Summary
Här etablerar vi en råttmodell av tårkörteldysfunktion för att ge en grund för studier av torra ögon med vattenbrist.
Abstract
Torra ögon med vattenbrist (ADDE) är en typ av sjukdom med torra ögon som kan leda till minskad mängd och kvalitet på tårsekretionen. Långvarig onormal tårproduktion kan leda till en störning i ögats ytmiljö, inklusive hornhinneskador och inflammation. I allvarliga fall kan ADDE orsaka synförlust eller till och med blindhet. För närvarande är behandling av torra ögon begränsad till ögondroppar eller sjukgymnastik, som endast kan lindra symtom på obehag i ögonen och inte i grunden kan bota torra ögonsyndrom. För att återställa tårkörtelns funktion vid torra ögon har vi skapat en djurmodell av tårkörteldysfunktion hos råttor inducerad av skopolamin. Genom den omfattande utvärderingen av tårkörteln, hornhinnorna, bindhinnan och andra faktorer strävar vi efter att ge en fullständig förståelse för de patologiska förändringarna av ADDE. Jämfört med den nuvarande modellen med torra ögon och mus innehåller denna ADDE-djurmodell en funktionell utvärdering av tårkörteln, vilket ger en bättre plattform för att studera tårkörteldysfunktion vid ADDE.
Introduction
År 2021 är cirka 12 % av alla människor kraftigt drabbade av torra ögon1, vilket gör det till en av de vanligaste kroniska ögonsjukdomarna. Torra ögon kan delas in i två typer: torra ögon med vattenbrist (ADDE) och torra ögon (EDE)2, beroende på de olika faktorer som påverkar sjukdomen. ADDE delas vidare in i Sjögrens syndrom (SS) och icke-SS, men majoriteten av patienterna med torra ögon är icke-SS-patienter i klinisk3. Kroniska symtom på torra ögon påverkar allvarligt synkvaliteten hos patienterna. För närvarande innebär den konventionella behandlingen av DED applicering av konstgjorda tårar för att smörja ögonytan och sjukgymnastik av ögonlocken. Men torra ögonsyndrom kanske inte erbjuder ett fullständigt botemedel i många fall. Att studera patogenesen för torra ögon är därför avgörande för utvecklingen av nya terapier och läkemedel. Djurmodeller av torra ögonsyndrom ger en grund för vidare forskning.
Det finns många sätt att konstruera djurmodeller av torra ögonsyndrom4, inklusive att ändra tårsekretionsnivåerna genom att ändra hormonnivåerna. Till exempel kan avlägsnande av testiklarna från råttor minska androgensekretionen, öka tårsekretionen och minska koncentrationen av fri sekretorisk komponent (SC) och IgA i tårar 5,6. En annan metod är att indikera autoimmuna reaktioner i tårkörteln genom att ta bort ögonytans nerver som styr körteln. Dessutom kan en direkt minskning av tårsekretionen uppnås genom att kirurgiskt ta bort tårkörteln7. Förändrade miljöförhållanden kan också påskynda tåravdunstningen. Till exempel kan odling av djur i låg luftfuktighet och torra ventilationsförhållanden etablera en modell för överdriven avdunstningstorrhet8, som kan kombineras med andra metoder för att öka svårighetsgraden av torra ögon. De viktigaste läkemedlen som används för att inducera torra ögon experimentella modeller är atropin och skopolamin9. Som parasympatiska hämmare kan båda inducera farmakologisk blockad av kolinerga (muskariniska) receptorer i tårkörteln och hämma tårsekretionen. Jämfört med torra ögon orsakade av atropinmuskelinjektion10 har skopolamin en starkare hämmande effekt på sekretionskörtlarna, en längre varaktighet av läkemedelsverkan och svagare effekter på hjärt-, tunntarms- och bronkialglatt muskulatur. Det är ett av de mest mogna läkemedlen för djurmodeller med torra ögon.
Olika metoder kan användas för att inducera torra ögon med skopolamin, såsom subkutan injektion, läkemedelspump eller plåsterapplicering 4,11,12. För att minska frekvensen av läkemedelsadministrering till försöksdjur applicerar många forskare depotplåster på svansen på möss eller använder läkemedelspumpar. Båda dessa metoder har dock begränsningar. Till exempel måste absorptionen av depotplåster ta hänsyn till den individuella absorptionen av möss, vilket kan leda till inkonsekvent läkemedelsdosering. Även om läkemedelspumpar exakt kan kontrollera doseringen av varje administrering, är de inte alltid kompatibla med läkemedlet som levereras eller koncentrationen som används. De måste också placeras kirurgiskt – vilket är mer invasivt för djuret, vilket kräver en bedövningshändelse, och det finns risk för postoperativa komplikationer som dehiscence. Subkutan injektion, även om det är mer besvärligt, kan säkerställa korrekt dosering för varje administrering och upprätthålla konsekvens i läkemedelsadministrering mellan olika råttor. Samtidigt har den en lägre kostnad och är lämplig för att utföra ett stort antal djurförsök.
Denna studie tillämpar upprepad subkutan injektion av skopolamin för att fastställa en råttmodell med torra ögon. Vi analyserar indikatorer på torra ögon som hornhinnedefekter, tårsekretionsnivåer och patologisk morfologi hos hornhinnan, bindhinnan och tårkörteln. Genom att kombinera läkemedelskoncentration, patologiska manifestationer och torra ögon-symtom vidareutvecklar vi råttmodellen med torra ögon i detalj, vilket ger mer exakta experimentella data för studier av behandling av torra ögon och patologiska mekanismer. Vi beskriver också modelleringsprocessen i detalj för framtida forskare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som utförs enligt detta protokoll utförs under godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Beredning av djur
- Förbered 12 friska 6 veckor gamla SPF Wistar-honråttor som väger 160 g ± 20 g.
- Använd en spaltlampa och ett oftalmoskop för att undersöka ögonförhållandena hos alla råttor och se till att det inte finns några främre segment- eller näthinnesjukdomar.
- Föd upp alla råttor i 1 vecka med tillräckligt med mat och vattenkällor.
- Slumpmässigt delades alla råttor in i normala, skopolaminläkemedelskoncentration 2,5 mg/ml, skopolaminläkemedelskoncentration 5 mg/ml och skopolaminläkemedelskoncentration 7,5 mg/ml, med tre djur i varje grupp.
2. Beredning av lösningen
- Bered skopolaminhydrobromid genom att lösa upp den i 0,9 % natriumkloridlösning för att göra en lösning med koncentrationer på 7,5 mg/ml, 5 mg/ml och 2,5 mg/ml.
- Bered en 0,9 % natriumkloridlösning utan skopolaminhydrobromid som ska användas som injektion för kontrollgruppen av råttor.
3. Förberedelse av utrustning och material
- Förbered ett mikroskop för smådjur.
- Förbered material för experimentet, inklusive 1 ml engångsspruta med nål (26 G); fluorescein natriumoftalmiska remsor; Schirmer rivteststicka; absolut etanol; 4% paraformaldehyd; xylen; neutral balsam; hematoxylin, eosin; och periodisk syra-Schiff-färgningssats.
4. Subkutan injektion
OBS: Denna procedur kräver hjälp från en andra person för att hjälpa till att säkra råttorna.
- Håll råttans kropp stadigt och fånga och sträck ut dess vänstra (eller högra) bakben.
OBS: En assistent kan hjälpa till att hålla djuret. - Rengör injektionsstället med alkohol.
- Stick in 1 ml engångsspruta med nål (26 G) vid basen av hudvecket mellan tummen och fingret.
- Aspirera sprutan genom att dra tillbaka sprutkolven. Allt blod i sprutan tyder på felaktig nålplacering. Ta bort och placera om nålen.
- Administrera 0,9 % natriumkloridlösning med eller utan skopolaminhydrobromid i en jämn, flytande rörelse.
- Injicera alla råttor enligt olika koncentrationer, med 0,5 ml injicerat varje gång och fyra gånger dagligen (kl. 9:00, 12:00, 15:00 och 18:00) under en sammanhängande period av 19 dagar, omväxlande mellan vänster och höger extremitet.
OBS: Grupperna namnges enligt följande:
Grupp utan skopolaminhydrobromid: 0 grupp (kontroll)
Grupp med skopolaminhydrobromid 2,5 mg/ml: 2,5 grupp
Grupp med skopolaminhydrobromid 5 mg/ml: grupp 5
Grupp med skopolaminhydrobromid 7,5 mg/ml: 7,5 grupp - Sätt tillbaka djuret i buren och övervaka andning och beteende i 5-10 minuter.
5. Rivsekretionstest (Schirmer-rivtest, STT)
- Skapa en modifierad filterpappersremsa för råttor11. Klipp hälften av filterpappersremsan som används för människor längs mittlinjen (1 mm × 15 mm) och trimma huvudet på remsan så att den blir slät.
OBS: Innan du utför tårsekrettestet, håll fast råttans kropp manuellt för att förhindra rörelse och säkerställa exponering av råttans ögon. - Placera filterpappersremsan på den yttre 1/3 av råttans nedre ögonlockssäck.
- Tidsbegränsa testet till 5 min. Kontrollera stängningen av råttans ögon under hela proceduren.
- Efter mätning, använd en pincett för att klämma fast filterpappersremsan i ett mikrocentrifugrör och registrera rivvolymen genom att göra ett märke på rörets vägg.
- Mät tårsekretionen på dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 och dag 19.
6. Fluoresceinfärgning av hornhinnan
- Droppa 0,5 μL 0,5 % fluoresceinnatriumlösning i den nedre bindhinnesäcken hos varje råtta.
- Observera hornhinnan under blått ljus i 3 minuter efter fluoresceinstillation.
- Registrera fluorescensfärgningen av varje råttas hornhinna och observera om det finns en hornhinnedefekt.
- Utför hornhinnans fluoresceinfärgning på dag 0, dag 1, dag 3, dag 5, dag 7, dag 11, dag 15 och dag 19.
7. Histologisk observation av bindhinnevävnad
- Efter avslutad modellutveckling, bedöva råttorna djupt med en intraperitoneal injektion av 0,4 ml/100 g 10% vattenhaltigt kloralhydrat för att lindra djurens spänningar. Avliva sedan råttorna genom livmoderhalsluxation.
- Ta den bullära bindhinnan från samma områden hos varje råtta, med en storlek på cirka 2 mm x 2 mm.
- Fixera vävnaderna omedelbart i 4% paraformaldehyd i 24 timmar och bädda in i paraffin13.
- Skär 5 μm tjocka sektioner och färga med hematoxylin och eosin (HE)14 och periodisk syra-Schiff (PAS) fläck (följ tillverkarens instruktioner).
8. Histologisk observation av hornhinne- och tårkörtelvävnad
- Efter att ha slutfört modellutvecklingen, avliva råttan enligt beskrivningen i steg 7.1.
- Ta hornhinnan på höger sida av varje råtta och fixera den omedelbart i 4% paraformaldehydlösning.
- Skär av cefalisk epidermis och subkutan vävnad längs linjen som förbinder örat och den yttre ögonvrån, expandera snittet till båda sidor och isolera den gulaktiga extra orbitalkörteln ytterligare.
- Ta bort råttans päls noggrant och separera extraorbitalkörteln med 0,9 % natriumkloridlösning.
- Placera de isolerade extraorbitala körtlarna i 4 % paraformaldehydlösning i 24 timmar och bädda in i paraffin.
- Skär kontinuerliga sektioner med ~5 μm tjocklek och färga dem med HE för vävnadsprover från hornhinnan och extraorbitalkörteln.
9. Statistisk analys
- Använda lämplig programvara för statistisk analys av data.
- Utför envägsanalys av varians (ANOVA) för att analysera data och det minsta signifikanta differenstestet (LSD) för jämförelse mellan grupper. Ange den statistiska signifikansnivån till α = 0,05, där P < 0,05 anger statistisk signifikans.
OBS: Programvaran SPSS 20 användes för statistisk analys av experimentella data.
- Utför envägsanalys av varians (ANOVA) för att analysera data och det minsta signifikanta differenstestet (LSD) för jämförelse mellan grupper. Ange den statistiska signifikansnivån till α = 0,05, där P < 0,05 anger statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schirmer I-testet, SIT I
Råttornas tårvolym mättes dag 0, 3, 5, 7, 11, 15 och 19 efter experimentets start. De experimentella resultaten visade att tårsekretionen i skopolamingruppen (2,5-gruppen, 5-gruppen, 7,5-gruppen), jämfört med kontrollgruppen (0-gruppen), minskade signifikant och skillnaden var statistiskt signifikant (P < 0,01). Det fanns ingen statistisk signifikans mellan 2,5-gruppen, 5-gruppen och 7,5-gruppen (P > 0,05). Det observerades ingen signifikant skillnad mellan de olika grupperna när det gäller antalet dagar (P > 0,05) (Figur 1, Tabell 1).
Fluoresceinfärgning av hornhinnan
Fluoresceinfärgning av hornhinnan utfördes på dag 0, 3, 5, 7, 11, 15 och 19 av experimentet. Resultaten visade att det inte fanns någon hornhinnefluoresceinfärgning i någon grupp, vilket tyder på att inga uppenbara hornhinneepiteldefekter bildades under det 20 dagar långa experimentet med olika koncentrationer av skopolaminläkemedel (Figur 2).
Patologisk analys av hornhinneepitel
Efter experimentet samlades hornhinnevävnader från varje råtta in för HE-färgning för att observera hornhinneepitelets morfologi och mäta tjockleken på hornhinnans epitelskikt. Kontrollgruppens hornhinneepitel bestod av 4-6 lager av ordnade epitelceller, bland vilka basalskiktet bestod av ett enda lager av kolumnepitelceller arrangerade snyggt och tätt. Hornhinneepitelet i skopolamingrupperna 2,5, 5 och 7 var signifikant tunnare än kontrollgruppen, med tillplattad och atrofisk cellmorfologi och oordnad cellstruktur. I grupp 7.5 fanns en lös intercellulär förbindelse och vakuolär struktur i basalskiktet (indikeras av den röda pilen i figur 3). Jämfört med hornhinneepitelet i skopolamingrupperna uppvisade hornhinneepitelet i den normala kontrollgruppen statistiska skillnader i tjockleken på hornhinneepitelskiktet (figur 4).
Patologisk analys av tårkörteln
Den huvudsakliga körteln för tårsekretion hos råttor är den extrorbitala tårkörteln15. Vid observation av tårkörtelskivor observerades förändringar i morfologin hos tårkörtelepitelcellerna med ökad skopolaminkoncentration, åtföljd av inflammation och vävnadsödem. Inga sådana förändringar observerades i kontrollgruppen. Patologiresultaten tyder på att inflammatoriska förändringar i tårkörteln, cellödem och atrofi av körtelepitelcellerna kan användas som indikatorer för funktionell skada på tårkörteln16 (tabell 2). Dessa indikatorer kan användas för att mäta graden av torra ögon i förhållande till mängden tårsekret (Figur 5).
Analys av konjunktival färgningsresultat
Strukturen av bindhinnan i kontrollgruppen är komplett, huvudsakligen bestående av ytskiktet och lamina propria. Ytskiktet består av laminerade kolonnepitelceller, släta och kompletta, med mikrovilli på cellytan. Spridda bägarceller fanns mellan epitelcellerna, med stor cellvolym och slemkorn i cellcytoplasman. Ytskiktet av konjunktivalepitelet i de tre skopolaminläkemedelsgrupperna var signifikant tunnare, antalet mikrovilli- och bägarceller var reducerade, cellarrangemangsstrukturen var ofullständig, åtföljd av ödem, och en liten mängd inflammatoriska celler som observerats vid HE-färgning (Figur 6).
Genom att färga bindhinnan med PAS beräknades det genomsnittliga antalet bägarceller per 40x mikroskopiskt fält i tre oberoende prover av varje mus och uttrycktes som medelvärde ± SD (Figur 7).
Figur 1: Statistik för Schirmer-testvärdet i varje grupp (mm) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fluoresceinnatriumfärgning av hornhinnan på råtta. I 20-dagarsförsöket med fluoresceinnatrium observerades inga positiva fynd i hornhinnorna hos alla råttor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Färgning och tjocklek av hornhinneepitel. I grupp 7.5 fanns det lös intercellulär anslutning och vakuolär struktur i basalskiktet (indikeras av den röda pilen) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Statistik över hornhinnans epiteltjocklek i varje grupp. Jämfört med hornhinneepitelet i skopolamingrupperna uppvisade hornhinneepitelet i den normala kontrollgruppen statistiska skillnader i tjockleken på hornhinneepitelskiktet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: HE-färgningsresultat av den extrorbitala tårkörteln hos råttor. (A) Grupp 0: I synfältet uppvisade tårkörtlarna lobulär struktur och bestod av kanaler och rörformiga körtlar, utan några uppenbara avvikelser i kanalernas morfologi, medan de rörformiga körtlarna bestod av konformade körtelceller med rikligt med slemämnen i cytoplasman. Inget uppenbart ödem i bindväv, inga uppenbara abnormiteter i interstitiella blodkärl och ingen uppenbar nekros och inflammatorisk cellinfiltration. (B) Grupp 2.5: I synfältet observeras tillfällig atrofi av tårkörtelepitelcellerna, med minskad volym, oregelbundet formade vidgade körtelhåligheter och minskad slemhinna i kaviteten (indikeras av den röda pilen). Det förekommer också tillfällig infiltration av fria lymfocyter i stromat (indikeras av den blå pilen), men inga uppenbara avvikelser i kanalmorfologin eller tecken på ödem observeras. (C) Grupp 5: I synfältet förtvinade tårepitelcellerna ibland och minskade i storlek, körtelhålan förstorades, slemsubstansen i kaviteten reducerades (röd pil) och fri lymfocytinfiltration observerades ibland i stromat (blå pil), och inga uppenbara avvikelser i kanalmorfologi eller bindvävsödem mellan tårkörtellober observerades. D) Grupp 7.5: Ödem kan ses i synfältet. avståndet mellan tårkörtlarna vidgas och arrangemanget är oregelbundet (grön pil), epitelcellerna i tårkörtlarna är ofta förtvinade, volymen blir mindre och formen är oregelbunden (gul pil), ibland förstoras körtelhålan, slemhinnan i hålrummet reduceras (röd pil), ibland infiltreras den fria lymfocyten (blå pil), utan några uppenbara avvikelser i kanalmorfologi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: HE-färgning av råttans bindhinna. Jämfört med kontrollgruppens konjunktivalepitel uppvisade alla tre grupperna av skopolaminmedicinerat konjunktivalepitel varierande grad av strukturell skada. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: PAS-färgning av bindhinnan. (A) Normala kontrollråttor. B) Råttor från skopolamingruppen. (C) Bägarcelltäthet i varje grupp (20x). Svart stapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Schirmer I-test, SIT(Medelvärde, enhet [mm]) | |||||||
| Grupp | 0 dagar | 3 dagar | 5 dagar | 7 dagar | 11 dagar | 15 dagar | 19 dagar |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabell 1: Schirmer-test av råttor i de fyra grupperna vid olika tidpunkter (mm). Efter medicinering minskade utsöndringen av tårar hos råttor avsevärt.
| Nummer | Nekros | Inflammation | Ödem | Epitelial atrofi |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2,5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7,5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7,5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7,5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabell 2: Patologisk vävnadspoäng för tårkörteln hos råtta. Poängkriterier: 0: Under normala förhållanden, med hänsyn till faktorer som djurets ålder, kön och stam, anses vävnaden vara normal;
1: De observerade förändringarna har precis överskridit det normala intervallet; 2: Lesioner kan observeras, men de är ännu inte allvarliga; 3: Lesioner är uppenbara och fortsätter att förvärras; 4: Lesionerna är extremt allvarliga och har påverkat hela vävnaden16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Torra ögon med vattenbrist (ADDE) är en viktig typ av torra ögon som står för cirka 1/3 av den totala populationen av torra ögon17, och den främsta orsaken till ADDE är patologisk skada och inflammation i tårkörtlarna13. För denna typ av torra ögon är de vanligaste kliniska behandlingsmetoderna konstgjorda tårar för att lindra symtom eller lokal applicering av steroider eller ciklosporin18, medan det finns få behandlingsalternativ för skador på tårkörteln. Därför är det mycket viktigt att undersöka effekten av rekonstruktion av tårkörtelfunktionen på torra ögon och etablera en djurmodell av tårkörteldysfunktion. Vi använde en metod för upprepad applicering av läkemedel för att undertrycka utsöndringen av tårkörteln hos råttor och skapade en djurmodell för torr ögonsjukdom med kronisk tårkörteldysfunktion.
Vi valde råttor för att konstruera denna modell av torra ögon, som har fler fördelar jämfört med andra djurmodeller19. Kaniner har till exempel en större kroppsstorlek och kräver fler doser av läkemedel eller mer frekventa injektioner för att uppnå önskad effekt. Dessutom är kaniner något dyrare, vilket innebär högre kostnader för experimentet. Möss används också ofta inom oftalmologisk forskning, men de används i allmänhet för att konstruera Sjögrens syndrommodeller 20. Dessa modeller fokuserar på att jämföra organinflammation och lymfocytinfiltration för att utforska de immunpatologiska mekanismerna. Möss har små kroppsstorlekar, komplex tårkörtelanatomi och låg tårsekretion, vilket gör det svårt att korrekt återspegla tårproduktionen. Råttdjursmodellen är en mer lämplig modell för torra ögon eftersom den möjliggör bekväma läkemedelsinjektioner, har relativt enkla utfodringsförhållanden, är lämplig för både kliniska och experimentella studier och även har fördelar när det gäller kostnad. Det är en bra djurmodell för ADDE.
Vi applicerade den kolinerga receptorblockeraren skopolamin för att hämma de kolinerga receptorerna i råttans kropp, vilket minskade utsöndringen av tårkörtlarna och förändrade den patologiska strukturen hos tårkörtelcellerna, vilket i grunden simulerar tillståndet hos tårkörtlarna hos patienter med torra ögon. Jämfört med andra metoder simulerar detta tillvägagångssätt bättre det skadade tillståndet hos tårkörtlarna i ett naturligt tillstånd. Andra metoder, t.ex. användning av ögondroppar av bensalkoniumklorid21 eller ändring av yttre förhållanden, t.ex. minskning av luftfuktighet och ökad avdunstning av ögonytan 4,8, stör endast miljön på ögats yta och förändrar inte tårkörtelns funktionella tillstånd. Därför är de inte lämpliga för långvariga, kroniska torra ögon.
Genom att mäta utsöndringsvolymen av tårar hos råttor förbättrade vi Schirmers tårtestremsor. Först klippte vi av rivtestremsan som används av människor längs mittlinjen. Sedan trimmade vi toppen till en rund bågform och vek försiktigt tillbaka den upptill för att underlätta enkel insättning i råttans nedre konjunktivalsäck. Det bör noteras att råttor är aktiva och svåra att mäta tårar i 5 minuter. Efter att ha satt in Schirmers tårteststicka i råttans nedre bindhinnesäck stängde vi råttans ögon manuellt för att öka deras komfort och undvika att kämpa under den långa mätningen av tårar, vilket kan påverka mätresultaten.
När du extraherar tårkörteln är det nödvändigt att först lokalisera den. Punkten för tårkörtellokalisering är mittpunkten mellan framsidan av örat och den inre kantusen. Klipp sedan av hudvävnaden under pälsen, minimera inträdet av fragmenterad päls och minska hanteringsprocessen i det senare skedet. Under extraktionsprocessen är det också viktigt att städa upp den fragmenterade pälsen i tid. Speciellt när du separerar tårkörteln, använd fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) eller saltlösning för att upprepade gånger skölja och undvik blandning med andra vävnader som kan påverka snittresultatet.
Fördelen med den utvecklade djurmodellen för torra ögon är att protokollet korrelerade olika läkemedelskoncentrationer med olika grader av tårkörtelskada. Detta ger en experimentell grund för studier av behandling av tårkörteldysfunktion. Vi har förfinat några av de operativa stegen i modelleringsprocessen för att tillhandahålla mer detaljerat referensmaterial för en forskare. Dessutom har vi lagt till analysindikatorer för djurmodellen med torra ögon, som innehåller morfologiska indikatorer för hornhinnan, bindhinnan och tårkörteln, räknar konjunktivalceller och poängsätter graden av tårkörtelskada. Vi utvärderade tårkörtelns funktion från inflammation, ödem och atrofi. Vi har valt de mest omfattande, kostnadseffektiva och noggranna analysmetoderna för att återspegla graden av torra ögon och tårkörteldysfunktion.
Men vår metod har också vissa begränsningar. På grund av den långa processen att konstruera djurmodeller måste försöksledare injicera upprepade gånger. Även om det för närvarande finns vissa metoder för att ersätta manuella injektioner, såsom läkemedelspumpar eller depotplåster, finns det fortfarande vissa komplikationer vid användningen. Hur man tillämpar bättre metoder för att minska frekvensen av medicinering, undvika uppkomsten av komplikationer och säkerställa noggrannheten i doseringen är vårt nästa mål. Sammanfattningsvis har vi förbättrat en djurmodell för torra ögon orsakad av skopolamininjektion, vilket ger en experimentell grund för forskning om tårkörteldysfunktion vid ADDE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga potentiella intressekonflikter relaterade till de läkemedel och material som används i denna procedur.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) och Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
