Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل تكوين مركب البروتين بتركيزات ميكرومولار عن طريق اقتران الموائع الدقيقة بالقياس الضوئي الشامل

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65772
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4
1Refeyn Ltd., 2Adaptix Ltd., 3Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, University of Oxford, 4The Kavli Institute for Nanoscience Discovery, University of Oxford

Summary

يجمع هذا البروتوكول بين القياس الضوئي الشامل ونظام الموائع الدقيقة الجديد للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين منخفضة التقارب. يعتمد هذا النهج على التخفيف السريع للمعقدات عالية التركيز في المحلول ، مما يتيح قياسات منخفضة التقارب ويوسع إمكانية تطبيق القياس الضوئي الشامل.

Abstract

القياس الضوئي الشامل هو تقنية متعددة الاستخدامات لقياس الكتلة تتيح دراسة التفاعلات الجزيئية الحيوية والتكوين المعقد في محلول بدون ملصقات. القياس الضوئي الشامل مناسب بشكل عام لتحليل العينات في نطاق تركيز 100 pM-100 nM. ومع ذلك ، في العديد من النظم البيولوجية ، من الضروري قياس عينات أكثر تركيزا لدراسة التفاعلات منخفضة التقارب أو العابرة. نوضح هنا طريقة توسع بشكل فعال نطاق تركيزات العينات التي يمكن تحليلها عن طريق القياس الضوئي الشامل من nanomolar إلى عشرات micromolar.

في هذا البروتوكول ، يتم دمج القياس الضوئي الشامل مع نظام الموائع الدقيقة الجديد للتحقيق في تكوين مجمعات البروتين في محلول في نطاق تركيز المولر الدقيق. مع نظام الموائع الدقيقة ، يمكن للمستخدمين الاحتفاظ بعينة بتركيز أعلى مرغوب فيه متبوعا بالتخفيف إلى النطاق النانوي - عدة أجزاء من الثانية قبل قياس القياس الضوئي الشامل. بسبب سرعة التخفيف ، يتم الحصول على البيانات قبل تحول توازن العينة (أي تفكك المجمع).

يتم تطبيق هذه التقنية لقياس التفاعلات بين الجسم المضاد للغلوبولين المناعي G (IgG) ومستقبل Fc الوليدي ، مما يدل على تكوين معقدات عالية الترتيب لم تكن قابلة للقياس الكمي باستخدام قياسات القياس الضوئي للكتلة الثابتة.

في الختام ، فإن الجمع بين القياس الضوئي الشامل والموائع الدقيقة يجعل من الممكن توصيف العينات في نطاق تركيز المولر الدقيق وهو بارع في قياس التفاعلات الجزيئية الحيوية مع الصلات الأضعف. يمكن تطبيق هذه القدرات في مجموعة من السياقات - بما في ذلك تطوير وتصميم العلاجات الحيوية - مما يتيح توصيفا شاملا للتفاعلات المتنوعة بين البروتين والبروتين.

Introduction

تؤكد تفاعلات البروتين والبروتين على معظم الوظائف الخلوية ، من التنظيم المناعي إلى تكرار الحمض النووي وترجمته. نتيجة لذلك ، هناك حاجة أساسية في جميع أنحاء علوم الحياة للتحقيق في مجموعة واسعة من التفاعلات عبر المجمعات غير المتجانسة المتنوعة التي تتشكل بشكل شائع. ومع ذلك ، غالبا ما يكون اكتشافها وتوصيفها وقياسها أمرا صعبا ، خاصة بالنسبة للتفاعلات منخفضة التقارب1.

غالبا ما تستخدم مقايسات الترسيب المناعي للكشف عن التفاعلات عالية التقارب ، ولكن بالنسبة للتفاعلات منخفضة التقارب والتفاعلات العابرة ، يكون الكشف غير ممكن إلى حد كبير2. يمكن أيضا استخدام تقنيات التألق ولكنها تتطلب إضافةملصقات الفلورسنت 2. يمكن أن يوفر Cryo-EM لقطة هيكلية وقراءة جماعية لمجمعات البروتين المتكونة بدقة مكانية عالية ولكنه يتطلب أيضا العمل بتركيزات منخفضة جدا لتصوير تفاعلات منخفضة التقارب. يجلب Cryo-EM أيضا تحديات تتعلق بالتكلفة وإمكانية الوصول وإعداد العينات ووقت التحليل3.

بالإضافة إلى ذلك ، أصبح رنين البلازمون السطحي (SPR) طريقة شائعة لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين ، على الرغم من أنه يتطلب تجميد البروتين ، والذي يمكن أن يؤثر على توازن الربط ويؤدي إلى معدلات متغيرة ، وبالتالي تقليل دقة القياس 4,5. كما يتضمن العديد من خطوات الفحص قبل جمع البيانات وتحليلها6.

القياس الضوئي الشامل هو تقنية أحادية الجزيء تم استخدامها لتحليل تفاعلات البروتينوالبروتين 5،6،7. وهو يعمل عن طريق قياس كتلة الجزيئات أو المجمعات المفردة بناء على الضوء الذي تشتت عند هبوطها على سطح غطاء زجاجي8. تم استخدام قياسات القياس الضوئي الشامل لتحديد تقارب الارتباط من الوفرة النسبية لشركاء الربط والمعقدات التي يشكلونها5. ومع ذلك ، مثل تقنيات الجزيء الواحد الأخرى ، يجب أن يكون تركيز العينة المراد قياسها عادة أقل من 100 نانومتر. إذا كان التركيز أعلى ، فإن الجزيئات التي تهبط على السطح الزجاجي سوف تتداخل مكانيا ، مما يؤدي إلى رداءة جودة البيانات7. وبالتالي ، لا يمكن قياس التفاعلات الأضعف (KD ~ micromolars) ، التي تنفصل عند هذه التركيزات المنخفضة ، بشكل موثوق لأنه لا يمكن ملاحظة الخليط الضروري من الأنواع غير المنضمة والمقيدة5.

هنا ، نصف نهجا يتغلب على هذا القيد بناء على جهاز قياس ضوئي جديد مقترن بالموائع الدقيقة. على وجه التحديد ، يتم استخدام نظام الموائع الدقيقة مع مقياس الضوء الشامل لتوسيع نطاق التفاعلات التي يمكن قياسها كميا عن طريق القياس الضوئي الشامل. لقد ثبت أن علم الموائع الدقيقة يوفر مجموعة من الاحتمالات للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين ، بما في ذلك التخفيف السريع للكشف عن التفاعلات الضعيفة 1,9. يعمل النظام الموصوف هنا عن طريق تخفيف العينة بسرعة تصل إلى 10000 ضعف على شريحة الموائع الدقيقة وتدفقها على الفور عبر منطقة مراقبة الرقاقة ، مما يتيح قياس القياس الضوئي الشامل أن يبدأ في غضون 50 مللي ثانية من وقت بدء الجزيئات عملية التخفيف10. يحدث التخفيف عندما يتم دمج العينة والمخزن المؤقت في خلاط صمام Tesla عكسي على الشريحة ، مع تحديد معدلات التدفق النسبية للمحلولين مقدار التخفيف الذي يحدث (انظر البروتوكول الخطوة 8). يمكن التحكم في معدل التدفق باستخدام برنامج التحكم في الموائع الدقيقة. يمكن أن يؤدي تغيير معدل التدفق إلى تغيير عدد السكان النسبي للأنواع لأنه يمكن أن يؤثر على عدد أحداث الهبوط على سطح الزجاج ، وهو ما يقيسه مقياس الكتلة الضوئي.

سرعة العملية سريعة بما يكفي لإكمال القياس قبل تعطيل سلامة التفاعل (لمزيد من التفاصيل ، انظر أيضا المناقشة). يمكن فهم ذلك من خلال إلقاء نظرة سريعة على نظرية التفاعلات من الدرجة الأولى ، حيث Equation 1. ثابت معدل الاقتران الأمامي هو kf ، وثابت معدل التفكك الخلفي هو kb ، ويتم تعريف ثابت تفكك التوازن (KD) على أنه

كد = كب / كو

بالنسبة لربط البروتين ، يكون kfمحدودا بشكل عام بانتشار المواد المتفاعلة11 وبالتالي يقتصر على نطاق 106-10 7 M-1 · s-1. نظرا لأن نطاق محدود ، فإن تفاعل التقارب المنخفض (KD ~ micromolars) سيكون له kb≈ 1 s-1. أي أن kb = kf  · KD = (106 M-1 · s-1) (10-6 M) = 1 s-1 ، مع عمر النصف للمجمع حوالي 0.7 s11,12.

نظام المثال الخاص بنا هو ربط الجسم المضاد أحادي النسيلة IgG trastuzumab بالمجال القابل للذوبان لمستقبل IgG حديثي الولادة Fc (FcRn) ، وهما شريكان متفاعلان معروفان13. أظهرت البيانات المنشورة سابقا التي تم الحصول عليها باستخدام القياس الضوئي الشامل التقليدي وحده (أي مع التخفيف اليدوي للعينات) أن البروتينات تشكل أنواعا متعددة. كانت مونومرات FcRn وثنائيات FcRn و IgG غير المنضمة مرئية بوضوح ، بينما تم اكتشاف معقدات IgG-FcRn (بنسب 1: 1 و 1: 2) (عند الرقم الهيدروجيني 5.0) ولكن فقط بوفرة منخفضة جدا5. تثير هذه الملاحظة مسألة ما إذا كان يمكن اكتشاف تكوين مركب IgG-FcRn بشكل أكثر وضوحا إذا تم قياسه بتركيز أعلى. في الواقع ، فإن الجمع بين القياس الضوئي الشامل ونهج التخفيف السريع المقترن الموصوف هنا قدم دليلا أكثر قوة على التكوين المعقد من خلال زيادة جزيئاتها المقاسة.

يتيح بروتوكول القياس الضوئي الشامل وعلم الموائع الدقيقة الموصوف هنا توصيف تكوين المجمعات مع KD حتى نطاق المولار. سيتطلب التحديد التجريبي ل KD مزيدا من التحسينات على دقة مستشعر التدفق ، واستقرار المضخة ، والاختلافات من شريحة إلى شريحة ، وموقع القياس داخل نافذة المراقبة ، حيث ستؤثر كل هذه العوامل على الوقت من وقت تخفيف العينة إلى قياسها.

يمكن تطبيق نفس النهج للتحقق من الارتباط بين أي بروتينات قابلة للذوبان ، بشرط أن يكون لها أوزان جزيئية مميزة (مفصولة بما لا يقل عن 25 كيلو دالتون) تقع في النطاق المناسب للتحليل باستخدام مقياس ضوئي للكتلة (30 كيلو دالتون إلى 6 ميجا فولت أمبير). يمكن أن تكون الأفكار التي تم الحصول عليها مفيدة للدراسات في مجموعة من السياقات - من اكتساب فهم ميكانيكي للوظائف الخلوية إلى تصميم أدوية علاجية حيوية جديدة.

Protocol

1. إعداد الأدوات وإطلاق البرنامج

  1. قم بتشغيل مقياس الضوء الشامل واتركه قيد التشغيل لمدة 1 ساعة على الأقل قبل البدء في أي قياسات.
    ملاحظة: هذا لأن الجهاز يحتاج إلى الوصول إلى درجة حرارة ثابتة. قد يؤدي عدم ترك مقياس الضوء الشامل قيد التشغيل لمدة 1 ساعة إلى تحول الكتلة ، وبالتالي نتائج غير دقيقة.
  2. قم بتشغيل الطاولة المضادة للاهتزاز عن طريق تشغيل الطاقة والضغط على زر العزل (أسفل مقياس الضوء الشامل). تحد الاهتزازات من أداء أداة القياس الضوئي الشامل ، لذا فإن الجدول المضاد للاهتزاز مهم لضمان أقصى حساسية للأداة. قم بتشغيل صندوق الموائع الدقيقة.
  3. قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات وبرنامج التحكم في الموائع الدقيقة. قم بتشغيل ضاغط الهواء.

2. تحضير عينات البروتين والمخزن المؤقت ومحاليل التنظيف

  1. أضف 200 مل من محلول PBS (pH 7.4) إلى زجاجة 200 مل نظيفة و 200 مل من محلول PBS (pH 5.0) إلى زجاجة ثانية سعة 200 مل.
    ملاحظة: يجب توصيل الزجاجات سعة 200 مل بمستشعر وحدة التدفق "L" في الخطوات التالية. استخدم المخزن المؤقت pH 7.4 PBS لقياس المعايرة ومخزن pH 5.0 PBS المؤقت لقياس العينة.
  2. في أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 مل ، امزج IgG (2 μM) و FcRn (20 μM) بنسبة 1:10 لحجم إجمالي قدره 60 ميكرولتر.
    1. حلول الأسهم ل FcRn و IgG هي 91.9 ميكرومتر و 13.5 ميكرومتر على التوالي. تحضير التفاعل عن طريق خلط 9 ميكرولتر من المخزون IgG + 13 ميكرولتر من المخزون FcRn + 38 ميكرولتر من PBS (درجة الحموضة 5.0 ، درجة حرارة الغرفة [RT]) في أنبوب طرد مركزي لحجم إجمالي قدره 60 ميكرولتر. كانت التركيزات النهائية للمتفاعلين 2 ميكرومتر ل IgG و 20 ميكرومتر ل FcRn. احتفظ بجميع مخزون البروتين على الجليد طوال هذه العملية.
  3. في أنبوب طرد مركزي آخر سعة 0.5 مل ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر من معايرة β-Amylase بتركيز 20 ميكرومتر.
    1. وكمثال على ذلك، لتحضير معاير β-Amylase المستخدم هنا، اتبع الإجراء الموضح في 2-3-1-2-2-3-1-2.
      1. أعد تعليق 20 مجم من مسحوق β-Amylase في القارورة في 3.57 مل من PBS (5٪ جلسرين) ، بما يعادل 5.6 مجم / مل وتركيز مولي يبلغ 100 ميكرومتر (حيث أن الوزن الجزيئي هو 56 كيلو دالتون).
      2. للتخفيف إلى 20 ميكرومتر ، ادمج 200 ميكرولتر من مخزون 100 ميكرومتر مع 800 ميكرولتر من PBS (درجة الحموضة 7.4 ، RT) في أنبوب طرد مركزي سعة 1 مل.
  4. احتضان العينات في RT لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: ابدأ في تحضير تخفيفات العينة والمعايرة بعد تشغيل مقياس الكتلة الضوئي. في هذه التجربة ، تم تحضين العينات لمدة 120 دقيقة.
  5. في ثلاثة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل ، القسامة: 50 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) - محلول التنظيف 1 (CS1) ، 50 مل من 0.5 M NaOH - محلول التنظيف 2 (CS2) ، و 50 مل من IPA 100٪ - محلول التنظيف 3 (CS3).

3. الإعداد التجريبي

  1. لتحميل العينة والمعاير ، ضع أنبوب الطرد المركزي للمعايرة في الموضع 4 وأنبوب الطرد المركزي للعينة في الموضع 5 من صندوق الموائع الدقيقة (الشكل 1).
  2. لتحميل محاليل التنظيف ، ضع CS1 و CS2 و CS3 في المواضع 1 و 2 و 3 من صندوق الموائع الدقيقة (الشكل 1).
    ملاحظة: يتم توصيل محاليل العينة والمعايرة والتنظيف بالمحولات المتعددة (m-switch). يتم توصيل مفتاح m بمستشعر وحدة التدفق "S".
  3. قم بربط الغطاء المتصل بالخط العازل بالزجاجة العازلة سعة 200 مل (الرقم الهيدروجيني 7.4).
    ملاحظة: يتم توصيل خط العزل بصمام إغلاق متصل بمستشعر وحدة التدفق "L". يمنع صمام الإغلاق أي تأثيرات سحب يمكن أن تحدث عند توقف تدفق المخزن المؤقت. يمكن أن يؤدي السحب إلى تلوث المخزن المؤقت من السائل المتبقي المخفف العائد إلى الخزان العازل.
  4. ضع شريحة الموائع الدقيقة على طبق تحضير.
    ادفع نهاية الأنبوب الآخر لمستشعر وحدة التدفق "S" إلى "مدخل العينة" للقناة الأولى في رقاقة الموائع الدقيقة (الشكل 1). خط العينة كامل.
  5. ادفع نهاية الأنبوب الآخر لمستشعر وحدة التدفق "L" إلى "مدخل المخزن المؤقت" للقناة الأولى في رقاقة الموائع الدقيقة (الشكل 1). اكتمل الخط العازل.
  6. لجمع التدفق الخارجي ، ادفع أنبوبا إلى "منفذ" القناة الأولى في رقاقة الموائع الدقيقة ؛ ضع الطرف الآخر بحيث يتم تصريفه في دورق أو كأس زجاجية قابلة لاستقبال النفايات (الشكل 1).

4. فتيلة العينة وخطوط العازلة مع العازلة

  1. افتح صمام الإغلاق اليدوي على الخط العازل.
  2. في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة ، اضبط معدل تدفق الخط العازل على 1000 ميكرولتر / دقيقة وتأكد من أن ضغط الخط العازل لا يتجاوز 110 ملي بار (الشكل 2). سيبدأ التدفق تلقائيا في الخط العازل (الشكل 1).
    ملاحظة: إذا تجاوز ضغط الخط العازل 110 ملي بار ، فقد يكون ذلك بسبب مرور الهواء عبر مستشعر التدفق. إذا لم يعد الضغط إلى طبيعته في غضون ثوان قليلة ، فمن المحتمل أن يكون هناك انسداد (عادة بسبب الأنابيب المضغوطة في الوصلات). في هذه الحالة ، أوقف التدفق وتحقق من التوصيلات في الخط العازل ، بدءا من صمام الإغلاق.
  3. في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة ، حدد الموضع 1 من مفتاح التبديل m (المقابل للمخزن المؤقت PBS) ، ثم اضبط معدل تدفق خط العينة على 8 ميكرولتر / دقيقة وتأكد من أن ضغط خط العينة لا يتجاوز 350 ملي بار. سيبدأ التدفق تلقائيا في خط العينة (الشكل 1).
  4. استخدم طرف ماصة (أو أي مكون بلاستيكي ناعم آخر) لتطبيق ضغط لطيف من الأعلى بالقرب من الفقاعة (الفقاعات) المحبوسة في الشريحة لإزاحة فقاعات الهواء والتأكد من إزالتها من خلال المخرج.
    ملاحظة: تأكد من إزالة جميع الفقاعات في أقسام "الخلاط" و "منطقة المراقبة" (الشكل 1) من القناة المستخدمة. احرص على عدم الضغط بشدة ، فقد يؤدي ذلك إلى إتلاف الشريحة.

5. وضع رقاقة الموائع الدقيقة على مقياس الضوء الشامل وإيجاد التركيز

  1. ضع قطرة من زيت الغمر المجهري على هدف مقياس الكتلة الضوئي.
  2. ضع رقاقة الموائع الدقيقة على حامل مقياس الكتلة الضوئي بحيث يكون "مدخل العينة" متجها لأعلى وأمسكه متصلا بمشابك المرحلة (الشكل 1). تأكد من بقاء جميع وصلات الأنابيب متصلة.
  3. باستخدام برنامج الحصول على البيانات ، حرك المرحلة للتأكد من أن "منطقة المراقبة" للقناة 1 تتماشى مع الهدف (الشكل 1).
  4. أغلق غطاء مقياس الضوء الشامل واضغط على خيار البحث عن التركيز لتخفيف القطيرات في برنامج الحصول على البيانات.
  5. تحقق من حلقة التركيز البيضاء في الزاوية اليسرى السفلية من برنامج الحصول على البيانات (الشكل 3). تشير الفجوات الموجودة في الحلقة إلى وجود فقاعة من الهواء في زيت الغمر ؛ قم بإزالة هذا عن طريق زيادة سرعة المسرح إلى الحد الأقصى وتحريك المسرح برفق بشكل جانبي.
  6. بعد اكتمال التركيز ، انتظر 2-3 دقائق قبل أخذ التسجيل الأول. ثم اضغط على تسجيل لتسجيل قياس 1 دقيقة وتأكد (من خلال مراقبة القياس) من عدم ظهور شوائب.
    ملاحظة: يمكن أن تكون الشوائب على السطح الزجاجي أو في المخزن المؤقت. يجب أن تكون قيمة الحدة في برنامج الحصول على البيانات أعلى من 4.5٪.

6. معايرة القياس الضوئي الشامل

  1. في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة ، قم بتبديل المفتاح m إلى الموضع 4 (المقابل للمعاير) وتأكد من ضبط معدل تدفق خط العينة على 8 ميكرولتر / دقيقة وأن ضغط خط العينة لا يتجاوز 350 ملي بار (الشكل 2).
    1. سيبدأ المعاير في التدفق عبر الشريحة. انتظر حوالي 1.5-2.5 دقيقة (أو حتى يتم رؤية المعاير باستمرار على برنامج الحصول على البيانات). قد يختلف الوقت بناء على طول أنبوب خط العينة.
  2. بمجرد رؤية المعاير باستمرار (أي أن عدد الأحداث يكفي لقياس الكتلة الضوئية بدقة) ، في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة ، قم بتقليل معدل التدفق إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة - مستوى التخفيف المستهدف لهذه التجربة.
    ملاحظة: يؤدي البدء بمعدل تدفق أعلى إلى تقليل الوقت اللازم لوصول المعاير إلى الشريحة.
  3. تأكد من عدم وجود جزيئات "قليلة جدا" أو "كثيرة جدا" تهبط على سطح القياس (الشكل 4).
    1. إذا لم تكن كثافة حدث الهبوط "مثالية" (الشكل 4) ، فقم بتغيير معدل التدفق في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة. إذا كانت كثافة الحدث منخفضة جدا ، فقم بزيادة معدل تدفق العينة حتى يتم ملاحظة أحداث هبوط منفصلة جيدا (ولكن لا تتجاوز 8 ميكرولتر / دقيقة). إذا كان مرتفعا جدا ، فقم بتقليل معدل تدفق العينة (ولكن لا تقل عن 0.1 ميكرولتر / دقيقة).
    2. إذا كان حجم المعايرة منخفضا في أنبوب العينة ، فقم بتغيير موضع المفتاح m إلى خط PBS pH 7.4 (الموضع 1) لتجنب حقن الهواء.
  4. اضغط على تسجيل وقم بقياس 60 ثانية. احفظ الملف في مجلد مختار.
    ملاحظة: ينتج برنامج الحصول على البيانات ملفات بملحق .mp.

7. تنظيف خط العينة ووقف التدفق

  1. في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة ، قم بالتبديل إلى الموضع 2 من المفتاح m وقم بتغيير ضغط العينة إلى 800 ملي بار (الشكل 2). اغسل النظام باستخدام CS2 (NaOH) لمدة 4 دقائق.
  2. قم بالتبديل إلى الموضع 3 من المفتاح m واغسل النظام باستخدام CS3 (IPA) لمدة 4 دقائق.
  3. قم بالتبديل إلى الموضع 1 من المفتاح m واغسل النظام باستخدام CS1 (PBS) لمدة 4 دقائق.
  4. في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة ، أوقف كل التدفق عن طريق ضبط خط العينة وضغوط الخط العازل على 0 وإغلاق الصمام العازل.
  5. افصل الشريحة عن المسرح وضعها مرة أخرى على لوحة التحضير. افصل جميع الأنابيب وضع طرف أنبوب العينة في زجاجة نفايات. تنظيف الهدف مع الأيزوبروبانول ومناديل.

8. قياس عينة القياس الضوئي الشامل

  1. قم بفك الغطاء المتصل بالزجاجة العازلة سعة 200 مل (الرقم الهيدروجيني 7.4) وقم بتثبيته في الزجاجة العازلة سعة 200 مل (درجة الحموضة 5.0).
  2. كرر الخطوات من 3.4 إلى 5.6 ، ولكن استخدم القناة الثانية للشريحة بدلا من القناة الأولى.
  3. في برنامج التحكم في الموائع الدقيقة ، قم بتبديل مفتاح m إلى الموضع 5 (المقابل للعينة) ، واضبط معدل تدفق خط العينة على 8 ميكرولتر / دقيقة ، وتأكد من أن ضغط خط العينة لا يتجاوز 350 ملي بار (الشكل 2).
  4. كرر الخطوات 6.2-6.4 لقياس العينة.
    1. لحساب معدلات التدفق المراد استخدامها، تأكد من أن فرق الطي في معدل التدفق يطابق عامل تخفيف العينة المطلوب. على سبيل المثال ، لتحقيق تخفيف 2000x هنا ، تختلف معدلات التدفق بعامل 2000 ؛ معدل تدفق المخزن المؤقت هو 1000 ميكرولتر / دقيقة ، ومعدل تدفق العينة 0.5 ميكرولتر / دقيقة. في نهاية التجربة ، اترك الخطوط نظيفة دائما باتباع بروتوكول التنظيف.

9. تحليل البيانات

  1. بمجرد الانتهاء من الحصول على البيانات ، قم بتشغيل برنامج تحليل البيانات (الشكل 5).
  2. انقر فوق رمز علامة الجمع (+) في الجزء العلوي الأيسر وحدد ملف معايرة .mp. سيبدأ البرنامج في تحليل الملف المحمل. اعتمادا على حجم وعدد القياسات ، قد يستغرق ذلك بضع دقائق
    1. لا تقم بتحليل ملفات .mp في برنامج تحليل البيانات أثناء الحصول على البيانات باستخدام برنامج الحصول على البيانات لأن القيام بذلك قد يقلل من جودة البيانات التي يتم الحصول عليها.
  3. اضغط على الزر إنشاء معايرة الكتلة (أسفل اليمين). سيتم فتح مربع حوار يعرض جدولا مملوءا بقيم التباين للقمم المجهزة.
  4. قم بتغيير القيم إلى قيم الكتلة المعروفة للقمم المجهزة (بالنسبة إلى β-amylase ، تكون هذه القيم 56 كيلو دالتون و 112 كيلو دالتون و 224 كيلو دالتون) واضغط على حفظ. سيظهر ملف المعايرة الذي تم إنشاؤه حديثا (امتداد .mc) على لوحة المعايرة الجماعية (أسفل يسار برنامج تحليل البيانات) (الشكل 6).
  5. انقر فوق رمز علامة الجمع (+) في الجزء العلوي الأيسر وحدد ملف نموذج .mp.
  6. لإنشاء مدرج تكراري جماعي ، كما هو موضح في الشكل 5 ، انتقل إلى تحليل علامة التبويب ، وحدد وضع الرسم البياني ، وخيار الرسم الشامل . اضبط عرض الحاوية وحدود الكتلة والمعلمات الأخرى حسب الحاجة.
  7. قم بتخصيص المخطط بشكل أكبر في علامة التبويب Figures إذا رغبت في ذلك قبل تصدير الأشكال و / أو حفظ مساحة العمل بأكملها كملف .dmp.

Representative Results

تم استخدام القياس الضوئي الشامل لقياس التفاعل بين الجسم المضاد أحادي النسيلة IgG trastuzumab والمجال القابل للذوبان لمستقبل IgG حديثي الولادة Fc (FcRn). تم تخفيف خليط 1:10 من البروتينين (عند 2 ميكرومتر ل IgG و 20 ميكرومتر ل FcRn) يدويا إلى 10 نانومتر و 20 نانومتر في PBS ، على التوالي.

تعد خطوة التخفيف ضرورية لأن القياس الضوئي الشامل ، وهو تقنية قياس كتلة أحادية الجزيء ، يمكنه فقط تحليل العينات في نطاق 100 pM-100 nM. يمكن أن تؤدي محاولة قياس العينات ذات التركيزات خارج هذا النطاق إلى تعريض دقة النتائج للخطر (الشكل 4). لم يتم تضمين هذه التجربة في هذا البروتوكول ، كما تم وصفها سابقا 5,6.

في الرسوم البيانية للكتلة المنتجة في تجربة القياس الضوئي الشامل ، يتم رسم قوة إشارة التشتت (أو "التباين") لكل حدث هبوط على المحور السيني ، ويتم تحويلها إلى كتلة جزيئية عبر خطوة معايرة تباين الكتلة. وفي الوقت نفسه ، يشير المحور ص إلى عدد الجزيئات المحسوبة بكتلة معينة (أو تباين). لذلك ، تشير القمة إلى وجود مجموعة من الجزيئات ضمن نطاق الأوزان الجزيئية الموضحة على المحور السيني. يعكس عدد الأحداث (التهم) التي تشكل الذروة حجم هؤلاء السكان.

أدى قياس القياس الضوئي للكتلة مع التخفيف اليدوي إلى رسم بياني للكتلة حيث تتوافق أكبر قمتين ، بناء على الأوزان الجزيئية المتوقعة للبروتينات ، مع مونومرات FcRn غير المنضمة (~ 50 كيلو دالتون) ومونومرات الأجسام المضادة IgG (~ 150 كيلو دالتون) (الشكل 7). على غرار بيانات القياس الضوئي الشامل المنشورة سابقا5 ، كانت الأنواع غير المنضمة بارزة ، في حين أن القمم في نطاقات الكتلة التي تتوافق مع المجمعات كانت أقل وضوحا.

تم تكرار التجربة باستخدام نظام الموائع الدقيقة للتخفيف السريع لتخفيف الخليط إلى التركيز اللازم مباشرة قبل قياس الكتلة الضوئية. مكن هذا النهج من اكتشاف معقدات إضافية منخفضة التقارب ، والتي ربما تكون قد انفصلت أثناء خطوة التخفيف اليدوي. لتحقيق نفس عامل التخفيف 2000x المستخدم أثناء تجربة التخفيف اليدوي ، تم تدفق خليط العينة 1:10 (بتركيز 2 ميكرومتر ل IgG و 20 ميكرومتر ل FcRn) على رقاقة الموائع الدقيقة بمعدل 0.5 ميكرولتر / دقيقة ، جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت PBS (الرقم الهيدروجيني 5.0) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. لضمان عدم تحلل البروتينات في وقت القياس ، تم قياس IgG (2 μM) و FcRn (20 μM) تحت التدفق باستخدام نظام الموائع الدقيقة بعد 120 دقيقة من حضانة العينات. أظهرت قياسات التحكم الفردية عدم تدهور البروتين (الشكل التكميلي 1)

بالنسبة للعينة التي خضعت للتخفيف السريع ، يمكن ملاحظة القمم المقابلة لمونومرات FcRn (53 كيلو دالتون) ، وثنائيات FcRn (97 كيلو دالتون) ، ومونومرات IgG (148 كيلو دالتون) مرة أخرى. أيضا ، لوحظت قمتان إضافيتان بوضوح عند 196 كيلو دالتون و 251 كيلو دالتون ، المقابلة لمعقدات IgG-FcRn مع 1: 1 و 1: 2 القياسات المتكافئة (الشكل 7). كانت الكتل المتوقعة لهذين المجمعين 200 كيلو دالتون و 250 كيلو دالتون على التوالي. التباين في قياس الكتلة ضمن خطأ القياس لمقياس الكتلة الضوئي المستخدم في هذه الدراسة هو ±5٪ 14 (2٪ للمركب 1: 1 و 0.4٪ للمركب 1: 2).

يتوافق وجود هذه المعقدات في العينة المخففة بسرعة فقط مع فكرة أنها تميل إلى الانفصال بتركيزات أقل ، بمعدل سريع بالنسبة لعملية التخفيف اليدوي ولكنه بطيء بالنسبة لعملية التخفيف السريع التي تحققت مع نظام الموائع الدقيقة15.

Figure 1
الشكل 1: الجمع بين الموائع الدقيقة والقياس الضوئي الشامل. (أ ، ب) صندوق الموائع الدقيقة المستخدم في هذا البروتوكول ، كما يتضح من الجزء الأمامي (أ) والجزء العلوي (ب). يتم وضع محاليل التنظيف في المواضع 1-3 ، والعينات والمعايرة في المواضع 4-6. جميع الحلول متصلة بالمفتاح m ، المتصل بمستشعر وحدة التدفق "الصغيرة". (ج) نظرة عامة على النظام بأكمله. الكمبيوتر (أعلى اليسار) متصل بصندوق الموائع الدقيقة (الموضح بجوار المخزن المؤقت وأنابيب العينة) ومقياس الكتلة الضوئي (أسفل اليمين) ، حيث توجد شريحة الموائع الدقيقة. يراقب جهاز مراقبة معدل التدفق الصغير (FRMS) التدفق عبر خط العينة ، بينما يراقب جهاز مراقبة معدل التدفق الكبير (FRML) تدفق المخزن المؤقت. تتصل أنابيب العينة والخط العازل بقناة على شريحة الموائع الدقيقة ، الموضوعة داخل مقياس الكتلة الضوئي. د: لكل شريحة ثلاث قنوات. يتم توصيل FRMS بمدخل العينة و FRML بمدخل المخزن المؤقت. منطقة الخلاط هي المكان الذي يحدث فيه التخفيف السريع للعينة ، في حين أن منطقة المراقبة هي المكان الذي يتم فيه إجراء قياسات القياس الضوئي الشامل. تتم مراقبة المخرج بواسطة مستشعر تدفق إضافي لضمان عدم وجود تسرب في الشريحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: برنامج التحكم في الموائع الدقيقة. باستخدام هذا البرنامج ، قم بتعيين ومراقبة معدلات التدفق وخطوط الضغط لنظام الموائع الدقيقة وموضع المفتاح المتعدد (m-switch). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد وجود فقاعات في الزيت. تظهر الأمثلة من برنامج الحصول على البيانات حلقة تركيز واضحة وغير منقطعة (يسار) وحلقة "مكسورة" ، مما يشير إلى وجود فقاعات هواء في زيت الغمر (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أمثلة تمثيلية لتركيزات العينات التي يكون فيها عدد أحداث هبوط الجزيء قليلا جدا أو مثاليا أو كثيرا جدا. ستظهر الجزيئات التي تهبط على سطح منطقة المراقبة في رقاقة الموائع الدقيقة كبقع داكنة في العرض النسبي لصورة القياس الضوئي الشامل. على النحو الأمثل ، يجب أن يتيح التركيز المطلوب كثافة مثالية لأحداث الهبوط أثناء الحصول على البيانات (الوسط). إذا كانت كثافة حدث الهبوط منخفضة جدا (أعلى ، "قليلة جدا") ، فلا يمكن إكمال التحليل الإحصائي الدقيق لبيانات القياس الضوئي الشامل. إذا كانت عالية جدا (القاع ، "كثيرة جدا") ، فسوف تتداخل جزيئات الهبوط مكانيا ، مما يؤدي إلى رداءة جودة البيانات. تم التقاط هذه الصور باستخدام برنامج الحصول على البيانات باستخدام مقياس ضوئي جماعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: لقطة شاشة لبرنامج تحليل البيانات للقياس الضوئي الشامل. هنا ، يمكن تحميل ملفات .mp المصدرة من برنامج الحصول على البيانات لتحليل البيانات. يمكن إنشاء الأرقام من البيانات المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: لقطة شاشة لمعايرة تباين الكتلة لهذه التجربة. كان المعايرة المستخدمة هي β-Amylase ، والتي من المعروف أنها تشكل ثلاثة أنواع: مونومر (56 كيلو دالتون) ، ديمر (112 كيلو دالتون) ، ورباعي (224 كيلو دالتون). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: لا تكشف المخططات التكرارية الكتلية عن التكوين المعقد إلا بعد التخفيف السريع للعينة. يتم عرض الرسوم البيانية للكتلة والتوزيعات الغاوسية الأكثر ملاءمة المقابلة لقياسات العينات التي تحتوي على IgG و FcRn بعد التخفيف اليدوي (البرتقالي) أو التخفيف السريع عبر نظام الموائع الدقيقةHC (الأزرق). تشير ملصقات الكتلة إلى أن القيم المتوسطة من منحنيات Gaussian تناسب الرسوم البيانية للكتلة المقاسة بعد التخفيف السريع. بعد التخفيف اليدوي ، لوحظت قمم مقابلة لمونومرات FcRn (52 كيلو دالتون ، كما تم قياسها بالتخفيف اليدوي) ومونومرات IgG (152 كيلو دالتون). بعد التخفيف السريع ، بالإضافة إلى مونومرات FcRn و IgG ، لوحظت بوضوح قمم مقابلة لثنائيات FcRn ومجمعات IgG-FcRn مع قياس متكافئ 1: 1 و 1: 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البيانات التكميلية الشكل 1: لا تظهر قياسات القياس الضوئي الشامل لعينات التحكم بعد التخفيف السريع أي تدهور للبروتين. (أ) الرسم البياني للكتلة والتوزيع الغاوسي الأنسب لعينة FcRn فقط. كان تركيز العينة الأولي قبل التخفيف السريع 20 ميكرومتر ، وتم ضبط معدل التدفق على 0.5 ميكرولتر / دقيقة. يمكن ملاحظة قمم الكتلة المقابلة لمونومرات FcRn (53 كيلو دالتون) وثنائيات FcRn (97 كيلو دالتون). (ب) الرسم البياني للكتلة والتوزيع الغاوسي الأنسب لعينة IgG (Herceptin) فقط. كان تركيز العينة الأولي قبل التخفيف السريع 2 ميكرومتر ، وتم ضبط معدل التدفق على 1 ميكرولتر / دقيقة. يمكن ملاحظة ذروة كتلة واحدة تقابل مونومر IgG (155 كيلو دالتون). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يوفر البروتوكول الموضح هنا طريقة للكشف عن التفاعلات البروتينية منخفضة التقارب وقياسها. يستخدم مقياس ضوئي كتلي مقترن بنظام الموائع الدقيقة سريع التخفيف. القياس الضوئي الشامل هو أداة تحليلية حيوية خالية من الملصقات يمكنها قياس الكتلة الجزيئية بشكل موثوق في محلول للجزيئات الحيوية16 ، لأولئك الذين يقعون في نطاق 30 كيلو دالتون إلى 6 ميجا فولت أمبير. نظرا لأن القياس الضوئي الشامل هو تقنية أحادية الجزيء تحلل العينات واحدة تلو الأخرى ، فإنها تقتصر عموما على العينات في نطاق تركيز 100 pM-100 nM. فوق هذا النطاق ، سوف تتداخل الجزيئات التي تهبط على السطح الزجاجي مكانيا ، مما يؤدي إلى رداءة جودة البيانات ؛ تحت هذا النطاق ، يتم الحصول على القليل جدا من البيانات لإجراء تحليل قوي7. والنتيجة المهمة هي أنه يمكن أن يقصر التحقيق في تفاعلات البروتين على تلك التي تشكل مزيجا من الأنواع المقيدة وغير المرتبطة ضمن هذا النطاق.

هنا ، قمنا بتفصيل بروتوكول خطوة بخطوة لاستخدام نظام الموائع الدقيقة للتخفيف السريع لتوسيع نطاق تركيزات العينات القابلة للقياس الضوئي الشامل بشكل فعال. من خلال تخفيف العينة على رقاقة الموائع الدقيقة ثم تدفقها عبر نافذة مراقبة الكاشف في غضون 50 مللي ثانية ، يلتقط النظام المعقدات الموجودة في العينة غير المخففة قبل أن يتحول توازن التفاعل. يتم تسليم العينة باستمرار إلى الكاشف أثناء القياسات الفردية. في ظل هذه الظروف ، سيبقى 95٪ من المجمع سليما عند قياس العينة ، حتى بالنسبة للتفاعلات منخفضة التقارب - مع KD بترتيب الأضراس الدقيقة ومعدلات التفكك بسرعة 1 s-1.

يمكن حساب ذلك على النحو التالي: بالنسبة للتفاعل Equation 1 بمعدل أمامي kfومعدل خلفي kb ،

Equation 2

عند الاتزان ، تظل تركيزات الأنواع الثلاثة (A و B و AB المركبة) ثابتة ، لذلك Equation 3 و Equation 4. في ظل الافتراض المحافظ بأن الاضطراب (التخفيف ، في هذه الحالة) قد يتسبب في تفكك المركب ، لكن رد الفعل الأمامي (الارتباط) لا يستمر ، يمكن التعامل مع المصطلح kf [A] [B] على أنه لا يكاد يذكر ، ويمكن إجراء التبسيط التالي:

Equation 6

يعطي التكامل التعبير التالي لتركيز المركب في الوقت المناسب بعد اضطراب التوازن:

Equation 7

جزء المركب الذي يظل مقيدا في الوقت t بعد اضطراب التوازن هو:

Equation 8

عند = 50 مللي ثانية ، للتفاعل مع kb≈ 1 s-1 ، يكون الكسر المرتبط 0.95 ، أو 95٪ 11,12.

تم استخدام القياس الضوئي الشامل هنا وسابقا5 للتحقيق في ارتباط الجسم المضاد أحادي النسيلة IgG trastuzumab بالمجال القابل للذوبان في FcRn. تم الإبلاغ عن ارتباط الشريكين الملزمين بتقارب نانوي عند الرقم الهيدروجينيالحمضي 17. تم استخدام القياس الضوئي الشامل لتقييم نوعي لوفرة المعقدات التي تشكلت بينما كان شركاء الربط عند الرقم الهيدروجيني 5.0 ، وتم تخفيف العينات بسرعة من خلال نظام الموائع الدقيقة الإضافي. تم تحسين الإجراء لتفاعل البروتين والبروتين المعين بناء على النتائج المبلغ عنهاسابقا 5. يمكن استخدام نفس الإجراء لدراسة التفاعلات الأخرى ، بشرط أن يكون لدى المستخدمين معرفة مسبقة أو تحسين الظروف التجريبية للنظام المعني ، مثل المخازن المؤقتة التي يجب استخدامها ، وتركيز البروتين الأولي ، والقياس الكيميائي المتوقع ، ومقدار الحضانة اللازمة للسماح للتفاعل بالوصول إلى التوازن.

عندما تم تخفيف خليط IgG-FcRn يدويا ، كان من الصعب اكتشاف وجود معقدات IgG-FcRn ، على الرغم من أنه من المعروف أن هذه البروتينات تتفاعل5. يوضح هذا البحث أن نهج التخفيف السريع يؤدي إلى زيادة ملحوظة في كمية هذه المعقدات. بالنسبة لنفس العينة ، عند استخدام التخفيف السريع ، تمت ملاحظة معقدات 1: 1 FcRn-IgG ومجمعات 2: 1 FcRn-IgG بوضوح. توضح هذه الاختلافات في التكوين المعقد أهمية دراسة أنظمة التفاعل الجزيئي الحيوي عبر مجموعة واسعة من التركيزات.

بالإضافة إلى ذلك ، توضح هذه النتائج أيضا أنه من السهل استخدام الموائع الدقيقة مع تحليل جزيء واحد لالتقاط التفاعلات الضعيفة - لسد فجوة كبيرة في الطريقة. يوفر الجمع بين الموائع الدقيقة للتخفيف السريع والقياس الضوئي الشامل مزايا جذابة بسبب مزايا القياس الضوئي الشامل كتقنية تحليلية. أي أن القياس الضوئي الشامل لا يتطلب ملصقات ، ويتضمن الحد الأدنى من تحضير العينة ، ويتم إجراء القياسات في المحلول. بالنسبة لهذا البروتوكول ، هناك ميزة رئيسية أخرى للقياس الضوئي الشامل وهي قدرته على تمييز وقياس جميع الأنواع المتكونة (بشرط أن يكون لها كتلة مميزة تبلغ >30 كيلو دالتون). هذا على عكس SPR ، على سبيل المثال ، الذي يمكنه قياس معدلات الارتباط وغير الربط ولكن لا يمكنه بسهولة توفير معلومات القياس الكيميائي8.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، بالإضافة إلى تجارب القياس الضوئي الشامل بشكل عام ، هناك العديد من الاعتبارات المفيدة. أولا ، يجب أن يكون تركيز البروتين النهائي ضمن حدود ما يمكن أن يقيسه القياس الضوئي الشامل (100 pM-100 nM). يجب أن يكون تركيز حضانة البداية أيضا ضمن نطاق نظام الموائع الدقيقة (حتى 90 ميكرومتر) ويفترض أن يكون أعلى من KD الفعلي للتفاعل10. نقطة البداية الموصى بها هي نسبة مزيج تركيز 1: 1 بين الأنواع المتفاعلة عند تركيز ميكرومتر. يمكن بعد ذلك تغيير النسبة إلى 1: 2 ، 1: 5 ، أو ، كما في حالة هذا التفاعل ، 1:10. إذا لم تكن هناك معلومات سابقة حول تفاعلات البروتين ، فسيتعين على المستخدم تحسين التجربة ، بدءا من تركيز عال (موصى به 20 ميكرومتر) لكل شريك لتحديد ما إذا كان تقارب المكونات ضمن نطاق التركيز الذي تدعمه الطريقة المقدمة (أي تتشكل المجمعات). قد يتضمن التحسين أيضا اختيار ظروف عازلة أخرى لتعزيز التفاعلات أو المعايرة بالتحليل الحجمي لأحد مكونات التفاعل لتحديد نسبة الخلط الصحيحة. بمجرد تحديد هذه ، من الممكن تحسين التركيزات والتدفقات للسماح بالظروف المثلى للدراسة والطريقة ، على سبيل المثال ، تقليل التركيزات للسماح بتحليل أفضل للذروة.

ثانيا ، لتكرار هذه التجربة بنجاح ، يجب تقليل الشوائب. تشمل المصادر الشائعة للشوائب المعروفة بتأثيرها السلبي على قياسات القياس الضوئي الشامل البروتينات الأخرى أو الحطام الخلوي الذي يبقى بعد التنقية ، والمخازن المؤقتة غير المفلترة ، والمنظفات المكونة للمذيلة (إذا كانت موجودة بتركيز عال جدا) ، والمخازن المؤقتة التي تحتوي على تركيزات عالية من الملح أو الجلسرين أو مكونات أخرى. كما نوقش في البروتوكول أعلاه ، يجب إزالة الفقاعات في نظام الموائع الدقيقة. يمكن أن تتشكل الفقاعات في نظام الأنابيب أو إذا كانت العينات ذات توتر سطحي مرتفع وعرضة لتشكيل الرغوة. يمكن أن تتشكل الفقاعات أيضا في زيت الغمر ، والتي يمكن اكتشافها من حلقة التركيز (الشكل 3). إذا تعذر إزالة الفقاعات باستخدام الخطوات الموضحة في البروتوكول ، فإن الحل الآخر هو إزالة الغاز من العينة باستخدام مجفف ومضخة تفريغ ، وترك العينة تحت ضغط منخفض لبضع دقائق. لا ينصح باستخدام دوامة أو هز محاليل البروتين عالية التركيز لأن هذه الإجراءات قد تعزز تكوين الفقاعة.

بينما يتم توضيح قياس تفاعل واحد محدد بين البروتين والبروتين هنا ، يمكن تطبيق نفس البروتوكول على أنظمة تفاعل البروتين والبروتين الأخرى دون تعديل كبير. وهناك اتجاه مستقبلي آخر لهذا البروتوكول هو استخدام القياسات لحساب قيم KD للمعقدات المحددة ، كما تم وصفه في مكان آخر في سياق القياس الضوئي للكتلة 5,7. بينما استخدمت الدراسات السابقة بيانات من التجارب التي تنطوي على التخفيف اليدوي والتفاعلات الأقوى ، يمكن تطبيق مبدأ التحليل بسهولة في هذا السياق - بشرط تنفيذ المزيد من التحسينات في جهاز الموائع الدقيقة (مثل زيادة دقة مستشعر التدفق واستقرار المضخة).

بالإضافة إلى تفاعلات البروتين والبروتين ، من المحتمل أن تكون هناك تطبيقات أوسع لنهج قياس الكتلة الضوئية المشترك ونهج الموائع الدقيقة للتخفيف السريع. يمكن استخدام القياس الضوئي الشامل لتقييم نقاء العينة وتجميعها وتجانسها18,19 ؛ دراسة قلة البروتين20 ، تجميع الجزيئاتالكبيرة 21 أو البلمرة22 ؛ وفي مناطق أخرى. يمتد تحليل القياس الضوئي الشامل أيضا إلى ما هو أبعد من البروتينات. تم استخدامه لدراسة التفاعلات بين الأحماض النووية والبروتينات23 والجسيمات الفيروسية24 والجسيمات النانوية25. وهكذا يصف هذا البروتوكول تطبيقا مهما لنظام الموائع الدقيقة للقياس الضوئي الشامل المشترك - فهو يتيح القياس المباشر للتفاعلات الضعيفة بين البروتين والبروتين على مستوى الجزيئات والمجمعات الفردية. قيمة التطبيق الحالي عالية ، لأنه يفتح إمكانية توصيف التفاعلات بشكل مباشر والتي كان من الصعب دراستها بشكل عام - مع أهميتها عبر المجالات العلاجية الحرجة. ويمكن أن يكون هذا النهج المشترك أيضا بمثابة أساس لمجموعة أوسع من التحقيقات للعينات ذات التركيزات التي تصل إلى عشرات الميكرومولات.

Disclosures

Myndert Claasen و Zornitsa Kofinova موظفان في شركة Refeyn Ltd ، التي تنتج مقياس الضوء الشامل ونظام الموائع الدقيقة المستخدم في هذه المقالة. ويستون سترو هو مساهم ومستشار لشركة Refeyn Ltd.

Acknowledgments

يتم دعم WS من قبل زمالة قادة المستقبل UKRI [MR / V02213X / 1]. تم إعداد نص المخطوطة ورسوماتها بدعم من أعضاء فريق الاتصالات العلمية في ريفين (باناجيوتا باجانوبولو ونيوس توريس تاماريت وكاثرين ليشتن). كما نعترف بالتعليقات القيمة من كاميل هيتيز وصوفيا فيريرا وماتياس لانغهورست.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol (Isopropanol) VWR International LLC 20880.320
Data acquisition software Refeyn AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software Refeyn DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag Sigma SRP0624
Herceptin (IgG)  Cambridge Bioscience HY-P9907-1mg
Mass photometer Refeyn TwoMP
Microfluidics box Refeyn MassFluidix HC system
Microfluidics chip Refeyn MassFluidix HC chip
Microfluidics control software Fluigent OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure VWR International LLC K812
Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma S2770
β-Amylase, from sweet potato Sigma A8781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
  2. Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  3. Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).
  4. Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
  5. Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
  6. Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).
  7. Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
  8. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  9. Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  10. Refeyn Ltd. MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. , https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023).
  11. Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  12. Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264 (2020).
  13. Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).
  14. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation. , https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022).
  15. Lai, S. -H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211 (2021).
  16. Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
  17. Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
  18. Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).
  19. Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
  20. Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
  21. Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
  22. Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).
  23. Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521 (2021).
  24. Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
  25. Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 203 ، علم الموائع الدقيقة ، قياس الضوء الشامل ، تفاعلات البروتين والبروتين منخفضة التقارب ، الأجسام المضادة IgG ، مستقبلات Fc الوليدية
تحليل تكوين مركب البروتين بتركيزات ميكرومولار عن طريق اقتران الموائع الدقيقة بالقياس الضوئي الشامل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino,… More

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino, M., Struwe, W. B. Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry. J. Vis. Exp. (203), e65772, doi:10.3791/65772 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter