Summary
यहां, हम जलीय कमी वाली सूखी आंख के अध्ययन के लिए एक आधार प्रदान करने के लिए लैक्रिमल ग्रंथि की शिथिलता का एक चूहा मॉडल स्थापित करते हैं।
Abstract
जलीय कमी वाली सूखी आंख (एडीडीई) एक प्रकार की सूखी आंख की बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप आंसू स्राव मात्रा और गुणवत्ता में कमी आ सकती है। लंबे समय तक असामान्य आंसू उत्पादन से कॉर्नियल क्षति और सूजन सहित ओकुलर सतह के वातावरण में गड़बड़ी हो सकती है। गंभीर मामलों में, ADDE दृष्टि हानि या अंधापन का कारण बन सकता है। वर्तमान में, सूखी आंख का उपचार आंखों की बूंदों या भौतिक चिकित्सा तक सीमित है, जो केवल आंखों की असुविधा के लक्षणों को कम कर सकता है और मूल रूप से सूखी आंख सिंड्रोम का इलाज नहीं कर सकता है। सूखी आंखों में लैक्रिमल ग्रंथि के कार्य को बहाल करने के लिए, हमने स्कोपोलामाइन द्वारा प्रेरित चूहों में लैक्रिमल ग्रंथि की शिथिलता का एक पशु मॉडल बनाया है। लैक्रिमल ग्रंथि, कॉर्निया, कंजंक्टिवस और अन्य कारकों के व्यापक मूल्यांकन के माध्यम से, हमारा उद्देश्य एडीडीई के रोग परिवर्तनों की पूरी समझ प्रदान करना है। वर्तमान सूखी आंख माउस मॉडल की तुलना में, इस एडीडीई पशु मॉडल में लैक्रिमल ग्रंथि का एक कार्यात्मक मूल्यांकन शामिल है, जो एडीडीई में लैक्रिमल ग्रंथि की शिथिलता का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर मंच प्रदान करता है।
Introduction
2021 तक, लगभग 12% लोग सूखी आंखोंसे काफी प्रभावित होते हैं, 1, जिससे यह सबसे आम पुरानी आंखों की बीमारियों में से एक बन जाता है। सूखी आंख को दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: जलीय-कमी वाली सूखी आंख (एडीडीई) और बाष्पीकरणीय सूखी आंख (ईडीई) 2, रोग को प्रभावित करने वाले विभिन्न कारकों के आधार पर। ADDE को आगे Sjögren के सिंड्रोम (SS) और गैर-SS में विभाजित किया गया है, लेकिन अधिकांश शुष्क आंख के रोगी नैदानिक3 में गैर-SS रोगी हैं। पुरानी सूखी आंख के लक्षण रोगियों की दृश्य गुणवत्ता को गंभीरता से प्रभावित करते हैं। वर्तमान में, डीईडी के पारंपरिक उपचार में नेत्र सतह और पलकों की भौतिक चिकित्सा को चिकनाई करने के लिए कृत्रिम आँसू का अनुप्रयोग शामिल है। हालांकि, सूखी आंख सिंड्रोम कई मामलों में पूर्ण इलाज की पेशकश नहीं कर सकता है। इसलिए, शुष्क आंख रोग के रोगजनन का अध्ययन नए उपचारों और दवाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। सूखी आंख सिंड्रोम के पशु मॉडल आगे के शोध के लिए एक आधार प्रदान करते हैं।
सूखी आंख सिंड्रोम4 के पशु मॉडल बनाने के कई तरीके हैं, जिसमें हार्मोन के स्तर को बदलकर आंसू स्राव के स्तर को बदलना शामिल है। उदाहरण के लिए, चूहों के वृषण को हटाने एण्ड्रोजन स्राव को कम कर सकते हैं, आंसू स्राव में वृद्धि, और आँसू 5,6 में मुक्त स्रावी घटक (अनुसूचित जाति) और आईजीए की एकाग्रता में कमी. एक अन्य विधि ग्रंथि को नियंत्रित करने वाली आंख की सतह की नसों को हटाकर लैक्रिमल ग्रंथि में ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाओं को इंगित करना है। इसके अतिरिक्त, सीधे आंसू स्राव को कम करने शल्य चिकित्सा लैक्रिमल ग्रंथि7 को हटाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. पर्यावरणीय परिस्थितियों को बदलने से आंसू वाष्पीकरण में भी तेजी आ सकती है। उदाहरण के लिए, कम आर्द्रता और शुष्क वेंटिलेशन की स्थिति में जानवरों की खेती अत्यधिक बाष्पीकरणीय सूखी आंख8 का एक मॉडल स्थापित कर सकती है, जिसे सूखी आंख की गंभीरता को बढ़ाने के लिए अन्य तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है। सूखी आंख प्रयोगात्मक मॉडल प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया मुख्य दवाओं atropine और scopolamine9 हैं. पैरासिम्पेथेटिक इनहिबिटर के रूप में, दोनों लैक्रिमल ग्रंथि में कोलीनर्जिक (मस्करीनिक) रिसेप्टर्स के औषधीय नाकाबंदी को प्रेरित कर सकते हैं और आंसू स्राव को रोक सकते हैं। एट्रोपिन मांसपेशी इंजेक्शन10 के कारण सूखी आंखों की तुलना में, स्कोपोलामाइन का स्राव ग्रंथियों पर एक मजबूत निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है, दवा की कार्रवाई की लंबी अवधि, और हृदय, छोटे आंतों और ब्रोन्कियल चिकनी मांसपेशियों पर कमजोर प्रभाव। यह सूखी आंखों के पशु मॉडल के लिए सबसे परिपक्व दवाओं में से एक है।
विभिन्न तरीकों का उपयोग स्कोपोलामाइन के साथ सूखी आंख को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे चमड़े के नीचे इंजेक्शन, दवा पंप, या पैच आवेदन 4,11,12. प्रयोगात्मक जानवरों को दवा प्रशासन की आवृत्ति को कम करने के लिए, कई शोधकर्ता चूहों की पूंछ पर ट्रांसडर्मल पैच लागू करते हैं या दवा पंपों का उपयोग करते हैं। हालाँकि, इन दोनों विधियों की सीमाएँ हैं। उदाहरण के लिए, ट्रांसडर्मल पैच के अवशोषण को चूहों के व्यक्तिगत अवशोषण को ध्यान में रखना होगा, जिससे असंगत दवा की खुराक हो सकती है। हालांकि दवा पंप प्रत्येक प्रशासन की खुराक को सटीक रूप से नियंत्रित कर सकते हैं, वे हमेशा दवा वितरित किए जाने या उपयोग की जा रही एकाग्रता के साथ संगत नहीं होते हैं। उन्हें शल्य चिकित्सा द्वारा भी रखा जाना चाहिए - जो जानवर के लिए अधिक आक्रामक है, एक संवेदनाहारी घटना की आवश्यकता होती है, और शल्य चिकित्सा के बाद की जटिलताओं जैसे स्फुटन की संभावना होती है। चमड़े के नीचे इंजेक्शन, हालांकि अधिक बोझिल, प्रत्येक प्रशासन के लिए सटीक खुराक सुनिश्चित कर सकता है और विभिन्न चूहों के बीच दवा प्रशासन में स्थिरता बनाए रख सकता है। इसी समय, इसकी लागत कम है और बड़ी संख्या में पशु प्रयोगों के संचालन के लिए उपयुक्त है।
यह अध्ययन सूखी आंख चूहे के मॉडल को स्थापित करने के लिए स्कोपोलामाइन के बार-बार चमड़े के नीचे इंजेक्शन लागू करता है। हम शुष्क आंख संकेतकों जैसे कॉर्नियल दोष, आंसू स्राव के स्तर और कॉर्निया, कंजाक्तिवा और लैक्रिमल ग्रंथि के रोग आकृति विज्ञान का विश्लेषण करते हैं। दवा एकाग्रता, रोग संबंधी अभिव्यक्तियों और सूखी आंख के लक्षणों के संयोजन से, हम सूखी आंख चूहे के मॉडल पर विस्तार से बताते हैं, शुष्क आंख उपचार और रोग तंत्र के अध्ययन के लिए अधिक सटीक प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करते हैं। हम भविष्य के शोधकर्ताओं के लिए मॉडलिंग प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन भी करते हैं।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल के बाद किए गए सभी पशु प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुमोदन के तहत किया जाता है.
1. पशु तैयारी
- 12 स्वस्थ 6 सप्ताह पुराने एसपीएफ़ विस्टार मादा चूहों को 160 ग्राम ± 20 ग्राम वजन तैयार करें।
- सभी चूहों की आंखों की स्थिति की जांच करने के लिए एक भट्ठा दीपक और नेत्र स्कोप का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करना कि कोई पूर्वकाल खंड या रेटिना रोग नहीं हैं।
- पर्याप्त भोजन और पानी के स्रोतों के साथ 1 सप्ताह के लिए सभी चूहों उठाओ.
- बेतरतीब ढंग से सभी चूहों को सामान्य, स्कोपोलामाइन दवा एकाग्रता 2.5 मिलीग्राम / एमएल, स्कोपोलामाइन दवा एकाग्रता 5 मिलीग्राम / एमएल, और स्कोपोलामाइन दवा एकाग्रता 7.5 मिलीग्राम / एमएल समूहों में विभाजित किया गया है, प्रत्येक समूह में तीन जानवरों के साथ।
2. समाधान की तैयारी
- 7.5 मिलीग्राम / एमएल, 5 मिलीग्राम / एमएल, और 2.5 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता के साथ एक समाधान बनाने के लिए 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में भंग करके स्कोपोलामाइन हाइड्रोब्रोमाइड तैयार करें।
- चूहों के नियंत्रण समूह के लिए इंजेक्शन के रूप में उपयोग किए जाने वाले स्कोपोलामाइन हाइड्रोब्रोमाइड के बिना 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान तैयार करें।
3. उपकरण और सामग्री तैयार करना
- एक छोटे से पशु माइक्रोस्कोप तैयार करें.
- प्रयोग के लिए सामग्री तैयार करें, जिसमें सुई के साथ 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज (26 ग्राम) शामिल है; फ्लोरेसिन सोडियम नेत्र स्ट्रिप्स; शिमर आंसू परीक्षण पट्टी; पूर्ण इथेनॉल; 4% पैराफॉर्मलडिहाइड; ज़ाइलीन; तटस्थ बाल्सम; हेमेटोक्सिलिन, ईोसिन; और आवधिक एसिड-शिफ धुंधला किट।
4. चमड़े के नीचे इंजेक्शन
नोट: इस प्रक्रिया चूहों को सुरक्षित करने में मदद करने के लिए एक दूसरे व्यक्ति से सहायता की आवश्यकता है.
- चूहे के शरीर को स्थिर रखें और पकड़ें और उसके बाएं (या दाएं) हिंद पैरों को फैलाएं।
नोट: एक सहायक जानवर को पकड़ने में मदद कर सकता है। - शराब के साथ साफ इंजेक्शन साइट।
- अंगूठे और उंगली के बीच त्वचा गुना के आधार पर सुई (26 ग्राम) के साथ 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज डालें.
- सिरिंज सवार वापस खींचकर सिरिंज महाप्राण. सिरिंज में कोई भी रक्त अनुचित सुई प्लेसमेंट को इंगित करता है; निकालें और सुई reposition.
- एक स्थिर, द्रव गति में स्कोपोलामाइन हाइड्रोब्रोमाइड के साथ या बिना 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान का प्रशासन करें।
- 0.5 एमएल इंजेक्शन हर बार और चार बार दैनिक (9:00 पर, 12:00, 15:00, और 18:00) 19 दिनों की एक लगातार अवधि के लिए, छोड़ दिया और सही अंगों के बीच बारी-बारी से विभिन्न सांद्रता के अनुसार सभी चूहों इंजेक्षन.
नोट:: समूह निम्नानुसार नाम हैं:
स्कोपोलामाइन हाइड्रोब्रोमाइड के बिना समूह: 0 समूह (नियंत्रण)
स्कोपोलामाइन हाइड्रोब्रोमाइड के साथ समूह 2.5 मिलीग्राम / एमएल: 2.5 समूह
स्कोपोलामाइन हाइड्रोब्रोमाइड के साथ समूह 5 मिलीग्राम / एमएल: 5 समूह
स्कोपोलामाइन हाइड्रोब्रोमाइड के साथ समूह 7.5 मिलीग्राम / एमएल: 7.5 समूह - अपने पिंजरे में पशु लौटें और 5-10 मिनट के लिए श्वास और व्यवहार की निगरानी.
5. आंसू स्राव परीक्षण (शिमर आंसू परीक्षण, एसटीटी)
- चूहों11 के लिए एक संशोधित फिल्टर पेपर पट्टी बनाएँ. सेंटरलाइन (1 मिमी × 15 मिमी) के साथ मनुष्यों के लिए उपयोग की जाने वाली फिल्टर पेपर पट्टी का आधा हिस्सा काटें, और इसे चिकना बनाने के लिए पट्टी के सिर को ट्रिम करें।
नोट: आंसू स्राव परीक्षण आयोजित करने से पहले, मैन्युअल रूप से आंदोलन को रोकने और चूहे की आंखों के जोखिम को सुनिश्चित करने के लिए चूहे के शरीर को रोकना। - चूहे की निचली पलक नेत्रश्लेष्मला थैली के बाहरी 1/3 पर फिल्टर पेपर पट्टी रखें.
- 5 मिनट के लिए परीक्षण समय. प्रक्रिया के दौरान चूहे की आंखों के बंद होने को नियंत्रित करें।
- मापने के बाद, एक microcentrifuge ट्यूब में फिल्टर पेपर पट्टी जकड़ना और ट्यूब की दीवार पर एक निशान बनाने के द्वारा आंसू मात्रा रिकॉर्ड चिमटी का उपयोग करें.
- दिन 0, दिन 1, दिन 3, दिन 5, दिन 7, दिन 11, दिन 15 और दिन 19 पर आंसू स्राव को मापें।
6. कॉर्नियल फ्लोरेसिन धुंधला हो जाना
- प्रत्येक चूहे के अवर नेत्रश्लेष्मला थैली में 0.5% फ्लोरेसिन सोडियम समाधान के 0.5 माइक्रोन ड्रॉप करें।
- फ्लोरेसिन टपकाने के बाद 3 मिनट के लिए नीली रोशनी के तहत कॉर्निया का निरीक्षण करें।
- प्रत्येक चूहे के कॉर्निया की प्रतिदीप्ति धुंधला रिकॉर्ड और वहाँ एक कॉर्नियल दोष है कि क्या निरीक्षण करें.
- दिन 0, दिन 1, दिन 3, दिन 5, दिन 7, दिन 11, दिन 15, और दिन 19 पर कॉर्नियल फ्लोरेसिन धुंधला प्रदर्शन करें।
7. नेत्रश्लेष्मला ऊतक का हिस्टोलॉजिकल अवलोकन
- मॉडल विकास को पूरा करने के बाद, जानवरों के तनाव को कम करने के लिए चूहों को 0.4 एमएल/100 ग्राम 10% जलीय क्लोरल हाइड्रेट के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ गहराई से संवेदनाहारी करें। फिर, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें।
- प्रत्येक चूहे के एक ही क्षेत्रों से बल्बर कंजाक्तिवा ले लो, लगभग 2 मिमी x 2 मिमी के आकार के साथ.
- 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तुरंत ऊतकों को ठीक करें और पैराफिन13 में एम्बेड करें।
- 5 माइक्रोन मोटाई वर्गों को काटें और हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एचई)14 और आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) दाग (निर्माता के निर्देशों का पालन करें) के साथ दाग दें।
8. कॉर्नियल और लैक्रिमल ग्रंथि ऊतक का हिस्टोलॉजिकल अवलोकन
- मॉडल विकास को पूरा करने के बाद, चूहे को इच्छामृत्यु के रूप में चरण 7.1 में वर्णित किया गया है।
- प्रत्येक चूहे के दाईं ओर कॉर्निया ले लो और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में तुरंत इसे ठीक करें।
- कान और आंख के बाहरी कोने को जोड़ने वाली रेखा के साथ सेफेलिक एपिडर्मिस और चमड़े के नीचे के ऊतक को काटें, चीरा को दोनों तरफ फैलाएं और आगे पीले अतिरिक्त कक्षीय ग्रंथि को अलग करें।
- चूहे के फर को अच्छी तरह से हटा दें और 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ एक्स्ट्राऑर्बिटल ग्रंथि को अलग करें।
- 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान में पृथक एक्स्ट्राऑर्बिटल ग्रंथियों को रखें और पैराफिन में एम्बेड करें।
- ~ 5 माइक्रोन मोटाई के निरंतर वर्गों में कटौती और उन्हें कॉर्नियल और extraorbital ग्रंथि ऊतक नमूनों के लिए एचई के साथ दाग.
9. सांख्यिकीय विश्लेषण
- डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
- डेटा का विश्लेषण करने के लिए विचरण (एनोवा) का एक तरफ़ा विश्लेषण करें और समूहों के बीच तुलना के लिए कम से कम महत्वपूर्ण अंतर (एलएसडी) परीक्षण करें। सांख्यिकीय महत्व स्तर को α = 0.05 पर सेट करें, जिसमें पी < 0.05 सांख्यिकीय महत्व दर्शाता है।
नोट: एसपीएसएस 20 सॉफ्टवेयर प्रयोगात्मक डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था।
- डेटा का विश्लेषण करने के लिए विचरण (एनोवा) का एक तरफ़ा विश्लेषण करें और समूहों के बीच तुलना के लिए कम से कम महत्वपूर्ण अंतर (एलएसडी) परीक्षण करें। सांख्यिकीय महत्व स्तर को α = 0.05 पर सेट करें, जिसमें पी < 0.05 सांख्यिकीय महत्व दर्शाता है।
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Representative Results
शिमर I परीक्षण, SIT I
चूहों के आंसू मात्रा 0, 3, 5, 7, 11, 15, और प्रयोग की शुरुआत के बाद 19 दिन पर मापा गया था. प्रयोगात्मक परिणामों से पता चला है कि नियंत्रण समूह (0 समूह) की तुलना में स्कोपोलामाइन समूह (2.5 समूह, 5 समूह, 7.5 समूह) के आंसू स्राव में काफी कमी आई थी, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.01)। 2.5 समूह, 5 समूह और 7.5 समूह (पी > 0.05) के बीच कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं था। दिनों की संख्या (पी > 0.05) (चित्रा 1, तालिका 1) के संदर्भ में विभिन्न समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था।
कॉर्नियल फ्लोरेसिन धुंधला हो जाना
कॉर्नियल फ्लोरेसिन धुंधला दिन 0, 3, 5, 7, 11, 15, और प्रयोग के 19 पर प्रदर्शन किया गया था. परिणामों से पता चला कि किसी भी समूह में कोई कॉर्नियल फ्लोरेसिन धुंधला नहीं था, यह दर्शाता है कि स्कोपोलामाइन दवाओं (चित्रा 2)के विभिन्न सांद्रता के साथ 20-दिवसीय प्रयोग के दौरान कोई स्पष्ट कॉर्नियल उपकला दोष नहीं बनाया गया था।
कॉर्नियल एपिथेलियम का पैथोलॉजिकल विश्लेषण
प्रयोग के बाद, प्रत्येक चूहे से कॉर्नियल ऊतकों को कॉर्नियल एपिथेलियम की आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने और कॉर्नियल उपकला परत की मोटाई को मापने के लिए एचई धुंधला के लिए एकत्र किया गया था। नियंत्रण समूह का कॉर्नियल एपिथेलियम व्यवस्थित रूप से व्यवस्थित उपकला कोशिकाओं की 4-6 परतों से बना था, जिसके बीच बेसल परत में स्तंभ उपकला कोशिकाओं की एक परत शामिल थी जो बड़े करीने से और बारीकी से व्यवस्थित होती थी। स्कोपोलामाइन समूह 2.5, 5, और 7 के कॉर्नियल एपिथेलियम नियंत्रण समूह की तुलना में काफी पतले थे, चपटा और एट्रोफिक सेल आकृति विज्ञान और अव्यवस्थित कोशिका संरचना के साथ। समूह 7.5 में, बेसल परत में एक ढीला अंतरकोशिकीय कनेक्शन और रिक्तिका संरचना थी ( चित्र 3 में लाल तीर द्वारा इंगित)। स्कोपोलामाइन समूहों के कॉर्नियल उपकला की तुलना में, सामान्य नियंत्रण समूह के कॉर्नियल उपकला ने कॉर्नियल उपकला परत(चित्रा 4)की मोटाई में सांख्यिकीय अंतर दिखाया।
लैक्रिमल ग्रंथि का पैथोलॉजिकल विश्लेषण
चूहों में आंसू स्राव के लिए मुख्य ग्रंथि extrorbital lacrimal ग्रंथि15 है. लैक्रिमल ग्रंथि स्लाइस का अवलोकन करते समय, लैक्रिमल ग्रंथि उपकला कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में परिवर्तन स्कोपोलामाइन एकाग्रता की वृद्धि के साथ मनाया गया, सूजन और ऊतक एडिमा के साथ। नियंत्रण समूह में ऐसा कोई परिवर्तन नहीं देखा गया। पैथोलॉजी के परिणाम बताते हैं कि लैक्रिमल ग्रंथि, सेल एडिमा और ग्रंथियों के उपकला कोशिकाओं के शोष के भड़काऊ परिवर्तनों का उपयोग लैक्रिमल ग्रंथि16 (तालिका 2)के कार्यात्मक क्षति के संकेतक के रूप में किया जा सकता है। इन संकेतकों आंसू स्राव (चित्रा 5) की मात्रा के संबंध में सूखी आंख की गंभीरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
नेत्रश्लेष्मला धुंधला परिणामों का विश्लेषण
नियंत्रण समूह में कंजाक्तिवा की संरचना पूरी हो गई है, मुख्य रूप से सतह परत और लैमिना प्रोप्रिया से बना है। सतह परत टुकड़े टुकड़े स्तंभ उपकला कोशिकाओं है, चिकनी और पूर्ण, सेल की सतह पर माइक्रोविली के साथ. सेल साइटोप्लाज्म में बड़ी कोशिका मात्रा और श्लेष्म कणिकाओं के साथ उपकला कोशिकाओं के बीच बिखरे हुए गॉब्लेट कोशिकाएं मौजूद थीं। तीन स्कोपोलामाइन दवा समूहों में नेत्रश्लेष्मला उपकला की सतह परत काफी पतली थी, माइक्रोविली और गॉब्लेट कोशिकाओं की संख्या कम हो गई थी, सेल व्यवस्था संरचना अधूरी थी, एडिमा के साथ, और एचई धुंधला (चित्रा 6) में देखी गई भड़काऊ कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा।
पीएएस के साथ कंजाक्तिवा को धुंधला करके, प्रत्येक माउस के तीन स्वतंत्र नमूनों में 40x सूक्ष्म क्षेत्र प्रति गॉब्लेट कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना की गई और एसडी (चित्रा 7)± मतलब के रूप में व्यक्त किया गया।
चित्रा 1: प्रत्येक समूह (मिमी) में शिमर परीक्षण मूल्य के आंकड़े कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: चूहे कॉर्निया के फ्लोरेसिन सोडियम धुंधला। फ्लोरेसिन सोडियम के साथ 20-दिवसीय प्रयोग में, सभी चूहों के कॉर्निया में कोई सकारात्मक निष्कर्ष नहीं देखा गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: कॉर्नियल उपकला धुंधला और मोटाई माप। समूह 7.5 में, बेसल परत में ढीले अंतरकोशिकीय कनेक्शन और रिक्तिका संरचना थी (लाल तीर द्वारा इंगित) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: प्रत्येक समूह में कॉर्नियल उपकला मोटाई के आंकड़े। स्कोपोलामाइन समूहों के कॉर्नियल उपकला की तुलना में, सामान्य नियंत्रण समूह के कॉर्नियल उपकला ने कॉर्नियल उपकला परत की मोटाई में सांख्यिकीय अंतर दिखाया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: चूहों के extrorbital lacrimal ग्रंथि के परिणाम धुंधला (ए) समूह 0: दृश्य क्षेत्र में, लैक्रिमल ग्रंथियों ने लोबुलर संरचना दिखाई और नलिकाओं और ट्यूबलर ग्रंथियों से बने थे, नलिकाओं की आकृति विज्ञान में कोई स्पष्ट असामान्यता नहीं थी, जबकि ट्यूबलर ग्रंथियां साइटोप्लाज्म में प्रचुर मात्रा में श्लेष्म पदार्थों के साथ शंकु के आकार की ग्रंथियों से बनी थीं, संयोजी ऊतकों में कोई स्पष्ट एडिमा नहीं, अंतरालीय रक्त वाहिकाओं में कोई स्पष्ट असामान्यताएं नहीं, और कोई स्पष्ट परिगलन और भड़काऊ सेल घुसपैठ नहीं। (बी) समूह 2.5: दृश्य क्षेत्र में, लैक्रिमल ग्रंथि उपकला कोशिकाओं के सामयिक शोष मनाया जाता है, कम मात्रा के साथ, अनियमित आकार का पतला ग्रंथियों गुहाओं, और गुहा के भीतर कम श्लेष्म पदार्थ (लाल तीर द्वारा इंगित). स्ट्रोमा में मुक्त लिम्फोसाइटों की कभी-कभी घुसपैठ भी होती है (नीले तीर द्वारा इंगित), लेकिन वाहिनी आकृति विज्ञान या एडिमा के संकेतों में कोई स्पष्ट असामान्यताएं नहीं देखी जाती हैं। (सी) समूह 5: दृश्य क्षेत्र में, लैक्रिमल उपकला कोशिकाओं को कभी-कभी एट्रोफाइड किया जाता था और आकार में कम किया जाता था, ग्रंथियों की गुहा को बढ़ाया गया था, गुहा में श्लेष्म पदार्थ कम हो गया था (लाल तीर), और मुक्त लिम्फोसाइट घुसपैठ कभी-कभी स्ट्रोमा (नीला तीर) में मनाया जाता था, और लैक्रिमल ग्रंथि लोब्यूल के बीच वाहिनी आकृति विज्ञान या संयोजी ऊतक शोफ में कोई स्पष्ट असामान्यताएं नहीं देखी जाती हैं। (घ) समूह 7ण्5: दृश्य क्षेत्र में शोफ को देखा जा सकता है; लैक्रिमल ग्रंथियों के बीच की दूरी चौड़ी हो जाती है, और व्यवस्था अनियमित (हरा तीर) होती है, लैक्रिमल ग्रंथियों की उपकला कोशिकाएं अक्सर एट्रोफाइड होती हैं, मात्रा छोटी हो जाती है, और आकार अनियमित होता है (पीला तीर), कभी-कभी ग्रंथि गुहा बढ़ जाती है, गुहा में श्लेष्म पदार्थ कम हो जाता है (लाल तीर), कभी-कभी मुक्त लिम्फोसाइट घुसपैठ (नीला तीर), वाहिनी आकृति विज्ञान में कोई स्पष्ट असामान्यता नहीं है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: वह चूहे कंजाक्तिवा के धुंधला हो जाना. नियंत्रण समूह के नेत्रश्लेष्मला उपकला की तुलना में, स्कोपोलामाइन-मेडिकेटेड कंजंक्टिवल एपिथेलियम के सभी तीन समूहों ने संरचनात्मक क्षति की अलग-अलग डिग्री दिखाई। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: कंजाक्तिवा के पीएएस धुंधला हो जाना। (ए) सामान्य नियंत्रण चूहों. (बी) स्कोपोलामाइन समूह चूहों। (सी) प्रत्येक समूह (20x) में गॉब्लेट सेल घनत्व। काली पट्टी = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| शिमर I परीक्षण, SIT(औसत मूल्य, इकाई [मिमी]) | |||||||
| समूह | 0 दिन | 3 दिन | 5 दिन | 7 दिन | 11 दिन | 15 दिन | 19 दिन |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
तालिका 1: अलग-अलग समय बिंदुओं (मिमी) पर चार समूहों में चूहों का शिमर परीक्षण। दवा लगाने के बाद, चूहों में आँसू का स्राव काफी कम हो गया।
| संख्या | परिगलन | सूजन | सूजन | उपकला शोष |
| 0 जीआरपी-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 जीआरपी -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 जीआरपी -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 जीआरपी -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 जीआरपी -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 जीआरपी -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 जीआरपी -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 जीआरपी -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 जीआरपी -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 जीआरपी -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 जीआरपी -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 जीआरपी -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
तालिका 2: चूहे लैक्रिमल ग्रंथि के पैथोलॉजिकल ऊतक स्कोर। स्कोरिंग मानदंड: 0: सामान्य परिस्थितियों में, पशु आयु, लिंग और तनाव जैसे कारकों पर विचार करते हुए, ऊतक को सामान्य माना जाता है;
1: देखे गए परिवर्तन सामान्य सीमा से अधिक हो गए हैं; घावों को देखा जा सकता है, लेकिन वे अभी तक गंभीर नहीं हैं; घाव स्पष्ट हैं और खराब होते रहते हैं; 4: घाव बेहद गंभीर हैं और पूरे ऊतक16 को प्रभावित किया है.
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Discussion
जलीय कमी सूखी आंख (ADDE) सूखी आंख का एक महत्वपूर्ण प्रकार है, कुल सूखी आंख आबादी17 के बारे में 1/3 के लिए लेखांकन, और ADDE के मुख्य कारण लैक्रिमल ग्रंथि रोग क्षति और सूजन13 है. इस प्रकार की सूखी आंख के लिए, सबसे आम नैदानिक उपचार विधियां स्टेरॉयड या साइक्लोस्पोरिन18 के लक्षणों या सामयिक अनुप्रयोग को कम करने के लिए कृत्रिम आँसू हैं, जबकि लैक्रिमल ग्रंथि को नुकसान के लिए कुछ उपचार विकल्प हैं। इसलिए, सूखी आंख पर लैक्रिमल ग्रंथि समारोह पुनर्निर्माण के प्रभाव का पता लगाना और लैक्रिमल ग्रंथि की शिथिलता का एक पशु मॉडल स्थापित करना बहुत महत्वपूर्ण है। हमने चूहों में लैक्रिमल ग्रंथि के स्राव को दबाने के लिए दवा के बार-बार आवेदन की एक विधि का उपयोग किया और एक पुरानी लैक्रिमल ग्रंथि शिथिलता सूखी आंख पशु मॉडल बनाया।
हम चूहों को चुना इस सूखी आंख मॉडल, जो अन्य पशु मॉडल19 की तुलना में अधिक फायदे है का निर्माण करने के लिए. उदाहरण के लिए, खरगोशों के शरीर का आकार बड़ा होता है और वांछित प्रभाव प्राप्त करने के लिए दवा की अधिक खुराक या अधिक लगातार इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, खरगोश थोड़े अधिक महंगे हैं, जिसका अर्थ है प्रयोग के लिए अधिक लागत। चूहे भी आमतौर पर नेत्र अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, लेकिन वे आम तौर पर Sjögren सिंड्रोम मॉडल20 के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है. ये मॉडल इम्यूनोपैथोलॉजिकल तंत्र का पता लगाने के लिए अंग सूजन और लिम्फोसाइट घुसपैठ की तुलना करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। चूहे में छोटे शरीर के आकार, जटिल लैक्रिमल ग्रंथि शरीर रचना विज्ञान और कम आंसू स्राव होता है, जिससे आंसू उत्पादन को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करना मुश्किल हो जाता है। चूहा पशु मॉडल एक अधिक उपयुक्त सूखी आंख मॉडल है क्योंकि यह सुविधाजनक दवा इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है, इसमें अपेक्षाकृत सरल भोजन की स्थिति होती है, नैदानिक और प्रयोगात्मक अध्ययन दोनों के लिए उपयुक्त है, और लागत के मामले में भी फायदे हैं। यह ADDE के लिए एक अच्छा पशु मॉडल है।
हमने चूहे के शरीर में कोलीनर्जिक रिसेप्टर्स को बाधित करने के लिए कोलीनर्जिक रिसेप्टर ब्लॉकर स्कोपोलामाइन लागू किया, लैक्रिमल ग्रंथि स्राव को कम किया और लैक्रिमल ग्रंथि कोशिकाओं की रोग संरचना को बदल दिया, जो मूल रूप से शुष्क आंख रोगियों में लैक्रिमल ग्रंथियों की स्थिति का अनुकरण करता है। अन्य तरीकों की तुलना में, यह दृष्टिकोण प्राकृतिक अवस्था में लैक्रिमल ग्रंथियों की क्षतिग्रस्त स्थिति का बेहतर अनुकरण करता है। अन्य तरीकों, इस तरह के बेंजालकोनियम क्लोराइड आंख बूँदें21 का उपयोग कर या इस तरह के आर्द्रता को कम करने और नेत्र सतह वाष्पीकरण 4,8 में वृद्धि के रूप में बाहरी स्थितियों को बदलने, केवल नेत्र सतह पर्यावरण को बाधित और लैक्रिमल ग्रंथि के कार्यात्मक राज्य में परिवर्तन नहीं करते. इसलिए, वे दीर्घकालिक, पुरानी सूखी आंख की स्थिति के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
चूहों में आँसू के स्राव की मात्रा को मापने में, हमने शिमर आंसू परीक्षण स्ट्रिप्स में सुधार किया। सबसे पहले, हमने केंद्र रेखा के साथ मनुष्यों द्वारा उपयोग की जाने वाली आंसू परीक्षण पट्टी को काट दिया। फिर, हमने शीर्ष को एक गोल चाप आकार में छंटनी की और चूहे के निचले नेत्रश्लेष्मला थैली में आसान सम्मिलन की सुविधा के लिए धीरे से इसे शीर्ष पर वापस मोड़ दिया। यह चूहों सक्रिय हैं, और 5 मिनट के लिए आँसू को मापने के लिए मुश्किल है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. चूहे के निचले नेत्रश्लेष्मला थैली में शिमर आंसू परीक्षण पट्टी डालने के बाद, हमने मैन्युअल रूप से चूहे की आंखों को बंद कर दिया ताकि उनके आराम को बढ़ाया जा सके और आँसू के लंबे माप के दौरान संघर्ष करने से बचा जा सके, जो माप परिणामों को प्रभावित कर सकता है।
लैक्रिमल ग्रंथि को निकालते समय, पहले इसका पता लगाना आवश्यक है। लैक्रिमल ग्रंथि स्थानीयकरण का बिंदु कान के सामने और आंतरिक कैंथस के बीच का मध्य बिंदु है। फिर, फर के नीचे त्वचा के ऊतकों को काटें, खंडित फर के प्रवेश को कम करें और बाद के चरण में हैंडलिंग प्रक्रिया को कम करें। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, खंडित फर को समय पर साफ करना भी महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से जब लैक्रिमल ग्रंथि को अलग करना, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) या खारा का उपयोग बार-बार कुल्ला करने के लिए करें और अन्य ऊतकों के साथ मिश्रण से बचें जो सेक्शनिंग परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं।
विकसित सूखी आंख पशु मॉडल का लाभ यह है कि प्रोटोकॉल लैक्रिमल ग्रंथि की चोट के विभिन्न डिग्री के साथ विभिन्न दवा सांद्रता सहसंबद्ध है। यह लैक्रिमल ग्रंथि की शिथिलता के उपचार के अध्ययन के लिए एक प्रयोगात्मक आधार प्रदान करता है। हमने एक शोधकर्ता के लिए अधिक विस्तृत संदर्भ सामग्री प्रदान करने के लिए मॉडलिंग प्रक्रिया में कुछ परिचालन चरणों को परिष्कृत किया है। इसके अलावा, हमने सूखी आंख पशु मॉडल के लिए विश्लेषण संकेतक जोड़े हैं, कॉर्निया, कंजाक्तिवा और लैक्रिमल ग्रंथि के रूपात्मक संकेतकों को शामिल करते हुए, नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं की गिनती करते हैं, और लैक्रिमल ग्रंथि की चोट की डिग्री स्कोर करते हैं। हमने सूजन, एडिमा और शोष से लैक्रिमल ग्रंथि समारोह का मूल्यांकन किया। हमने सूखी आंख और लैक्रिमल ग्रंथि की शिथिलता की डिग्री को प्रतिबिंबित करने के लिए सबसे व्यापक, लागत प्रभावी और सटीक विश्लेषण विधियों को चुना है।
हालाँकि, हमारी विधि की कुछ सीमाएँ भी हैं। पशु मॉडल के निर्माण की लंबी प्रक्रिया के कारण, प्रयोगकर्ताओं को बार-बार इंजेक्शन लगाने की आवश्यकता होती है। यद्यपि वर्तमान में मैनुअल इंजेक्शन को बदलने के लिए कुछ तरीके हैं, जैसे कि दवा पंप या ट्रांसडर्मल पैच, उनके उपयोग में अभी भी कुछ जटिलताएं हैं। दवा की आवृत्ति को कम करने के लिए बेहतर तरीकों को कैसे लागू करें, जटिलताओं की घटना से बचें, और खुराक की सटीकता सुनिश्चित करें कि हमारा अगला लक्ष्य है। अंत में, हमने स्कोपोलामाइन इंजेक्शन के कारण एक सूखी आंख पशु मॉडल में सुधार किया है, जो एडीडीई में लैक्रिमल ग्रंथि की शिथिलता पर शोध के लिए एक प्रयोगात्मक आधार प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास इस प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली दवाओं और सामग्रियों से संबंधित ब्याज का कोई संभावित संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को गुआंग्डोंग प्रांतीय उच्च-स्तरीय नैदानिक कुंजी विशिष्टताओं (SZGSP014) और शेन्ज़ेन प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (JCYJ20210324125805012) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
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