Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analys av proteinkomplexbildning vid mikromolära koncentrationer genom att koppla mikrofluidik med massfotometri

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65772
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4
1Refeyn Ltd., 2Adaptix Ltd., 3Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, University of Oxford, 4The Kavli Institute for Nanoscience Discovery, University of Oxford

Summary

Detta protokoll kombinerar massfotometri med ett nytt mikrofluidiksystem för att undersöka protein-proteininteraktioner med låg affinitet. Detta tillvägagångssätt är baserat på snabb utspädning av högkoncentrerade komplex i lösning, vilket möjliggör mätningar med låg affinitet och breddar användbarheten av massfotometri.

Abstract

Massfotometri är en mångsidig massmätningsteknik som gör det möjligt att studera biomolekylära interaktioner och komplex bildning i lösning utan etiketter. Massfotometri är i allmänhet lämpad för att analysera prover i koncentrationsområdet 100 pM-100 nM. I många biologiska system är det dock nödvändigt att mäta mer koncentrerade prover för att studera lågaffinitet eller transienta interaktioner. Här demonstrerar vi en metod som effektivt utökar intervallet av provkoncentrationer som kan analyseras med massfotometri från nanomolar till tiotals mikromolar.

I detta protokoll kombineras massfotometri med ett nytt mikrofluidiksystem för att undersöka bildandet av proteinkomplex i lösning i det mikromolära koncentrationsområdet. Med mikrofluidiksystemet kan användare hålla ett prov vid en önskad högre koncentration följt av utspädning till det nanomolära området - flera millisekunder före massfotometrimätningen. På grund av utspädningshastigheten erhålls data innan provets jämvikt har förskjutits (dvs. komplexet dissocierar).

Tekniken används för att mäta interaktioner mellan en immunglobulin G (IgG) antikropp och den neonatala Fc-receptorn, vilket visar bildandet av högordningskomplex som inte var kvantifierbara med statiska massfotometrimätningar.

Sammanfattningsvis gör kombinationen av massfotometri och mikrofluidik det möjligt att karakterisera prover i det mikromolära koncentrationsområdet och är skicklig på att mäta biomolekylära interaktioner med svagare affiniteter. Dessa förmågor kan tillämpas i en rad olika sammanhang - inklusive utveckling och design av bioterapier - vilket möjliggör grundlig karakterisering av olika protein-proteininteraktioner.

Introduction

Protein-proteininteraktioner understryker de flesta cellulära funktioner, från immunreglering till DNA-replikation och translation. Som ett resultat av detta finns det ett grundläggande behov inom livsvetenskaperna att undersöka ett brett spektrum av interaktioner mellan olika heterogena komplex som ofta bildas. Deras detektering, karakterisering och kvantifiering är dock ofta utmanande, särskilt för interaktioner med låg affinitet1.

Immunoprecipitationsanalyser används ofta för att detektera interaktioner med hög affinitet, men för interaktioner med låg affinitet och transienta interaktioner är detektion i stort sett ogenomförbar2. Fluorescenstekniker kan också användas men kräver potentiellt störande tillsats av fluorescerande etiketter2. Cryo-EM kan ge en strukturell ögonblicksbild och en ensembleavläsning av de proteinkomplex som bildats med hög rumslig upplösning, men kräver också vanligtvis att man arbetar med koncentrationer som är för låga för avbildning av interaktioner med låg affinitet. Cryo-EM medför också utmaningar relaterade till kostnad, tillgänglighet, provberedning och analystid3.

Dessutom har ytplasmonresonans (SPR) blivit ett populärt sätt att kvantifiera protein-proteininteraktioner, även om det kräver proteinimmobilisering, vilket kan påverka bindningsjämvikten och resultera i variabla on-hastigheter, vilket minskar mätnoggrannheten 4,5. Det involverar också flera analyssteg före datainsamling och analys6.

Massfotometri är en teknik med en enda molekyl som har använts för att analysera protein-proteininteraktioner 5,6,7. Det fungerar genom att mäta massan av enskilda molekyler eller komplex baserat på ljuset de sprider när de landar på ytan av ett glastäcke8. Massfotometrimätningar har använts för att kvantifiera bindningsaffiniteter från den relativa förekomsten av bindningspartners och de komplex de bildar5. I likhet med andra metoder med en enda molekyl bör dock koncentrationen i det prov som ska mätas vanligtvis vara mindre än 100 nM. Om koncentrationen är högre kommer molekylerna som landar på glasytan att överlappa varandra rumsligt, vilket resulterar i dålig datakvalitet7. Följaktligen kan svagare interaktioner (KD ~mikromolarer), som dissocierar vid dessa lägre koncentrationer, inte mätas på ett tillförlitligt sätt eftersom det inte är möjligt att observera den nödvändiga blandningen av obundna och bundna arter5.

Här beskriver vi ett tillvägagångssätt som övervinner denna begränsning baserat på en ny kopplad mikrofluidik-massfotometrienhet. Specifikt används ett mikrofluidiksystem i kombination med massfotometern för att effektivt utöka utbudet av interaktioner som kan kvantifieras med massfotometri. Mikrofluidik har visat sig erbjuda en rad möjligheter för att undersöka protein-proteininteraktioner, inklusive snabb utspädning för att upptäcka svaga interaktioner 1,9. Systemet som beskrivs här fungerar genom att snabbt späda ut provet upp till 10 000 gånger på ett mikrofluidiskt chip och omedelbart flöda det över chipets observationsområde, vilket gör det möjligt för massfotometrimätningen att starta inom 50 ms från det att molekylerna påbörjade utspädningsprocessen10. Utspädningen sker när provet och bufferten kombineras i en omvänd Tesla-ventilblandare på chipet, där de relativa flödeshastigheterna för de två lösningarna bestämmer hur mycket utspädning som sker (se protokollsteg 8). Flödeshastigheten kan styras med programvaran för mikrofluidisk styrning. Att ändra flödeshastigheten kan ändra den relativa populationen av arten eftersom det kan påverka antalet landningshändelser på glasets yta, vilket är det som mäts av massfotometern.

Processens hastighet är tillräckligt snabb för att mätningen ska hinna slutföras innan interaktionens integritet har störts (för mer information, se även diskussionen). Detta kan förstås genom en kort titt på teorin om första ordningens reaktioner, där Equation 1. Den framåtriktade (associations-) hastighetskonstanten är kf, den bakåtriktade (dissociation) hastighetskonstanten är kb och jämviktsdissociationskonstanten (KD) definieras som

KD= kb/ kf

För proteinbindning begränsas kfi allmänhet av reaktanternas diffusion11 och är därför begränsad till intervallet 106-10 7 M-1·s-1. Eftersom intervallet för är begränsat kommer en reaktion med låg affinitet (KD~mikromolarer) att ha kb≈ 1 s-1. Det vill säga, kb= kf · KD= (106 M-1·s-1) (10-6 M) = 1 s-1, med komplexets halveringstid runt 0,7 s11,12.

Vårt exempelsystem är bindningen av den monoklonala IgG-antikroppen trastuzumab till den lösliga domänen av den neonatala Fc-receptorn IgG (FcRn), som är kända interagerande partners13. Tidigare publicerade data erhållna med enbart konventionell massfotometri (dvs. med manuell utspädning av prover) visade att proteinerna bildar flera arter. FcRn-monomerer, FcRn-dimerer och obundet IgG var tydligt synliga, medan IgG-FcRn-komplex (vid förhållandena 1:1 och 1:2) också detekterades (vid pH 5,0) men endast med mycket låg förekomst5. Denna observation föranleder frågan om huruvida bildning av IgG-FcRn-komplex kan detekteras tydligare om det mäts vid en högre koncentration. Kombinationen av massfotometri med en kopplad metod för snabb utspädning som beskrivs här gav mer robusta bevis för komplex bildning genom en ökning av deras uppmätta partiklar.

Massfotometri- och mikrofluidikprotokollet som beskrivs här gör det möjligt att karakterisera bildandet av komplex med en KD upp till mikromolområdet. En empirisk bestämning av KD kommer att kräva ytterligare förbättringar av flödessensorns noggrannhet, pumpstabilitet, chip-till-chip-variationer och mätplats inuti observationsfönstret, eftersom alla dessa faktorer skulle påverka tiden från det att provet späds ut till att det mäts.

Samma tillvägagångssätt kan användas för att undersöka bindningen mellan alla lösliga proteiner, förutsatt att de har distinkta molekylvikter (separerade med minst 25 kDa) som faller inom det intervall som är lämpligt för analys med en massfotometer (30 kDa till 6 MDa). De erhållna insikterna kan vara till hjälp för studier i en rad olika sammanhang - från att få en mekanistisk förståelse av cellulära funktioner till design av nya bioterapeutiska läkemedel.

Protocol

1. Förbereda instrumenten och starta programvaran

  1. Slå på massfotometern och låt den vara på i minst 1 timme innan du påbörjar några mätningar.
    OBS: Detta beror på att instrumentet måste nå en konstant temperatur. Att inte lämna massfotometern på i 1 timme kan leda till en massförskjutning och därmed felaktiga resultat.
  2. Slå på antivibrationstabellen genom att slå på strömmen och trycka på isoleringsknappen (under massfotometern). Vibrationer begränsar prestandan hos massfotometriinstrumentet, så antivibrationstabellen är viktig för att säkerställa maximal instrumentkänslighet. Slå på mikrofluidikboxen.
  3. Starta programvaran för datainsamling och programvaran för mikrofluidikkontroll. Slå på luftkompressorn.

2. Förberedelse av proteinprover, buffert och rengöringslösningar

  1. Tillsätt 200 ml PBS-buffert (pH 7,4) till en ren 200 ml flaska och 200 ml PBS-buffert (pH 5,0) till en andra 200 ml-flaska.
    OBS: 200 ml-flaskorna måste anslutas till "L" flödesenhetssensorn i nästa steg. Använd pH 7.4 PBS-buffert för kalibreringsmätningen och pH 5.0 PBS-buffert för provmätningen.
  2. Blanda IgG (2 μM) och FcRn (20 μM) i ett 0,5 ml centrifugrör i förhållandet 1:10 för en total volym på 60 μL.
    1. Lagerlösningarna för FcRn och IgG är 91,9 μM respektive 13,5 μM. Förbered reaktionen genom att blanda 9 μl stam IgG + 13 μl stam FcRn + 38 μl PBS (pH 5,0, rumstemperatur [RT]) i ett centrifugrör för en total volym på 60 μL. De slutliga koncentrationerna för de två reaktanterna var 2 μM för IgG och 20 μM för FcRn. Håll alla proteinlager på is under hela denna process.
  3. I ett annat 0,5 ml centrifugrör, dispensera 20 μL av β-amylashaskalet vid 20 μM koncentration.
    1. Som ett exempel, för att bereda β-amylaskalibrator som används här, följ proceduren som beskrivs i 2.3.1.1-2.3.1.2.
      1. Åter blanda 20 mg β-amylaspulver i injektionsflaskan i 3,57 ml PBS (5 % glycerol), motsvarande 5,6 mg/ml och en molkoncentration på 100 μM (eftersom molekylvikten är 56 kDa).
      2. För att späda till 20 μM, kombinera 200 μl av 100 μM stam med 800 μl PBS (pH 7,4, RT) i ett 1 ml centrifugrör.
  4. Inkubera proverna vid RT i minst 30 minuter.
    OBS: Börja förbereda provet och calibrant utspädningar efter att du har slagit på massfotometern. För detta experiment inkuberades proverna i 120 minuter.
  5. I tre 50 ml centrifugrör, alikvot: 50 ml PBS (pH 7,4) - rengöringslösning 1 (CS1), 50 ml 0,5 M NaOH - rengöringslösning 2 (CS2) och 50 ml 100 % IPA - rengöringslösning 3 (CS3).

3. Experimentell uppställning

  1. För att ladda sample och calibrant, placera calibrant centrifugröret vid position 4 och sample centrifugröret vid position 5 på mikrofluidikboxen (Figur 1).
  2. För att ladda rengöringslösningarna, placera CS1, CS2 och CS3 på positionerna 1, 2 och 3 i mikrofluidikboxen (Figur 1).
    OBS: Sample, calibrant och rengöringslösningar är anslutna till multibrytaren (m-switch). M-omkopplaren är ansluten till flödesenhetens sensor "S".
  3. Skruva fast locket som ansluts till buffertledningen på 200 ml (pH 7.4) buffertflaskan.
    OBS: Buffertledningen är ansluten till en avstängningsventil, som är ansluten till flödesenhetens sensor "L". Avstängningsventilen förhindrar eventuella sifoneffekter som kan uppstå när buffertflödet stoppas. Sifonering kan leda till kontaminering av bufferten från den utspädda kvarvarande vätskan som återvänder till buffertbehållaren.
  4. Placera mikrofluidikchipet på en förberedelseplatta.
    Skjut in den andra röränden av "S"-flödesenhetens sensor in i "Sample inlopp" på den första kanalen i mikrofluidikchipet (Figur 1). Provraden är klar.
  5. Skjut in den andra röränden av "L"-flödesenhetssensorn in i "buffertinloppet" på den första kanalen i mikrofluidikchipet (figur 1). Buffertlinjen är klar.
  6. För att samla upp utflödet, tryck ett rör till "utloppet" på den första kanalen i mikrofluidikchipet; Placera den andra änden så att den rinner ut i en återvinningsbar kolv eller bägare (figur 1).

4. Grunda prov- och buffertledningarna med buffert

  1. Öppna den manuella avstängningsventilen på buffertledningen.
  2. I mikrofluidikens styrprogramvara, ställ in buffertledningens flödeshastighet till 1000 μL/min och se till att buffertledningens tryck inte överstiger 110 mbar (Figur 2). Flödet startar automatiskt i buffertlinjen (Figur 1).
    OBS: Om trycket i buffertledningen överstiger 110 mbar kan det bero på att luft passerar genom flödessensorn. Om trycket inte återgår till det normala inom några sekunder kan det finnas en blockering (vanligtvis på grund av klämda slangar vid anslutningarna). Stoppa i så fall flödet och kontrollera anslutningarna i buffertledningen, börja vid avstängningsventilen.
  3. I mikrofluidikens styrprogramvara, välj läge 1 på m-omkopplaren (motsvarande PBS-bufferten), ställ sedan in sample ledningens flödeshastighet till 8 μL/min och se till att sample ledningstrycket inte överstiger 350 mbar. Flödet startar automatiskt i sample rad (Figur 1).
  4. Använd en pipettspets (eller annan mjuk plastkomponent) för att applicera försiktigt tryck ovanifrån nära bubblan/bubblorna som är instängda i chipet för att få bort luftbubblor och se till att de avlägsnas genom utloppet.
    OBS: Se till att ta bort alla bubblor i sektionerna "mixer" och "observationsområde" (Figur 1) på kanalen som används. Var noga med att inte trycka för hårt, eftersom det kan skada chipet.

5. Placera mikrofluidikchipet på massfotometern och hitta fokus

  1. Applicera en droppe nedsänkningsolja i mikroskop på massfotometerns objektiv.
  2. Placera mikrofluidikchipet på hållaren för massfotometern med "Sample Inlet" vänd uppåt och håll den fäst vid stage clamps (Figur 1). Se till att alla slanganslutningar förblir fastsatta.
  3. Använd datainsamlingsprogramvaran, flytta stage för att säkerställa att "observationsområdet" på kanal 1 är i linje med målet (Figur 1).
  4. Stäng massfotometerns lock och tryck på alternativet Droplet-Dilution Find Focus i datainsamlingsprogrammet.
  5. Kontrollera den vita fokusringen i det nedre vänstra hörnet av datainsamlingsprogrammet (bild 3). Luckor i ringen indikerar närvaron av en luftbubbla i nedsänkningsoljan; Ta bort detta genom att öka steghastigheten till max och försiktigt flytta steget i sidled.
  6. När fokuseringen är klar, vänta 2-3 minuter innan du tar den första inspelningen. Tryck sedan på Spela in för att spela in en 1 minuts mätning och se till (genom att observera mätningen) att inga föroreningar visas.
    OBS: Föroreningar kan finnas på glasytan eller i bufferten. Skärpevärdet i datainsamlingsprogramvaran bör vara över 4.5 %.

6. Kalibrering av massfotometri

  1. I programvaran för mikrofluidikstyrning ställer du m-omkopplaren i läge 4 (motsvarande kalibern) och ser till att provtagningsledningens flödeshastighet är inställd på 8 μL/min och att trycket i provledningen inte överstiger 350 mbar (figur 2).
    1. Kalibern kommer att påbörja flödet genom chipet. Vänta cirka 1,5-2,5 minuter (eller tills calibrant ses konsekvent på datainsamlingsprogramvaran). Tiden kan variera beroende på sample linjens rörlängd.
  2. När kalibern har setts konsekvent (dvs. antalet händelser är tillräckligt för en korrekt massfotometrimätning), i mikrofluidikens kontrollprogramvara, minska flödeshastigheten till 0,5 μL/min - målutspädningsnivån för detta experiment.
    OBS: Att börja med en högre flödeshastighet minskar helt enkelt den tid som krävs för att kalibern ska nå chipet.
  3. Se till att det inte är "för få" eller "för många" molekyler som landar på mätytan (Figur 4).
    1. Om densiteten för landningshändelsen inte är "idealisk" (figur 4) ändrar du flödeshastigheten i programvaran för mikrofluidikkontroll. Om händelsetätheten är för låg, öka provtagningsflödet tills väl separerade landningshändelser observeras (men överskrid inte 8 μL/min). Om den är för hög, minska provflödet (men gå inte under 0.1 μL/min).
    2. Om calibrant-volymen håller på att ta slut i provröret, ändra m-omkopplarens läge till PBS pH 7.4-linjen (position 1) för att undvika att luft injiceras.
  4. Tryck på Spela in och gör en 60 s mätning. Spara filen i en vald mapp.
    OBS: Datainsamlingsprogramvaran producerar filer med .mp som tillägg.

7. Rengöring av provledningen och stopp av flödet

  1. I programvaran för mikrofluidikstyrning växlar du till läge 2 på m-omkopplaren och ändrar provtrycket till 800 mbar (figur 2). Spola systemet med CS2 (NaOH) i 4 min.
  2. Ställ omkopplaren i läge 3 och spola systemet med CS3 (IPA) i 4 minuter.
  3. Växla till läge 1 på m-brytaren och spola systemet med CS1 (PBS) i 4 min.
  4. I mikrofluidikens styrprogramvara, stoppa allt flöde genom att ställa in provledningen och buffertledningstrycken till 0 och stäng av buffertventilen.
  5. Koppla bort chipset från stage och sätt tillbaka det på förberedelseplattan. Koppla bort alla slangar och placera provslangens ände i en avfallsflaska. Rengör objektivet med isopropanol och våtservetter.

8. Mätning av massfotometriprovet

  1. Skruva av locket som är anslutet till 200 ml (pH 7.4) buffertflaskan och skruva fast det på 200 ml (pH 5.0) buffertflaskan.
  2. Upprepa steg 3.4-5.6, men använd den andra kanalen på chipet istället för den första.
  3. I mikrofluidikens styrprogramvara, ställ m-omkopplaren till läge 5 (motsvarande provet), ställ in provledningens flödeshastighet till 8 μL/min och se till att provledningens tryck inte överstiger 350 mbar (figur 2).
  4. Upprepa steg 6.2-6.4 för att mäta sample.
    1. För att beräkna de flödeshastigheter som ska användas, se till att vikningsdifferensen i flödeshastigheten matchar den önskade utspädningsfaktorn för provet. Till exempel, för att uppnå utspädningen av 2000x här, skiljer sig flödeshastigheterna med en faktor 2000; buffertflödet är 1000 μL/min och provflödet är 0,5 μL/min. I slutet av ett experiment, lämna alltid linjerna rena genom att följa rengöringsprotokollet.

9. Analys av data

  1. När inhämtningen av data är klar startar du programvaran för dataanalys (figur 5).
  2. Klicka på plusikonen (+) längst upp till vänster och välj .mp calibrant-filen. Programvaran kommer att börja analysera den laddade filen. Beroende på storlek och antal mätningar kan detta ta några minuter
    1. Analysera inte .mp-filer i programvaran för dataanalys när du samlar in data med programvara för datainsamling eftersom det kan minska kvaliteten på de data som samlas in.
  3. Tryck på knappen Skapa masskalibrering (längst ner till höger). En dialogruta öppnas som visar en tabell fylld med kontrastvärdena för de monterade topparna.
  4. Ändra värdena till de kända massvärdena för de monterade topparna (för β-amylas är dessa värden 56 kDa, 112 kDa och 224 kDa) och tryck på Spara. Den nyskapade kalibreringsfilen (filändelsen .mc) kommer att visas på masskalibreringspanelen (längst ner till vänster i dataanalysprogrammet) (figur 6).
  5. Klicka på plusikonen (+) längst upp till vänster och välj .mp-exempelfilen.
  6. För att skapa ett masshistogram, som visas i figur 5, gå till fliken Analys , välj Histogramläge och alternativet Massdiagram . Justera fackets bredd, massgränser och andra parametrar efter behov.
  7. Anpassa diagrammet ytterligare på fliken Figurer om så önskas innan du exporterar siffror och/eller sparar hela arbetsytan som en .dmp fil.

Representative Results

Massfotometri användes för att mäta interaktionen mellan den monoklonala IgG-antikroppen trastuzumab och den lösliga domänen av den neonatala Fc-receptorn IgG (FcRn). En 1:10-blandning av de två proteinerna (vid 2 μM för IgG och 20 μM för FcRn) späddes manuellt till 10 nM respektive 20 nM i PBS.

Utspädningssteget är nödvändigt eftersom massfotometri, en teknik för mätning av enskilda molekyler, endast kan analysera prover i intervallet 100 pM-100 nM. Att försöka mäta prover med koncentrationer utanför detta intervall kan äventyra resultatens noggrannhet (figur 4). Detta experiment ingår inte i detta protokoll, eftersom det har beskrivits tidigare 5,6.

I masshistogrammen som produceras i ett massfotometriexperiment plottas styrkan på spridningssignalen (eller "kontrasten") för varje landningshändelse på x-axeln, och den omvandlas till molekylmassa via masskontrastkalibreringssteget. Samtidigt indikerar y-axeln antalet molekyler som räknas med en given massa (eller kontrast). Därför indikerar en topp närvaron av en population av molekyler inom det intervall av molekylvikter som visas på x-axeln. Antalet händelser (antal) som utgör toppen återspeglar storleken på den populationen.

Massfotometrimätningen med manuell utspädning resulterade i ett masshistogram där de två största topparna, baserat på proteinernas förväntade molekylvikter, motsvarade obundna FcRn-monomerer (~50 kDa) och IgG-antikroppsmonomerer (~150 kDa) (Figur 7). I likhet med tidigare publicerade massfotometridata5 var de obundna arterna framträdande, medan toppar i massintervallen som skulle motsvara komplex var mycket mindre uppenbara.

Experimentet upprepades med hjälp av ett mikrofluidiksystem med snabb utspädning för att späda ut blandningen till den nödvändiga koncentrationen omedelbart före massfotometrimätningen. Detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt att detektera ytterligare komplex med låg affinitet, som kan ha dissocierat under det manuella spädningssteget. För att uppnå samma utspädningsfaktor på 2000x som användes under det manuella utspädningsexperimentet flödade 1:10-provblandningen (vid 2 μM koncentration för IgG och 20 μM för FcRn) på mikrofluidikchipet med en hastighet av 0,5 μL/min, tillsammans med PBS-buffert (pH 5,0) med en flödeshastighet på 1 ml/min. För att säkerställa att proteinerna inte var nedbrutna vid tidpunkten för mätningen mättes IgG (2 μM) och FcRn (20 μM) under flöde med mikrofluidiksystemet efter 120 minuters inkubation av proverna. Individuella kontrollmätningar visade ingen proteinnedbrytning (Kompletterande figur 1)

För provet som genomgick snabb utspädning kunde topparna motsvarande FcRn-monomerer (53 kDa), FcRn-dimerer (97 kDa) och IgG-monomerer (148 kDa) återigen observeras. Dessutom observerades ytterligare två toppar tydligt vid 196 kDa och 251 kDa, motsvarande IgG-FcRn-komplex med 1:1 och 1:2 stökiometrier (Figur 7). De förväntade massorna för dessa två komplex var 200 kDa respektive 250 kDa. Variabiliteten i massmätningen ligger inom mätfelet för massfotometern som används i denna studie är ±5%14 (2 % för 1:1-komplexet och 0,4 % för 1:2-komplexet).

Närvaron av dessa komplex endast i det snabbt utspädda provet överensstämmer med idén att de tenderar att dissociera vid lägre koncentrationer, med en hastighet som är snabb i förhållande till en manuell utspädningsprocess men långsam i förhållande till den snabba utspädningsprocessen som uppnås med mikrofluidiksystemet15.

Figure 1
Figur 1: Kombinera mikrofluidik med massfotometri. (A,B) Mikrofluidikboxen som används i detta protokoll, sett från (A) framsidan och (B) toppen. Rengöringslösningarna placeras i positionerna 1-3 och proverna och kalibratorerna i positionerna 4-6. Alla lösningar är anslutna till m-omkopplaren, som i sin tur är ansluten till den "lilla" flödesenhetsgivaren. (C) Översikt över hela systemet. Datorn (överst till vänster) är ansluten till mikrofluidikboxen (visas intill bufferten och provrören) och massfotometern (nederst till höger), där mikrofluidikchipet är placerat. Den lilla flödeshastighetsvakten (FRMS) övervakar flödet genom provledningen, medan den stora flödeshastighetsvakten (FRML) övervakar buffertflödet. Prov- och buffertledningsslangen ansluts till en kanal på mikrofluidikchipet, placerad inuti massfotometern. (D) Varje chip har tre kanaler. FRMS är ansluten till provinloppet och FRML till buffertinloppet. Blandarområdet är där den snabba provutspädningen sker, medan observationsområdet är där massfotometrimätningarna görs. Utloppet övervakas av en extra flödessensor för att säkerställa att det inte finns några läckor i chipet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Programvaran för mikrofluidikkontroll. Med denna programvara kan du ställa in och övervaka flödeshastigheterna, tryckledningarna i mikrofluidiksystemet och positionen för multibrytaren (m-switch). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Identifiera förekomsten av bubblor i oljan. Exemplen från datainsamlingsprogramvaran visar en tydlig, obruten fokusring (vänster) och en "trasig" ring, vilket indikerar närvaron av luftbubblor i nedsänkningsoljan (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa exempel på provkoncentrationer där antalet molekyllandningshändelser är för få, ideala eller för många. Molekyler som landar på ytan av observationsområdet i mikrofluidikchipet kommer att visas som mörka fläckar i den ratiometriska vyn av massfotometribilden. I bästa fall bör den önskade koncentrationen göra det möjligt för en idealisk densitet av landningshändelser att äga rum under datainsamlingen (mitten). Om densiteten för landningshändelser är för låg (överst, "För få") kan en korrekt statistisk analys av massfotometridata inte slutföras. Om den är för hög (nederst, 'För många') kommer landningsmolekylerna att överlappa varandra rumsligt, vilket kommer att resultera i dålig datakvalitet. Dessa bilder togs med datainsamlingsprogramvaran med hjälp av en massfotometer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: En skärmdump av dataanalysprogramvaran för massfotometri. Här kan .mp-filerna som exporteras från datainsamlingsprogramvaran laddas för att analysera data. Siffror kan genereras från de bearbetade uppgifterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: En skärmdump av kalibreringen av massa och kontrast för det här experimentet. Den kalibrator som användes var β-amylas, som är känt för att bilda tre arter: monomer (56 kDa), dimer (112 kDa) och tetramer (224 kDa). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Masshistogram visar komplex bildning först efter snabb provutspädning. Masshistogram och motsvarande bäst anpassade Gaussiska fördelningar visas för mätningar av prover som innehåller IgG och FcRn efter manuell utspädning (orange) eller snabb utspädning via mikrofluidikHC-systemet (blå). Massetiketterna anger att medelvärdena från de Gaussiska kurvorna stämmer överens med de masshistogram som uppmätts efter snabb spädning. Efter manuell utspädning observerades toppar motsvarande FcRn-monomerer (52 kDa, mätt med manuell utspädning) och IgG-monomerer (152 kDa). Efter snabb spädning observerades förutom FcRn- och IgG-monomerer även tydligt toppar motsvarande FcRn-dimerer och IgG-FcRn-komplex med 1:1 och 1:2 stökiometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande data Figur 1: Massfotometrimätningar av kontrollprover efter snabb utspädning visar ingen proteinnedbrytning. (A) Masshistogram och den Gaussiska fördelning som passar bäst för provet med enbart FcRn. Den initiala provkoncentrationen före snabb utspädning var 20 μM och flödeshastigheten sattes till 0,5 μL/min. Masstoppar motsvarande FcRn-monomerer (53 kDa) och FcRn-dimerer (97 kDa) kunde observeras. (B) Masshistogram och bäst anpassad Gaussisk fördelning för provet med enbart IgG (Herceptin). Den initiala provkoncentrationen före snabb utspädning var 2 μM och flödeshastigheten sattes till 1 μL/min. En enda masstopp motsvarande IgG-monomeren (155 kDa) kunde observeras. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Protokollet som beskrivs här tillhandahåller en metod för att detektera och kvantifiera protein-proteininteraktioner med låg affinitet. Den använder en massfotometer kopplad till ett mikrofluidiksystem med snabb utspädning. Massfotometri är ett märkningsfritt, bioanalytiskt verktyg som på ett tillförlitligt sätt kan mäta molekylmassa i lösning för biomolekyler16, för dem inom intervallet 30 kDa till 6 MDa. Eftersom massfotometri är en teknik med en enda molekyl som analyserar prover en efter en, är den i allmänhet begränsad till prover i koncentrationsintervallet 100 pM-100 nM. Över detta intervall kommer molekylerna som landar på glasytan att överlappa varandra rumsligt, vilket resulterar i dålig datakvalitet; Under detta intervall erhålls för lite data för att göra en robust analys7. En viktig konsekvens är att det kan begränsa undersökningen av proteininteraktioner till de som bildar en blandning av bundna och obundna arter inom det intervallet.

Här beskrev vi ett steg-för-steg-protokoll för att använda ett mikrofluidiksystem med snabb utspädning för att effektivt utöka intervallet av provkoncentrationer som är mottagliga för massfotometri. Genom att späda ut provet på det mikrofluidiska chipet och sedan flöda det över detektorns observationsfönster inom 50 ms, fångar systemet upp de komplex som finns i det outspädda provet innan interaktionsjämvikten förskjuts. Provet levereras kontinuerligt till detektorn under enskilda mätningar. Under dessa förhållanden kommer 95 % av komplexet att förbli intakt när provet mäts, även för interaktioner med låg affinitet - med en KD i storleksordningen mikromolarer och dissociationshastigheter så snabbt som 1 s-1.

Detta kan beräknas enligt följande: För en reaktion Equation 1 med en framåthastighet kfoch en bakåtriktad hastighet kb,

Equation 2

Vid jämvikt förblir koncentrationerna av alla tre arterna (A, B och komplexet AB) konstanta, så Equation 3 och Equation 4. Under det konservativa antagandet att störningen (utspädningen, i detta fall) kan få komplexet att dissociera, men den framåtriktade (associations) reaktionen inte fortsätter, kan termen kf [A] [B] behandlas som försumbar, och följande förenkling kan göras:

Equation 6

Integrering ger följande uttryck för koncentrationen av komplex vid tidpunkten efter störningen av jämvikten:

Equation 7

Den del av komplexet som förblir bunden vid tidpunkten t efter störningen av jämvikten är således:

Equation 8

Vid = 50 ms, för en reaktion med kb≈ 1 s-1, är den fraktionsbundna 0,95, eller 95%11,12.

Massfotometri användes här och tidigare5 för att undersöka bindningen av den monoklonala IgG-antikroppen trastuzumab till den lösliga domänen av FcRn. De två bindningspartnerna har rapporterats binda med nanomolär affinitet vid surt pH17. Massfotometri användes för att kvalitativt bedöma förekomsten av de komplex som bildades medan bindningspartnerna hade pH 5,0, och proverna späddes snabbt ut genom ett extra mikrofluidiskt system. Proceduren optimerades för den specifika protein-proteininteraktionen baserat på tidigare rapporterade resultat5. Samma procedur kan användas för att studera andra interaktioner, förutsatt att användarna har förkunskaper eller optimerar de experimentella förhållandena för systemet i fråga, såsom vilka buffertar som ska användas, den initiala proteinkoncentrationen, den förväntade stökiometrin och mängden inkubation som behövs för att interaktionen ska nå en jämvikt.

När IgG-FcRn-blandningen späddes ut manuellt var det svårt att detektera förekomst av IgG-FcRn-komplex, trots att dessa proteiner är kända för att interagera5. Denna uppsats visar att den snabba utspädningsmetoden resulterar i en märkbart ökad mängd av dessa komplex. För samma prov, när snabb utspädning användes, observerades båda 1:1 FcRn-IgG-komplex och 2:1 FcRn-IgG-komplex tydligt. Dessa skillnader i komplex bildning visar vikten av att studera biomolekylära interaktionssystem över ett brett spektrum av koncentrationer.

Dessutom visar dessa resultat också att det är enkelt att använda mikrofluidik med analys av enskilda molekyler för att fånga svaga interaktioner - vilket fyller en betydande lucka i metoden. Kombinationen av snabbutspädande mikrofluidik med massfotometri ger attraktiva fördelar på grund av fördelarna med massfotometri som en analytisk teknik. Det vill säga, massfotometri kräver inga etiketter, innebär minimal provberedning och mätningarna görs i lösning. För detta protokoll är en annan viktig fördel med massfotometri dess förmåga att urskilja och kvantifiera alla bildade arter (förutsatt att de har en distinkt massa på >30 kDa). Detta står i kontrast till till exempel SPR, som kan mäta graden av bindning och avbindning men inte direkt kan tillhandahålla information om stökiometri8.

För detta protokoll, liksom för massfotometriexperiment mer allmänt, är flera överväganden till hjälp. För det första bör den slutliga proteinkoncentrationen ligga inom gränsen för vad massfotometri kan mäta (100 pM-100 nM). Den startande inkubationskoncentrationen bör också ligga inom intervallet för mikrofluidiksystemet (upp till 90 μM) och teoretiseras vara högre än den faktiska KD för interaktionen10. Den rekommenderade utgångspunkten är ett blandningsförhållande på 1:1 koncentration mellan de interagerande arterna vid μM-koncentration. Förhållandet kan sedan varieras till 1:2, 1:5 eller, som i fallet med denna interaktion, 1:10. Om det inte finns någon tidigare information om proteininteraktionerna måste användaren optimera experimentet och börja med en hög koncentration (rekommenderad 20 μM) för varje partner för att avgöra om affiniteten hos komponenterna ligger inom det koncentrationsintervall som upprätthålls av den presenterade metoden (dvs. komplex bildas). Optimering kan också innebära att man väljer andra buffertförhållanden för att främja interaktionerna eller titreringen av en av interaktionskomponenterna för att bestämma rätt blandningsförhållande. När dessa har bestämts är det möjligt att optimera koncentrationer och flöden för att möjliggöra optimala förhållanden för studien och metoden, t.ex. att minska koncentrationerna för att möjliggöra bättre toppupplösning.

För det andra, för att framgångsrikt replikera detta experiment, bör föroreningar minimeras. Vanliga källor till föroreningar som är kända för att negativt påverka massfotometrimätningar inkluderar andra proteiner eller cellulärt skräp som finns kvar efter rening, ofiltrerade buffertar, micellbildande rengöringsmedel (om de finns i för hög koncentration) och buffertar som innehåller höga koncentrationer av salt, glycerol eller andra komponenter. Som diskuterats i protokollet ovan bör bubblor i mikrofluidiksystemet avlägsnas. Bubblor kan bildas i rörsystemet eller om proverna har hög ytspänning och är benägna att skumbildas. Bubblor kan också bildas i nedsänkningsoljan, vilket kan detekteras från fokusringen (Figur 3). Om bubblor inte kan avlägsnas med hjälp av de steg som beskrivs i protokollet är en annan lösning att avgasa provet med hjälp av en exsickator och en vakuumpump, vilket lämnar provet under reducerat tryck i några minuter. Vortexing eller skakning av högkoncentrerade proteinlösningar rekommenderas inte eftersom dessa åtgärder kan främja bubbelbildning.

Medan mätningen av en specifik protein-proteininteraktion demonstreras här, kan samma protokoll tillämpas på andra protein-proteininteraktionssystem utan betydande modifiering. En ytterligare framtida inriktning av detta protokoll skulle vara att använda mätningarna för att beräkna KD-värden för de identifierade komplexen, vilket har beskrivits på andra ställen i samband med massfotometri 5,7. Medan de tidigare studierna använde data från experiment med manuell utspädning och starkare interaktioner, kan analysprincipen lätt tillämpas i detta sammanhang - förutsatt att ytterligare förbättringar i mikrofluidikanordningen implementeras (såsom ökad flödessensornoggrannhet och pumpstabilitet).

Utöver protein-protein-interaktioner kommer det sannolikt att finnas bredare tillämpningar för den kombinerade metoden med massfotometri och mikrofluidik med snabb utspädning. Massfotometri kan användas för att bedöma provets renhet, aggregering och homogenitet18,19; studera proteinoligomerisering20, makromolekylär montering21 eller polymerisation22; och på andra områden. Massfotometrianalys sträcker sig också bortom proteiner; Det har använts för att undersöka interaktioner mellan nukleinsyror och proteiner23, viruspartiklar24 och nanopartiklar25. Detta protokoll beskriver således en viktig tillämpning av ett kombinerat mikrofluidiksystem för massfotometri - det möjliggör direkt mätning av svaga protein-proteininteraktioner på nivån av enskilda molekyler och komplex. Värdet av den aktuella applikationen är högt, eftersom det öppnar möjligheten att direkt karakterisera interaktioner som generellt har varit svåra att studera - med relevans inom kritiska terapeutiska områden. Detta kombinerade tillvägagångssätt skulle också kunna ligga till grund för ett bredare spektrum av undersökningar av prover med koncentrationer upp till tiotals mikromolar.

Disclosures

Myndert Claasen och Zornitsa Kofinova är anställda av Refeyn Ltd, som tillverkar massfotometern och mikrofluidiksystemet som används i den här artikeln. Weston Struwe är aktieägare och konsult till Refeyn Ltd.

Acknowledgments

W.S. stöds av ett UKRI Future Leaders Fellowship [MR/V02213X/1]. Manuskripttexten och grafiken utarbetades med stöd från medlemmar av Refeyns team för vetenskaplig kommunikation (Panagiota Paganopoulou, Neus Torres Tamarit och Catherine Lichten). Vi värdesätter också värdefull feedback från Camille Hetez, Sofia Ferreira och Matthias Langhorst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol (Isopropanol) VWR International LLC 20880.320
Data acquisition software Refeyn AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software Refeyn DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag Sigma SRP0624
Herceptin (IgG)  Cambridge Bioscience HY-P9907-1mg
Mass photometer Refeyn TwoMP
Microfluidics box Refeyn MassFluidix HC system
Microfluidics chip Refeyn MassFluidix HC chip
Microfluidics control software Fluigent OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure VWR International LLC K812
Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma S2770
β-Amylase, from sweet potato Sigma A8781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
  2. Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  3. Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).
  4. Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
  5. Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
  6. Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).
  7. Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
  8. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  9. Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  10. Refeyn Ltd. MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. , https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023).
  11. Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  12. Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264 (2020).
  13. Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).
  14. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation. , https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022).
  15. Lai, S. -H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211 (2021).
  16. Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
  17. Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
  18. Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).
  19. Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
  20. Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
  21. Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
  22. Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).
  23. Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521 (2021).
  24. Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
  25. Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

Tags

Denna månad i JoVE utgåva 203 Mikrofluidik massfotometri protein-proteininteraktioner med låg affinitet IgG-antikropp neonatal Fc-receptor
Analys av proteinkomplexbildning vid mikromolära koncentrationer genom att koppla mikrofluidik med massfotometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino,… More

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino, M., Struwe, W. B. Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry. J. Vis. Exp. (203), e65772, doi:10.3791/65772 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter