो जाते हैं, तो अध्ययन और विधि के लिए इष्टतम स्थितियों की अनुमति देने के लिए सांद्रता और प्रवाह को अनुकूलित करना संभव है, उदाहरण के लिए, बेहतर शिखर संकल्प की अनुमति देने के लिए सांद्रता को कम करना।

दूसरे, इस प्रयोग को सफलतापूर्वक दोहराने के लिए, अशुद्धियों को कम से कम किया जाना चाहिए। अशुद्धियों के सामान्य स्रोत जो बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री माप पर प्रतिकूल प्रभाव डालने के लिए जाने जाते हैं, उनमें अन्य प्रोटीन या सेलुलर मलबे शामिल हैं जो शुद्धिकरण के बाद रहते हैं, अनफ़िल्टर्ड बफ़र्स, मिसेल बनाने वाले डिटर्जेंट (यदि बहुत अधिक एकाग्रता में मौजूद हैं), और नमक, ग्लिसरॉल या अन्य घटकों की उच्च सांद्रता वाले बफ़र। जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल में चर्चा की गई है, माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम में बुलबुले को हटा दिया जाना चाहिए। बुलबुले टयूबिंग सिस्टम में बन सकते हैं या यदि नमूनों में उच्च सतह तनाव होता है और फोम गठन के लिए प्रवण होते हैं। बुलबुले भी विसर्जन तेल है, जो फोकस अंगूठी (चित्रा 3) से पता लगाया जा सकता है में फार्म कर सकते हैं. यदि बुलबुले प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का उपयोग कर हटाया नहीं जा सकता है, एक और समाधान एक desiccator और एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर नमूना degas कुछ मिनट के लिए कम दबाव के तहत नमूना छोड़ने के लिए है. भंवर या मिलाते हुए अत्यधिक केंद्रित प्रोटीन समाधान इन कार्यों बुलबुला गठन को बढ़ावा देने के रूप में अनुशंसित नहीं है.

जबकि एक विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का माप यहां प्रदर्शित किया गया है, उसी प्रोटोकॉल को महत्वपूर्ण संशोधन के बिना अन्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन सिस्टम पर लागू किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का एक और भविष्य दिशा की पहचान परिसरों के लिए कश्मीरडी मूल्यों की गणना करने के लिए माप का उपयोग करने के लिए किया जाएगा, के रूप में बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री 5,7 के संदर्भ में कहीं और वर्णित किया गया है. जबकि पूर्व अध्ययनों ने मैनुअल कमजोर पड़ने और मजबूत बातचीत से जुड़े प्रयोगों से डेटा का उपयोग किया था, विश्लेषण सिद्धांत को इस संदर्भ में आसानी से लागू किया जा सकता है - बशर्ते माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में और सुधार लागू किए गए हों (जैसे प्रवाह संवेदक सटीकता और पंप स्थिरता में वृद्धि)।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन से परे, संयुक्त द्रव्यमान फोटोमेट्री और तेजी से कमजोर पड़ने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स दृष्टिकोण के लिए व्यापक अनुप्रयोग होने की संभावना है। मास फोटोमेट्री नमूना शुद्धता, एकत्रीकरण, और18,19 समरूपता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; अध्ययन प्रोटीन oligomerization20, macromolecular विधानसभा21 या पोलीमराइजेशन22; और अन्य क्षेत्रों में। मास फोटोमेट्री विश्लेषण भी प्रोटीन से परे फैली हुई है; इसका उपयोग न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन23, वायरल कणों24 और नैनोकणों25 के बीच बातचीत की जांच के लिए किया गया है। इस प्रकार यह प्रोटोकॉल एक संयुक्त द्रव्यमान फोटोमेट्री माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रणाली के एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग का वर्णन करता है - यह व्यक्तिगत अणुओं और परिसरों के स्तर पर कमजोर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रत्यक्ष माप को सक्षम बनाता है। वर्तमान आवेदन का मूल्य अधिक है, क्योंकि यह सीधे तौर पर उन इंटरैक्शन को चिह्नित करने की संभावना को खोलता है जो आम तौर पर अध्ययन करना मुश्किल है - महत्वपूर्ण चिकित्सीय क्षेत्रों में प्रासंगिकता के साथ। यह संयुक्त दृष्टिकोण दसियों माइक्रोमोलर तक सांद्रता वाले नमूनों के लिए जांच की एक विस्तृत श्रृंखला के आधार के रूप में भी काम कर सकता है।

Disclosures

Myndert Claasen, और Zornitsa Kofinova Refeyn Ltd के कर्मचारी हैं, जो इस लेख में उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान फोटोमीटर और माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम का उत्पादन करता है। वेस्टन स्ट्रूवे रेफेन लिमिटेड के शेयरधारक और सलाहकार हैं।

Acknowledgments

डब्ल्यूएस को यूकेआरआई फ्यूचर लीडर्स फैलोशिप [MR/V02213X/1] द्वारा समर्थित किया जाता है। पांडुलिपि पाठ और ग्राफिक्स रेफेन की वैज्ञानिक संचार टीम (पनागियोटा पगानोपोलौ, न्यूस टोरेस तामारिट और कैथरीन लिचटेन) के सदस्यों के समर्थन से तैयार किए गए थे। हम केमिली हेटेज़, सोफिया फरेरा और मैथियास लैंगहॉर्स्ट से मूल्यवान प्रतिक्रिया भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol (Isopropanol) VWR International LLC 20880.320
Data acquisition software Refeyn AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software Refeyn DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag Sigma SRP0624
Herceptin (IgG)  Cambridge Bioscience HY-P9907-1mg
Mass photometer Refeyn TwoMP
Microfluidics box Refeyn MassFluidix HC system
Microfluidics chip Refeyn MassFluidix HC chip
Microfluidics control software Fluigent OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure VWR International LLC K812
Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma S2770
β-Amylase, from sweet potato Sigma A8781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
  2. Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  3. Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).
  4. Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
  5. Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
  6. Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).
  7. Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
  8. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  9. Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  10. Refeyn Ltd. MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. , https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023).
  11. Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  12. Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264 (2020).
  13. Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).
  14. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation. , https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022).
  15. Lai, S. -H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211 (2021).
  16. Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
  17. Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
  18. Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).
  19. Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
  20. Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
  21. Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
  22. Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).
  23. Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521 (2021).
  24. Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
  25. Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

Tags

इस महीने JoVE अंक 203 माइक्रोफ्लुइडिक मास फोटोमेट्री कम-आत्मीयता प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन आईजीजी एंटीबॉडी नवजात एफसी रिसेप्टर
मास फोटोमेट्री के साथ माइक्रोफ्लुइडिक्स को युग्मित करके माइक्रोमोलर सांद्रता में प्रोटीन कॉम्प्लेक्स गठन का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino,… More

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino, M., Struwe, W. B. Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry. J. Vis. Exp. (203), e65772, doi:10.3791/65772 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter