Summary
Her etablerer vi en rottemodel af lacrimalkirteldysfunktion for at danne grundlag for undersøgelsen af vandige mangelfulde tørre øjne.
Abstract
Vandige tørre øjne (ADDE) er en type tørre øjne, der kan resultere i reduktion af tåresekretionsmængde og kvalitet. Langvarig unormal tåreproduktion kan føre til forstyrrelser i det okulære overflademiljø, herunder hornhindeskader og betændelse. I alvorlige tilfælde kan ADDE forårsage synstab eller endda blindhed. I øjeblikket er tørre øjne behandling begrænset til øjendråber eller fysioterapi, som kun kan lindre ubehag i øjet symptomer og ikke fundamentalt kan helbrede tørre øjne syndrom. For at genoprette funktionen af tårekirtlen i tørre øjne har vi skabt en dyremodel for lacrimalkirteldysfunktion hos rotter induceret af scopolamin. Gennem den omfattende evaluering af lacrimalkirtlen, hornhinden, bindehinderne og andre faktorer sigter vi mod at give en fuld forståelse af de patologiske ændringer af ADDE. Sammenlignet med den nuværende musemodel med tørre øjne inkluderer denne ADDE-dyremodel en funktionel evaluering af tårekirtlen, hvilket giver en bedre platform til at studere lacrimalkirteldysfunktion i ADDE.
Introduction
I 2021 er ca. 12% af mennesker betydeligt påvirket af tørre øjne1, hvilket gør det til en af de mest almindelige kroniske øjensygdomme. Tørre øjne kan opdeles i to typer: vandige tørre øjne (ADDE) og fordampende tørre øjne (EDE)2, afhængigt af de forskellige faktorer, der påvirker sygdommen. ADDE er yderligere opdelt i Sjögrens syndrom (SS) og ikke-SS, men størstedelen af tørre øjne patienter er ikke-SS patienter i klinisk3. Kroniske tørre øjensymptomer påvirker patienternes visuelle kvalitet alvorligt. I øjeblikket involverer den konventionelle behandling af DED anvendelse af kunstige tårer til smøring af øjenlågens okulære overflade og fysioterapi. Men, tørre øjne syndrom kan ikke tilbyde en fuldstændig kur i mange tilfælde. Derfor er det afgørende for udviklingen af nye terapier og lægemidler at studere patogenesen af tørre øjne. Dyremodeller af tørre øjne syndrom giver et grundlag for yderligere forskning.
Der er mange måder at konstruere dyremodeller af tørre øjne syndrom4, herunder ændring af tåresekretionsniveauer ved at ændre hormonniveauer. For eksempel kan fjernelse af testikler fra rotter reducere androgensekretion, øge tåresekretion og mindske koncentrationen af fri sekretorisk komponent (SC) og IgA i tårer 5,6. En anden metode er at indikere autoimmune reaktioner i lacrimalkirtlen ved at fjerne øjenoverfladenerverne, der styrer kirtlen. Derudover kan direkte reduktion af tåresekretion opnås ved kirurgisk fjernelse af lacrimalkirtlen7. Ændrede miljøforhold kan også fremskynde tårefordampning. For eksempel kan dyrkning af dyr i lav luftfugtighed og tørre ventilationsforhold etablere en model for overdreven fordampning af tørre øjne8, som kan kombineres med andre metoder til at øge sværhedsgraden af tørre øjne. De vigtigste lægemidler, der bruges til at fremkalde eksperimentelle modeller for tørre øjne, er atropin og scopolamin9. Som parasympatiske hæmmere kan begge inducere farmakologisk blokade af kolinerge (muskarine) receptorer i lacrimalkirtlen og hæmme tåresekretion. Sammenlignet med tørre øjne forårsaget af atropin muskelinjektion10 har scopolamin en stærkere hæmmende virkning på sekretionskirtler, en længere varighed af lægemiddelvirkning og svagere virkninger på hjerte-, små tarm- og bronchiale glatte muskler. Det er et af de mest modne lægemidler til dyremodeller med tørre øjne.
Forskellige metoder kan anvendes til at inducere tørre øjne med scopolamin, såsom subkutan injektion, lægemiddelpumpe eller plasterapplikation 4,11,12. For at reducere hyppigheden af lægemiddeladministration til forsøgsdyr anvender mange forskere transdermale plastre på musens haler eller bruger lægemiddelpumper. Begge disse metoder har dog begrænsninger. For eksempel skal absorptionen af depotplastre tage højde for den individuelle absorption af mus, hvilket kan føre til inkonsekvent lægemiddeldosering. Selvom lægemiddelpumper nøjagtigt kan kontrollere doseringen af hver administration, er de ikke altid kompatible med lægemidlet, der leveres, eller den koncentration, der anvendes. De skal også placeres kirurgisk - hvilket er mere invasivt for dyret, kræver en bedøvelseshændelse, og der er potentiale for postkirurgiske komplikationer såsom dehiscens. Subkutan injektion, selvom det er mere besværligt, kan sikre nøjagtig dosering for hver administration og opretholde konsistens i lægemiddeladministration blandt forskellige rotter. Samtidig har den en lavere pris og er egnet til at gennemføre et stort antal dyreforsøg.
Denne undersøgelse anvender gentagen subkutan injektion af scopolamin for at etablere en rottemodel med tørre øjne. Vi analyserer indikatorer for tørre øjne såsom hornhindedefekter, tåresekretionsniveauer og patologisk morfologi af hornhinden, bindehinden og lacrimalkirtlen. Ved at kombinere lægemiddelkoncentration, patologiske manifestationer og symptomer på tørre øjne uddyber vi rottemodellen yderligere i detaljer og giver mere nøjagtige eksperimentelle data til undersøgelse af behandling af tørre øjne og patologiske mekanismer. Vi beskriver også modelleringsprocessen i detaljer for fremtidige forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg, der udføres efter denne protokol, udføres under godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Tilberedning af dyr
- Forbered 12 sunde 6 uger gamle SPF Wistar hunrotter, der vejer 160 g ± 20 g.
- Brug en spaltelampe og oftalmoskop til at undersøge øjenforholdene hos alle rotter og sikre, at der ikke er noget forreste segment eller nethindesygdomme.
- Opdræt alle rotterne i 1 uge med tilstrækkelige føde- og vandkilder.
- Tilfældigt opdelt alle rotter i normale, scopolamin lægemiddelkoncentration 2,5 mg / ml, scopolamin lægemiddelkoncentration 5 mg / ml og scopolamin lægemiddelkoncentration 7,5 mg / ml grupper, med tre dyr i hver gruppe.
2. Forberedelse af opløsning
- Forbered scopolaminhydrobromid ved at opløse det i 0,9% natriumchloridopløsning til fremstilling af en opløsning med koncentrationer på 7,5 mg / ml, 5 mg / ml og 2,5 mg / ml.
- Der fremstilles en 0,9% natriumchloridopløsning uden scopolaminhydrobromid, der skal anvendes som injektion til kontrolgruppen af rotter.
3. Forberedelse af udstyr og materiale
- Forbered et lille dyremikroskop.
- Forbered materialer til forsøget, herunder 1 ml engangssprøjte med nål (26 G); fluorescein natriumoftalmiske strimler; Schirmer rive teststrimmel; absolut ethanol; 4% paraformaldehyd; Xylen; neutral balsam; hæmatoxylin, eosin; og periodisk syre-Schiff-farvningssæt.
4. Subkutan injektion
BEMÆRK: Denne procedure kræver hjælp fra en anden person til at hjælpe med at sikre rotterne.
- Hold rottens krop stabil og fang og stræk dens venstre (eller højre) bagben.
BEMÆRK: En assistent kan hjælpe med at holde dyret. - Rengør injektionsstedet med alkohol.
- Indsæt 1 ml engangssprøjte med kanyle (26 G) i bunden af hudfolden mellem tommelfinger og finger.
- Opsug sprøjten ved at trække sprøjtestemplet tilbage. Ethvert blod i sprøjten indikerer forkert nåleplacering; Fjern og flyt kanylen.
- Administrer 0,9% natriumchloridopløsning med eller uden scopolaminhydrobromid i en stabil, flydende bevægelse.
- Injicer alle rotter i henhold til forskellige koncentrationer, med 0,5 ml injiceret hver gang og fire gange dagligt (kl. 9:00, 12:00, 15:00 og 18:00) i en sammenhængende periode på 19 dage, skiftevis mellem venstre og højre ekstremitet.
BEMÆRK: Grupperne er navngivet som følger:
Gruppe uden scopolaminhydrobromid: 0 gruppe (kontrol)
Gruppe med scopolaminhydrobromid 2,5 mg/ml: 2,5 gruppe
Gruppe med scopolaminhydrobromid 5 mg/ml: 5 gruppe
Gruppe med scopolaminhydrobromid 7,5 mg/ml: 7,5 gruppe - Sæt dyret tilbage i buret og overvåg vejrtrækning og adfærd i 5-10 min.
5. Tåresekretionstest (Schirmer tåretest, STT)
- Opret en modificeret filterpapirstrimmel til rotter11. Skær halvdelen af filterpapirstrimlen, der bruges til mennesker, langs midterlinjen (1 mm × 15 mm), og trim strimlens hoved for at gøre det glat.
BEMÆRK: Før du udfører tåresekretionstesten, skal du manuelt fastholde rottens krop for at forhindre bevægelse og sikre eksponering af rottens øjne. - Placer filterpapirstrimlen på den ydre 1/3 af rottens nedre øjenlågs konjunktivalsæk.
- Tid testen i 5 min. Kontroller lukningen af rottens øjne under hele proceduren.
- Efter måling skal du bruge pincet til at klemme filterpapirstrimlen i et mikrocentrifugerør og registrere rivevolumenet ved at markere rørets væg.
- Mål tåresekretionen på dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 og dag 19.
6. Hornhindefluoresceinfarvning
- Drop 0,5 μL 0,5% fluoresceinnatriumopløsning i den nedre konjunktivalsæk hos hver rotte.
- Overhold hornhinden under blåt lys i 3 minutter efter fluoresceininstillation.
- Registrer fluorescensfarvningen af hver rottes hornhinde og observer, om der er en hornhindedefekt.
- Udfør hornhindefluoresceinfarvning på dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 og dag 19.
7. Histologisk observation af konjunktivvæv
- Efter endt modeludvikling bedøves rotterne dybt med en intraperitoneal injektion på 0,4 ml/100 g 10% vandig chloralhydrat for at lindre dyrenes spændinger. Derefter aflives rotterne ved cervikal dislokation.
- Tag bulbar conjunctiva fra de samme regioner af hver rotte, med en størrelse på ca. 2 mm x 2 mm.
- Fastgør vævene straks i 4% paraformaldehyd i 24 timer og indlejr i paraffin13.
- Skær sektioner med en tykkelse på 5 μm og pletter med hæmatoxylin og eosin (HE)14 og periodisk syre-Schiff (PAS) plet (følg producentens anvisninger).
8. Histologisk observation af hornhinde- og lacrimalkirtelvæv
- Når modeludviklingen er afsluttet, aflives rotten som beskrevet i trin 7.1.
- Tag hornhinden på højre side af hver rotte og fastgør den straks i 4% paraformaldehydopløsning.
- Skær cephalic epidermis og subkutant væv langs linjen, der forbinder øret og det ydre hjørne af øjet, udvid snittet til begge sider og isoler yderligere den gullige ekstra orbitalkirtel.
- Fjern rottens pels grundigt og adskil den ekstraorbitale kirtel med 0,9% natriumchloridopløsning.
- Anbring de isolerede ekstraorbitale kirtler i 4% paraformaldehydopløsning i 24 timer og indlejr i paraffin.
- Skær kontinuerlige sektioner med ~ 5 μm tykkelse og pletter dem med HE til hornhinde og ekstraorbitale kirtelvævsprøver.
9. Statistisk analyse
- Brug passende software til statistisk analyse af dataene.
- Udfør envejsanalyse af varians (ANOVA) for at analysere dataene og LSD-testen (least significant difference) til sammenligning mellem grupper. Indstil det statistiske signifikansniveau til α = 0,05, hvor P < 0,05 angiver statistisk signifikans.
BEMÆRK: SPSS 20-software blev brugt til statistisk analyse af eksperimentelle data.
- Udfør envejsanalyse af varians (ANOVA) for at analysere dataene og LSD-testen (least significant difference) til sammenligning mellem grupper. Indstil det statistiske signifikansniveau til α = 0,05, hvor P < 0,05 angiver statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schirmer I test, SIT I
Rotternes tårevolumen blev målt på dag 0, 3, 5, 7, 11, 15 og 19 efter forsøgets start. De eksperimentelle resultater viste, at tåresekretionen af scopolamingruppen (2,5 gruppe, 5 gruppe, 7,5 gruppe) sammenlignet med kontrolgruppen (0-gruppen) var signifikant reduceret, og forskellen var statistisk signifikant (P < 0,01). Der var ingen statistisk signifikans mellem 2,5-gruppen, 5-gruppen og 7,5-gruppen (P > 0,05). Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem de forskellige grupper med hensyn til antallet af dage (P > 0,05) (figur 1, tabel 1).
Hornhinde fluorescein farvning
Hornhindefluoresceinfarvning blev udført på dag 0, 3, 5, 7, 11, 15 og 19 i eksperimentet. Resultaterne viste, at der ikke var nogen hornhindefluoresceinfarvning i nogen gruppe, hvilket indikerer, at der ikke blev dannet nogen åbenlyse hornhindepiteldefekter under det 20-dages eksperiment med forskellige koncentrationer af scopolaminlægemidler (figur 2).
Patologisk analyse af hornhindepitel
Efter forsøget blev hornhindevæv fra hver rotte indsamlet til HE-farvning for at observere hornhindepithelets morfologi og måle tykkelsen af hornhindeepitellaget. Kontrolgruppens hornhindepitel var sammensat af 4-6 lag ordnede epitelceller, blandt hvilke basallaget bestod af et enkelt lag af søjleepitelceller arrangeret pænt og tæt. Hornhindepitelet i scopolamingrupperne 2,5, 5 og 7 var signifikant tyndere end kontrolgruppen med flad og atrofisk cellemorfologi og uordnet cellestruktur. I gruppe 7.5 var der en løs intercellulær forbindelse og vakuolær struktur i basallaget (angivet med den røde pil i figur 3). Sammenlignet med hornhindepitelet af scopolamingrupper viste hornhindepitelet i den normale kontrolgruppe statistiske forskelle i tykkelsen af hornhindepitellaget (figur 4).
Patologisk analyse af lacrimalkirtel
Hovedkirtlen til tåresekretion hos rotter er den eksorbitale lacrimalkirtel15. Ved observation af lacrimalkirtelskiver blev ændringer i morfologien af lacrimalkirtelepitelcellerne observeret med stigningen i scopolaminkoncentrationen ledsaget af inflammation og vævsødem. Der blev ikke observeret sådanne ændringer i kontrolgruppen. Patologiresultaterne tyder på, at inflammatoriske ændringer i lacrimalkirtlen, celleødem og atrofi af kirtelepitelcellerne kan anvendes som indikatorer for funktionel skade på lacrimalkirtlen16 (tabel 2). Disse indikatorer kan bruges til at måle sværhedsgraden af tørre øjne i forhold til mængden af tåresekretion (figur 5).
Analyse af konjunktivfarvningsresultater
Strukturen af bindehinden i kontrolgruppen er komplet, hovedsageligt sammensat af overfladelaget og lamina propria. Overfladelaget er laminerede søjleformede epitelceller, glatte og komplette, med mikrovilli på celleoverfladen. Spredte bægerceller var til stede mellem epitelcellerne med stort cellevolumen og slimhindegranulat i cellecytoplasmaet. Overfladelaget af konjunktivepitelet i de tre scopolaminlægemiddelgrupper var signifikant tyndere, antallet af mikrovilli- og bægerceller blev reduceret, cellearrangementstrukturen var ufuldstændig, ledsaget af ødem og en lille mængde inflammatoriske celler som observeret i HE-farvning (figur 6).
Ved farvning af bindehinden med PAS blev det gennemsnitlige antal bægerceller pr. 40x mikroskopisk felt i tre uafhængige prøver af hver mus beregnet og udtrykt som gennemsnit ± SD (figur 7).
Figur 1: Statistik over Schirmer-testværdien i hver gruppe (mm) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fluoresceinnatriumfarvning af rottehornhinde. I det 20-dages forsøg med fluoresceinnatrium blev der ikke observeret positive fund i hornhinderne hos alle rotter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Hornhindepitelfarvning og tykkelsesmåling. I gruppe 7.5 var der løs intercellulær forbindelse og vakuolær struktur i basallaget (angivet med den røde pil) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Statistik over hornhindepiteltykkelse i hver gruppe. Sammenlignet med hornhindepitelet af scopolamingrupper viste hornhindepitelet i den normale kontrolgruppe statistiske forskelle i tykkelsen af hornhindepiteletlaget. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: HE-farvningsresultater af rotters eksorbitale lacrimalkirtel. (A) Gruppe 0: I synsfeltet viste lacrimalkirtler lobulær struktur og var sammensat af kanaler og rørformede kirtler uden åbenlyse abnormiteter i kanalernes morfologi, mens de rørformede kirtler var sammensat af kegleformede kirtelceller med rigelige slimhindestoffer i cytoplasmaet, Intet tydeligt ødem i bindevæv, ingen åbenlyse abnormiteter i interstitielle blodkar og ingen åbenlys nekrose og inflammatorisk celleinfiltration. (B) Gruppe 2.5: I synsfeltet observeres lejlighedsvis atrofi af lacrimalkirtelepitelcellerne med reduceret volumen, uregelmæssigt formede dilaterede kirtelhulrum og reduceret mucinøst stof i hulrummet (angivet med den røde pil). Der er også lejlighedsvis infiltration af frie lymfocytter i stroma (angivet med den blå pil), men der observeres ingen åbenlyse abnormiteter i kanalmorfologien eller tegn på ødem. (C) Gruppe 5: I synsfeltet blev lacrimale epitelceller lejlighedsvis atrofieret og reduceret i størrelse, kirtelhulen blev forstørret, slimhindesubstansen i hulrummet blev reduceret (rød pil), og fri lymfocytinfiltration blev lejlighedsvis observeret i stroma (blå pil), og der observeres ingen åbenlyse abnormiteter i kanalmorfologi eller bindevævsødem mellem lacrimalkirtellobula. D) Gruppe 7.5: Ødem kan ses i synsfeltet; afstanden mellem lacrimalkirtlerne udvides, og arrangementet er uregelmæssigt (grøn pil), lacrimalkirtlernes epitelceller er ofte atrofierede, volumenet bliver mindre, og formen er uregelmæssig (gul pil), lejlighedsvis forstørres kirtelhulen, slimhinden i hulrummet reduceres (rød pil), lejlighedsvis infiltreres den frie lymfocyt (blå pil), uden tilsyneladende abnormiteter i kanalmorfologi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: HE-farvning af rottebindehinden. Sammenlignet med kontrolgruppens konjunktivepitel viste alle tre grupper af scopolamin-medicineret konjunktivepitel varierende grader af strukturel skade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: PAS-farvning af bindehinden. (A) Normale kontrolrotter. B) rotter med scopolamingruppe. (C) Bægercelletæthed i hver gruppe (20x). Sort bjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Schirmer I-test, SIT(middelværdi, enhed [mm]) | |||||||
| Gruppe | 0 dage | 3 dage | 5 dage | 7 dage | 11 dage | 15 dage | 19 dage |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabel 1: Schirmer-test af rotter i de fire grupper på forskellige tidspunkter (mm). Efter påføring af medicin faldt udskillelsen af tårer hos rotter signifikant.
| Tal | Nekrose | Betændelse | Ødem | Epitelatrofi |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7,5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7,5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7,5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabel 2: Patologisk vævsscore hos rotter lacrimalkirtel. Scoringskriterier: 0: Under normale forhold, i betragtning af faktorer som dyrets alder, køn og stamme, anses vævet for normalt;
1: De observerede ændringer har lige overskredet det normale interval; 2: Læsioner kan observeres, men de er endnu ikke alvorlige; 3: Læsioner er tydelige og fortsætter med at forværres; 4: Læsioner er ekstremt alvorlige og har påvirket hele vævet16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vandige tørre øjne (ADDE) er en vigtig type tørre øjne, der tegner sig for ca. 1/3 af den samlede population af tørre øjne17, og hovedårsagen til ADDE er lacrimalkirtel patologisk skade og betændelse13. For denne type tørre øjne er de mest almindelige kliniske behandlingsmetoder kunstige tårer for at lindre symptomer eller topisk anvendelse af steroider eller cyclosporin18, mens der er få behandlingsmuligheder for skade på lacrimalkirtlen. Derfor er det meget vigtigt at undersøge virkningen af rekonstruktion af lacrimalkirtelfunktion på tørre øjne og etablere en dyremodel for lacrimalkirteldysfunktion. Vi brugte en metode til gentagen anvendelse af medicin til at undertrykke udskillelsen af lacrimalkirtlen hos rotter og skabte en kronisk lacrimalkirteldysfunktion tørre øjne dyremodel.
Vi valgte rotter til at konstruere denne tørre øjemodel, som har flere fordele sammenlignet med andre dyremodeller19. For eksempel har kaniner en større kropsstørrelse og kræver flere doser medicin eller hyppigere injektioner for at opnå den ønskede effekt. Desuden er kaniner lidt dyrere, hvilket betyder flere omkostninger til eksperimentet. Mus er også almindeligt anvendt i oftalmisk forskning, men de bruges generelt til at konstruere Sjögrens syndrom modeller20. Disse modeller fokuserer på at sammenligne organbetændelse og lymfocytinfiltration for at udforske de immunpatologiske mekanismer. Mus har små kropsstørrelser, kompleks lacrimalkirtelanatomi og lav tåresekretion, hvilket gør det vanskeligt at nøjagtigt afspejle tåreproduktion. Rottedyrmodellen er en mere egnet tør øjenmodel, da den giver mulighed for bekvemme lægemiddelinjektioner, har relativt enkle fodringsbetingelser, er velegnet til både kliniske og eksperimentelle undersøgelser og også har fordele med hensyn til omkostninger. Det er en god dyremodel for ADDE.
Vi anvendte den kolinerge receptorblokker scopolamin til at hæmme de kolinerge receptorer i rottens krop, reducere lacrimalkirtelsekretionen og ændre den patologiske struktur af lacrimalkirtelceller, som fundamentalt simulerer tilstanden af lacrimalkirtler hos patienter med tørre øjne. Sammenlignet med andre metoder simulerer denne tilgang bedre den beskadigede tilstand af lacrimalkirtler i naturlig tilstand. Andre metoder, såsom anvendelse af benzalkoniumchlorid øjendråber21 eller ændring af ydre forhold, såsom reduktion af fugtighed og øget okulær overfladefordampning 4,8, forstyrrer kun det okulære overflademiljø og ændrer ikke lacrimalkirtlens funktionelle tilstand. Derfor er de ikke egnede til langsigtede, kroniske tørre øjenlidelser.
Ved måling af sekretionsvolumen af tårer hos rotter forbedrede vi Schirmer-tåreteststrimlerne. Først skærer vi den tårestrimmel, der bruges af mennesker langs midterlinjen. Derefter trimmede vi toppen til en rund bueform og foldede den forsigtigt tilbage øverst for at lette indsættelsen i rottens nedre konjunktivalsæk. Det skal bemærkes, at rotter er aktive og vanskelige at måle tårer i 5 minutter. Efter at have indsat Schirmer-tårestrimlen i rottens nedre konjunktivalsæk, lukkede vi manuelt rottens øjne for at øge deres komfort og undgå at kæmpe under den lange måling af tårer, hvilket kan påvirke måleresultaterne.
Mens man ekstraherer lacrimalkirtlen, er det først nødvendigt at lokalisere det. Pointen med lacrimalkirtellokalisering er midtpunktet mellem forsiden af øret og det indre canthus. Skær derefter hudvævet under pelsen, hvilket minimerer indtrængen af fragmenteret pels og reducerer håndteringsprocessen i det senere stadium. Under ekstraktionsprocessen er det også vigtigt at rydde op i den fragmenterede pels rettidigt. Især når du adskiller lacrimalkirtlen, skal du bruge fosfatbufret saltvand (PBS) eller saltvand til gentagne gange at skylle og undgå blanding med andre væv, der kan påvirke sektionsresultaterne.
Fordelen ved den udviklede dyremodel for tørre øjne er, at protokollen korrelerede forskellige lægemiddelkoncentrationer med forskellige grader af lacrimalkirtelskade. Dette giver et eksperimentelt grundlag for undersøgelsen af behandlingen af lacrimalkirteldysfunktion. Vi har raffineret nogle af de operationelle trin i modelleringsprocessen for at give mere detaljerede referencematerialer til en forsker. Derudover har vi tilføjet analyseindikatorer for dyremodellen med tørre øjne, der inkorporerer morfologiske indikatorer for hornhinden, bindehinden og lacrimalkirtlen, tæller konjunktivalceller og scorer graden af tårekirtelskade. Vi evaluerede lacrimalkirtelfunktion fra betændelse, ødem og atrofi. Vi har valgt de mest omfattende, omkostningseffektive og nøjagtige analysemetoder til at afspejle graden af tørre øjne og lacrimalkirteldysfunktion.
Vores metode har dog også visse begrænsninger. På grund af den langvarige proces med at konstruere dyremodeller skal eksperimenter injicere gentagne gange. Selvom der i øjeblikket er nogle metoder til at erstatte manuelle injektioner, såsom lægemiddelpumper eller depotplastre, er der stadig nogle komplikationer i deres anvendelse. Hvordan man anvender bedre metoder til at reducere hyppigheden af medicin, undgå forekomsten af komplikationer og sikre nøjagtigheden af doseringen er vores næste mål. Afslutningsvis har vi forbedret en dyremodel med tørre øjne forårsaget af scopolamininjektion, hvilket giver et eksperimentelt grundlag for forskning i lacrimalkirteldysfunktion i ADDE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen potentielle interessekonflikter relateret til de lægemidler og materialer, der anvendes i denne procedure.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) og Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
