Summary
В данной работе мы устанавливаем модель дисфункции слезных желез на крысах, чтобы обеспечить основу для изучения синдрома сухого глаза с дефицитом водянистой жидкости.
Abstract
Синдром сухого глаза с дефицитом воды (СДВГ) — это тип синдрома сухого глаза, который может привести к снижению количества и качества слезной секреции. Длительная аномальная выработка слезы может привести к нарушению среды глазной поверхности, включая повреждение роговицы и воспаление. В тяжелых случаях СДВП может привести к потере зрения или даже слепоте. В настоящее время лечение синдрома сухого глаза ограничивается глазными каплями или физиотерапией, которые могут только облегчить симптомы дискомфорта в глазах и не могут фундаментально вылечить синдром сухого глаза. Для восстановления функции слезной железы при синдроме сухого глаза мы создали животную модель дисфункции слезных желез у крыс, индуцированных скополамином. С помощью комплексной оценки слезной железы, роговицы, конъюнктивы и других факторов мы стремимся обеспечить полное понимание патологических изменений СДВГ. По сравнению с текущей моделью мышей с синдромом сухого глаза, эта животная модель ADDE включает функциональную оценку слезной железы, обеспечивая лучшую платформу для изучения дисфункции слезных желез при СДВ.
Introduction
К 2021 году примерно 12% людей страдают от синдрома сухогоглаза1, что делает его одним из наиболее распространенных хронических заболеваний глаз. Синдром сухого глаза можно разделить на два типа: синдром сухого глаза с дефицитом воды (ADDE) и испаряющийся синдром сухого глаза (EDE)2, в зависимости от различных факторов, влияющих на заболевание. СДДП подразделяется на синдром Шегрена (СС) и не-СС, но большинство пациентов с синдромом сухого глаза не являются пациентами с синдромом СС в клинике3. Хронические симптомы сухого глаза серьезно влияют на качество зрения пациентов. В настоящее время традиционное лечение DED включает в себя применение искусственных слез для смазывания глазной поверхности и физиотерапию век. Тем не менее, синдром сухого глаза не может предложить полного излечения во многих случаях. Поэтому изучение патогенеза синдрома сухого глаза имеет решающее значение для разработки новых методов лечения и лекарств. Животные модели синдрома сухого глаза обеспечивают основу для дальнейших исследований.
Существует множество способов построения животных моделей синдрома сухого глаза4, включая изменение уровня слезоотделения путем изменения уровня гормонов. Например, удаление семенников крыс может снижать секрецию андрогенов, увеличивать слезную секрецию, снижать концентрацию свободного секреторного компонента (СК) и IgA в слезах 5,6. Другой метод заключается в выявлении аутоиммунных реакций в слезной железе путем удаления поверхностных нервов глаза, которые контролируют железу. Кроме того, непосредственное уменьшение секреции слезы может быть достигнуто путем хирургического удаления слезной железы7. Изменяющиеся условия окружающей среды также могут ускорить испарение слезы. Например, культивирование животных в условиях низкой влажности и сухой вентиляции позволяет создать модель чрезмерной испарительной сухости глаз8, которую можно комбинировать с другими методами для увеличения тяжести синдрома сухого глаза. Основными препаратами, используемыми для индуцирования синдрома сухого глаза, являются атропин и скополамин9. В качестве парасимпатических ингибиторов оба могут индуцировать фармакологическую блокаду холинергических (мускариновых) рецепторов в слезной железе и ингибировать секрецию слезы. По сравнению с сухостью глаз, вызванной мышечной инъекцией атропина10, скополамин оказывает более сильное ингибирующее действие на железы секреции, более длительную продолжительность действия препарата и более слабое воздействие на гладкую мускулатуру сердца, тонкой кишки и бронхов. Это один из самых зрелых препаратов для животных с синдромом сухого глаза.
Для индуцирования синдрома сухого глаза скополамином могут использоваться различные методы, такие как подкожная инъекция, лекарственная помпа или наложение пластыря 4,11,12. Для того, чтобы снизить частоту введения препарата экспериментальным животным, многие исследователи накладывают трансдермальные пластыри на хвосты мышей или используют лекарственные насосы. Однако оба этих метода имеют ограничения. Например, при рассасывании трансдермальных пластырей необходимо учитывать индивидуальную абсорбцию мышей, что может привести к непостоянной дозировке препарата. Несмотря на то, что лекарственные насосы могут точно контролировать дозировку каждого введения, они не всегда совместимы с доставляемым препаратом или используемой концентрацией. Они также должны быть размещены хирургическим путем, что является более инвазивным для животного, требует анестезии и может привести к послеоперационным осложнениям, таким как расхождение швов. Подкожная инъекция, хотя и более громоздкая, может обеспечить точную дозировку для каждого введения и поддерживать последовательность при введении препарата у разных крыс. При этом он имеет меньшую стоимость и подходит для проведения большого количества экспериментов на животных.
В этом исследовании применяется повторная подкожная инъекция скополамина для создания модели сухого глаза крысы. Мы анализируем такие показатели сухого глаза, как дефекты роговицы, уровень слезосекреции и патологическая морфология роговицы, конъюнктивы и слезной железы. Комбинируя концентрацию препарата, патологические проявления и симптомы синдрома сухого глаза, мы детально развиваем модель крыс с синдромом сухого глаза, предоставляя более точные экспериментальные данные для изучения лечения синдрома сухого глаза и патологических механизмов. Мы также подробно опишем процесс моделирования для будущих исследователей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных, проводимые в соответствии с этим протоколом, проводятся с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).
1. Подготовка животных
- Подготовьте 12 здоровых 6-недельных крыс SPF Wistar весом 160 г ± 20 г.
- Используйте щелевую лампу и офтальмоскоп для изучения состояния глаз всех крыс, чтобы убедиться в отсутствии заболеваний переднего сегмента или сетчатки.
- Выращивайте всех крыс в течение 1 недели с достаточным количеством пищи и воды.
- Случайным образом разделили всех крыс на группы с нормальной концентрацией препарата скополамин 2,5 мг/мл, концентрацией препарата скополамин 5 мг/мл и концентрацией препарата скополамина 7,5 мг/мл, по три животных в каждой группе.
2. Приготовление раствора
- Приготовьте скополамина гидробромид, растворив его в 0,9% растворе натрия хлорида, чтобы получить раствор с концентрациями 7,5 мг/мл, 5 мг/мл и 2,5 мг/мл.
- Готовят 0,9% раствор натрия хлорида без скополамина гидробромида для использования в качестве инъекций для контрольной группы крыс.
3. Подготовка оборудования и материалов
- Подготовьте микроскоп для маленьких животных.
- Подготовьте материалы для эксперимента, в том числе одноразовый шприц с иглой объемом 1 мл (26 г); флуоресцеиновые натриевые офтальмологические полоски; тест-полоска Ширмера на разрыв; абсолютный этанол; 4% параформальдегида; ксилол; нейтральный бальзам; гематоксилин, эозин; и набор периодического кислотного окрашивания по Шиффу.
4. Подкожная инъекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура требует помощи второго человека, чтобы помочь обезопасить крыс.
- Держите тело крысы устойчиво, поймайте и вытяните ее левые (или правые) задние лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помощник может помочь в удержании животного. - Место инъекции промыть спиртом.
- Ввести одноразовый шприц с иглой объемом 1 мл (26 G) в основание кожной складки между большим и указательным пальцами.
- Аспирируйте шприц, оттянув поршень шприца назад. Любая кровь в шприце указывает на неправильное размещение иглы; Снимите и переместите иглу.
- Вводят 0,9% раствор натрия хлорида с гидробромидом скополамина или без него равномерным плавным движением.
- Вводите всем крысам в соответствии с различными концентрациями, по 0,5 мл каждый раз и четыре раза в день (в 9:00, 12:00, 15:00 и 18:00) в течение последовательного периода в течение 19 дней, чередуя левую и правую конечности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Группы называются следующим образом:
Группа без скополамина гидробромида: 0 группа (контроль)
Группа со скополамином гидробромидом 2,5 мг/мл: 2,5 группа
Группа со скополамина гидробромидом 5 мг/мл: 5 группа
Группа со скополамином гидробромидом 7,5 мг/мл: 7,5 группа - Верните животное в клетку и понаблюдайте за дыханием и поведением в течение 5-10 минут.
5. Тест на слезную секрецию (слезный тест Ширмера, STT)
- Создайте модифицированную полоску фильтровальной бумаги для крыс11. Отрежьте половину полоски фильтровальной бумаги, используемой для людей, вдоль центральной линии (1 мм × 15 мм) и обрежьте головку полоски, чтобы сделать ее гладкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением теста на слезную секрецию вручную удерживайте тело крысы, чтобы предотвратить движение и обеспечить воздействие на глаза крысы. - Поместите полоску фильтровальной бумаги на внешнюю 1/3 конъюнктивального мешка нижнего века крысы.
- Засекайте время проведения теста в течение 5 минут. Контролируйте закрытие глаз крысы на протяжении всей процедуры.
- После измерения с помощью пинцета зажмите полоску фильтровальной бумаги в микроцентрифужной пробирке и запишите объем слезы, сделав отметку на стенке пробирки.
- Измерьте секрецию слезы на день 0, день 1, день 3, день 5, день 7, день 11, день 15 и день 19.
6. Флуоресцеиновое окрашивание роговицы
- Капните 0,5 мкл 0,5% раствора флуоресцеина натрия в нижний конъюнктивальный мешок каждой крысы.
- Наблюдайте за роговицей в синем свете в течение 3 минут после инстилляции флуоресцеина.
- Запишите флуоресцентное окрашивание роговицы каждой крысы и понаблюдайте за тем, есть ли дефект роговицы.
- Выполняйте окрашивание роговицы флуоресцеином на день 0, день 1, день 3, день 5, день 7, день 11, день 15 и день 19.
7. Гистологическое исследование ткани конъюнктивы
- После завершения разработки модели глубоко обезболивайте крыс внутрибрюшинной инъекцией 0,4 мл/100 г 10% водного хлоралгидрата, чтобы снять напряжение у животных. Затем усыпляют крыс вывихом шейки матки.
- Возьмите бульбарную конъюнктиву из одних и тех же областей каждой крысы, размером примерно 2 мм х 2 мм.
- Ткани немедленно фиксируют в 4% параформальдегиде на 24 ч и заделывают в парафин13.
- Отрежьте участки толщиной 5 мкм и покрасьте гематоксилином и эозином (HE)14 и периодической кислотой-красителем Шиффа (PAS) (следуйте инструкциям производителя).
8. Гистологическое исследование ткани роговицы и слезных желез
- После завершения разработки модели усыпьте крысу, как описано в шаге 7.1.
- Возьмите роговицу с правой стороны каждой крысы и сразу же зафиксируйте ее в 4% растворе параформальдегида.
- Разрежьте эпидермис головки и подкожную клетчатку по линии, соединяющей ухо и наружный угол глаза, расширьте разрез в обе стороны и дополнительно изолируйте желтоватую доорбитальную железу.
- Тщательно удалите шерсть крысы и отделите заглазничную железу 0,9% раствором натрия хлорида.
- Изолированные внеглазничные железы помещают в 4% раствор параформальдегида на 24 ч и встраивают в парафин.
- Вырезать непрерывные участки толщиной ~5 мкм и окрасить их HE для образцов тканей роговицы и внесорбитальных желез.
9. Статистический анализ
- Используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа данных.
- Выполните односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для анализа данных и тест на наименьшую значимую разницу (LSD) для сравнения между группами. Установите уровень статистической значимости на α = 0,05, где P < 0,05 указывает на статистическую значимость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистического анализа экспериментальных данных использовалось программное обеспечение SPSS 20.
- Выполните односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для анализа данных и тест на наименьшую значимую разницу (LSD) для сравнения между группами. Установите уровень статистической значимости на α = 0,05, где P < 0,05 указывает на статистическую значимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тест Ширмера I, SIT I
Объем слезы крыс измеряли на 0, 3, 5, 7, 11, 15 и 19 сутки после начала эксперимента. Результаты эксперимента показали, что слезная секреция группы скополамина (2,5 группа, 5 группа, 7,5 группа) по сравнению с контрольной группой (0 группа) была достоверно снижена, а разница была статистически значимой (р < 0,01). Статистической значимости между группами 2,5, 5 и 7,5 не было (P > 0,05). Статистически значимой разницы между разными группами по количеству дней не наблюдалось (Р > 0,05) (рис. 1, табл. 1).
Флуоресцеиновое окрашивание роговицы
Флуоресцеиновое окрашивание роговицы проводили на 0, 3, 5, 7, 11, 15 и 19 сутки эксперимента. Результаты показали, что ни в одной группе не было окрашивания роговицы флуоресцеином, что указывает на отсутствие явных дефектов эпителия роговицы во время 20-дневного эксперимента с различными концентрациями препаратов скополамина (рис. 2).
Патологоанатомический анализ эпителия роговицы
После эксперимента ткани роговицы у каждой крысы были собраны для HE-окрашивания, чтобы наблюдать за морфологией эпителия роговицы и измерять толщину эпителиального слоя роговицы. Эпителий роговицы контрольной группы состоял из 4-6 слоев упорядоченно расположенных эпителиальных клеток, среди которых базальный слой состоял из одного слоя столбчатых эпителиальных клеток, расположенных аккуратно и плотно. Эпителий роговицы скополаминовых групп 2,5, 5 и 7 был значительно тоньше, чем в контрольной группе, с уплощенной и атрофической морфологией клеток и неупорядоченной клеточной структурой. В группе 7,5 выявлена рыхлая межклеточная связь и вакуолярная структура в базальном слое (обозначена красной стрелкой на рисунке 3). По сравнению с эпителием роговицы скополаминовых групп, эпителий роговицы нормальной контрольной группы показал статистические различия в толщине эпителиального слоя роговицы (рис. 4).
Патологоанатомический анализ слезной железы
Основной железой для секреции слезы у крыс является наружно-слезная железа15. При наблюдении срезов слезной железы наблюдались изменения морфологии эпителиальных клеток слезной железы с повышением концентрации скополамина, сопровождающиеся воспалением и отеком тканей. В контрольной группе таких изменений не наблюдалось. Результаты патологии свидетельствуют о том, что воспалительные изменения слезной железы, отек клеток, атрофия клеток железистого эпителия могут быть использованы в качестве индикаторов функционального повреждения слезной железы16 (табл. 2). Эти показатели могут быть использованы для измерения степени выраженности синдрома сухого глаза по отношению к количеству слезной секреции (рис. 5).
Анализ результатов окрашивания конъюнктивы
Структура конъюнктивы в контрольной группе полная, в основном состоит из поверхностного слоя и собственной пластинки. Поверхностный слой представляет собой слоистые столбчатые эпителиальные клетки, гладкие и полные, с микроворсинками на поверхности клеток. Между эпителиальными клетками присутствовали рассеянные бокаловидные клетки, с большим объемом клеток и слизистыми гранулами в цитоплазме клетки. Поверхностный слой эпителия конъюнктивы в трех группах препаратов скополамина был значительно тоньше, количество микроворсинок и бокаловидных клеток было снижено, структура расположения клеток была неполной, сопровождалась отеком и небольшим количеством воспалительных клеток, что наблюдалось при окрашивании ПЭ (рис. 6).
При окрашивании конъюнктивы PAS было рассчитано среднее количество бокаловидных клеток на 40-кратное микроскопическое поле в трех независимых образцах каждой мыши, которое было выражено как среднее значение ± SD (рис. 7).
Рисунок 1: Статистика значения теста Ширмера в каждой группе (мм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Флуоресцеиновое натриевое окрашивание роговицы крысы. В 20-дневном эксперименте с флуоресцеином натрия не было обнаружено положительных результатов в роговице всех крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Окрашивание и измерение толщины эпителия роговицы. В группе 7,5 наблюдалась рыхлая межклеточная связь и вакуолярная структура в базальном слое (обозначены красной стрелкой) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Статистика толщины эпителия роговицы в каждой группе. По сравнению с эпителием роговицы скополаминовых групп, эпителий роговицы нормальной контрольной группы показал статистические различия в толщине эпителиального слоя роговицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Результаты ПЭ-окрашивания наружной слезной железы крыс. (А) Группа 0: В поле зрения слезные железы имели дольковую структуру и состояли из протоков и трубчатых желез, без явных аномалий в морфологии протоков, в то время как трубчатые железы состояли из конусообразных железистых клеток с обильным количеством слизистых веществ в цитоплазме, Нет явных отеков в соединительных тканях, нет явных аномалий в интерстициальных кровеносных сосудах, нет явного некроза и воспалительной клеточной инфильтрации. (Б) Группа 2.5: В поле зрения наблюдается периодическая атрофия эпителиальных клеток слезной железы с уменьшением объема, расширенными железистыми полостями неправильной формы и уменьшением количества муцинозного вещества в полости (отмечено красной стрелкой). Также наблюдается периодическая инфильтрация свободных лимфоцитов в строме (обозначена синей стрелкой), но явных аномалий в морфологии протоков или признаков отека не наблюдается. (C) Группа 5: В поле зрения клетки слезного эпителия иногда атрофировались и уменьшались в размерах, железистая полость была увеличена, слизистое вещество в полости было уменьшено (красная стрелка), а в строме иногда наблюдалась инфильтрация свободных лимфоцитов (синяя стрелка), и не наблюдалось явных аномалий в морфологии протоков или отека соединительной ткани между дольками слезной железы. (D) Группа 7.5: В поле зрения видны отеки; расстояние между слезными железами расширено, а расположение неравномерное (зеленая стрелка), эпителиальные клетки слезных желез часто атрофированы, объем становится меньше, а форма неправильная (желтая стрелка), изредка полость железы увеличивается, слизистое вещество в полости уменьшается (красная стрелка), изредка инфильтрируется свободный лимфоцит (синяя стрелка), без явных аномалий в морфологии протоков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: ОФ-окрашивание конъюнктивы крысы. По сравнению с эпителием конъюнктивы контрольной группы, все три группы эпителия конъюнктивы, обработанного скополамином, показали различную степень структурного повреждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: PAS-окрашивание конъюнктивы. (А) Крысы нормального контроля. (Б) крысы группы скополамина. (C) Плотность бокаловидных клеток в каждой группе (20x). Черная полоса = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Критерий Ширмера I, SIT(Среднее значение, единица измерения [мм]) | |||||||
| Группа | 0 дней | 3 дня | 5 дней | 7 дней | 11 дней | 15 дней | 19 дней |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Таблица 1: Тест Ширмера на крысах в четырех группах в разные моменты времени (мм). После применения медикаментов секреция слез у крыс значительно снизилась.
| Число | Некроз | Воспаление | Отёк | Атрофия эпителия |
| 0 Грп-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 грп -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 грп -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 грп -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 грп -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Грп -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 грп -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 грп -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 грп -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 грп -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 грп -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 грп -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Таблица 2: Патологическая тканевая оценка слезной железы крыс. Критерии оценки: 0: В нормальных условиях, с учетом таких факторов, как возраст животного, пол и штамм, ткань считается нормальной;
1: Наблюдаемые изменения только что превысили нормальный диапазон; 2: Поражения могут наблюдаться, но они еще не тяжелые; 3: Поражения очевидны и продолжают ухудшаться; 4: Поражения чрезвычайно тяжелые и затрагивают всю ткань16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Синдром сухого глаза с дефицитом водянистой жидкости (СДВГ) является важным типом синдрома сухого глаза, на долю которого приходится около 1/3 от общей популяции синдрома сухогоглаза17, и основной причиной СДВ является патологическое повреждение слезных желез и воспаление13. Для этого типа сухого глаза наиболее распространенными клиническими методами лечения являются искусственные слезы для облегчения симптомов или местное применение стероидов или циклоспорина18, в то время как вариантов лечения повреждения слезной железы немного. Поэтому очень важно изучить влияние реконструкции функции слезных желез на синдром сухого глаза и создать животную модель дисфункции слезных желез. Мы использовали метод многократного применения медикаментозного препарата для подавления секреции слезной железы у крыс и создали модель хронической дисфункции слезных желез при сухом глазе у животных.
Мы выбрали крыс для создания этой модели сухого глаза, которая имеет больше преимуществ по сравнению сдругими моделями животных. Например, кролики имеют больший размер тела и требуют больших доз лекарств или более частых инъекций для достижения желаемого эффекта. Тем более, что кролики стоят немного дороже, а значит, больше затрат на эксперимент. Мыши также широко используются в офтальмологических исследованиях, но обычно они используются для построения моделей синдрома Шегрена20. Эти модели фокусируются на сравнении воспаления органов и инфильтрации лимфоцитов для изучения иммунопатологических механизмов. Мыши имеют небольшие размеры тела, сложную анатомию слезных желез и низкую секрецию слезы, что затрудняет точное отражение выработки слезы. Модель крысы-животного является более подходящей моделью сухого глаза, поскольку она позволяет делать удобные инъекции лекарств, имеет относительно простые условия кормления, подходит как для клинических, так и для экспериментальных исследований, а также имеет преимущества с точки зрения стоимости. Это хорошая животная модель для ADDE.
Мы применили блокатор холинергических рецепторов скополамин для ингибирования холинергических рецепторов в организме крысы, снижая секрецию слезных желез и изменяя патологическую структуру клеток слезной железы, что принципиально моделирует состояние слезных желез у пациентов с синдромом сухого глаза. По сравнению с другими методами, такой подход лучше моделирует поврежденное состояние слезных желез в естественном состоянии. Другие методы, такие как использование глазных капель бензалкония хлорида21 или изменение внешних условий, таких как снижение влажности и увеличение испарения с поверхности глаза 4,8, только нарушают среду глазной поверхности и не изменяют функциональное состояние слезной железы. Поэтому они не подходят при длительной хронической сухости глаз.
При измерении объема секрета слез у крыс мы усовершенствовали тест-полоски Ширмера. Во-первых, мы разрезаем тест-полоску, используемую людьми, вдоль центральной линии. Затем мы обрезали верхушку в форме круглой дуги и аккуратно сложили ее вверху, чтобы облегчить введение в нижний конъюнктивальный мешок крысы. Следует отметить, что крысы активны, и трудно измерить слезы в течение 5 минут. После введения тест-полоски Ширмера в нижнюю конъюнктивальную сумку крысы мы вручную закрыли глаза крысы, чтобы повысить ее комфорт и избежать трудностей во время длительного измерения слез, которые могут повлиять на результаты измерения.
При извлечении слезной железы необходимо сначала найти ее. Точкой локализации слезной железы является середина между передней частью уха и внутренним кантусом. Затем обрежьте кожную ткань под мехом, сводя к минимуму попадание фрагментов меха и сокращая процесс обработки на более поздней стадии. В процессе извлечения также важно своевременно убирать фрагментированный мех. Особенно при отделении слезной железы используйте фосфатно-солевой буфер (PBS) или физиологический раствор для многократного промывания и избегайте смешивания с другими тканями, которые могут повлиять на результаты секционирования.
Преимущество разработанной модели синдрома сухого глаза заключается в том, что протокол коррелировал различные концентрации препарата с разной степенью повреждения слезных желез. Это дает экспериментальную базу для изучения лечения дисфункции слезных желез. Мы усовершенствовали некоторые операционные этапы в процессе моделирования, чтобы предоставить более подробные справочные материалы для исследователя. Кроме того, мы добавили индикаторы анализа для животной модели синдрома сухого глаза, включающие морфологические показатели роговицы, конъюнктивы и слезной железы, подсчет клеток конъюнктивы и оценку степени повреждения слезной железы. Мы оценивали функцию слезных желез на предмет воспаления, отека и атрофии. Мы выбрали наиболее полные, экономичные и точные методы анализа, отражающие степень сухости глаз и дисфункции слезных желез.
Однако наш метод также имеет определенные ограничения. Из-за длительного процесса построения моделей животных экспериментаторам необходимо делать инъекции неоднократно. Несмотря на то, что в настоящее время существуют некоторые методы, заменяющие ручные инъекции, такие как лекарственные помпы или трансдермальные пластыри, все еще существуют некоторые сложности в их использовании. Как применять более эффективные методы, чтобы снизить частоту приема лекарств, избежать возникновения осложнений и обеспечить точность дозировки – наша следующая цель. В заключение, мы усовершенствовали модель синдрома сухого глаза у животных, вызванного инъекцией скополамина, обеспечив экспериментальную основу для исследований дисфункции слезных желез при СДВГ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов отсутствуют потенциальные конфликты интересов, связанные с препаратами и материалами, используемыми в данной процедуре.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Гуандунским провинциальным центром клинических ключевых специальностей высокого уровня (SZGSP014) и Шэньчжэньским фондом естественных наук (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
